ε-聚賴氨酸微生物生產(chǎn)及其應用研究進展

莊孝東?白森萌?李博彥?胡翠英?王靖?英曉莉　鞠鑫　扶教龍　李良智

摘要：ε-聚賴氨酸是一種同聚酰胺生物聚合物，由25～35個L-賴氨酸殘基通過α-羧基和ε-氨基縮合形成的酰胺鍵連接而成。因其獨特的結構，ε-聚賴氨酸具有許多優(yōu)異的性能，如可食性、水溶性、熱穩(wěn)定性、可降解性、廣譜抗菌活性和無毒性等。因此，ε-聚賴氨酸已在日本、韓國、美國和中國等國家被廣泛用作食品防腐劑。目前，ε-聚賴氨酸主要由白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)。自ε-聚賴氨酸于1977年由日本學者發(fā)現(xiàn)以來，ε-聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)得到了很大提高，對其應用研究也由最初的食品領域拓展到了許多其他的領域。本文首先概述了ε-聚賴氨酸生物合成機理、菌種選育和發(fā)酵生產(chǎn)策略，在簡要介紹其抑菌機制基礎上，著重介紹了ε-聚賴氨酸在食品、醫(yī)學和材料等領域應用研究進展，最后，對相關研究進行了展望，以期為ε-聚賴氨酸微生物生產(chǎn)及其應用研究提供有益的借鑒。

關鍵詞：ε-聚賴氨酸；微生物生產(chǎn)；抗菌機制；應用研究；白色鏈霉菌

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Recent advances in microbial production of ε-poly-L-lysine and its applications

Zhuang Xiaodong， Bai Senmeng， Li Boyan， Hu Cuiying， Wang Jing， Ying Xiaoli， Ju Xin， Fu Jiaolong， and Li Liangzhi

（College of Chemical and Life Sciences， Suzhou University of Science and Technology， Suzhou 215009）

Abstract ε-poly-L-lysine （ε-PL） is a natural homo-polyamide biopolymer consisting of 25-35 L-lysine residues with the amide linkages formed between the ε-amino and α-carboxyl groups. Due to its unique structure， ?-PL has many excellent properties， such as edibility， water solubility， thermostability， biodegradability， broad-spectrum antibacterial activity， and nontoxicity. Therefore， ε-PL has been widely used as a food preservative in Japan， Korea， the United States， China， and other countries. At present， ε-PL is mainly produced by the aerobic fermentation of Streptomyces albulus. Since ε-PL was discovered by Japanese scholars in 1977， the fermentation production of ε-PL has been greatly improved， and the application of ε-PL has also expanded from the initial food field to many other fields. This paper firstly outlined the biosynthesis mechanism， strain selection， and fermentation production strategy of ε-PL， and highlighted the progress of research on ε-PL in food， medical and material applications based on its bacterial inhibition mechanism. Finally， an outlook on related research is given to provide a useful reference for the microbial production of ε-PL and its application research.

Key words ε-poly-L-lysine; Microbial production; Antibacterial mechanism; Application; Streptomyces albulus

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine， ε-PL）是由25-35個L-賴氨酸殘基通過α-羧基與ε-氨基縮合形成的一種陽離子多肽聚合物[1]。ε-PL是一種微苦、易吸潮的淡黃色的天然生物聚合物，可以被人體完全消化為賴氨酸。由于其獨特的結構，ε-PL具有多種優(yōu)異的性能，如水溶性、生物降解性、可食性、耐熱性和對環(huán)境無毒性等[2-3]。ε-PL對很多革蘭陰性和革蘭陽性菌具有明顯的抑制作用，如金黃色葡萄球菌、真菌、酵母菌和某些病毒等[4-5]，因此，ε-PL被廣泛用作天然食品防腐劑，使用過程中往往復合多種抗菌劑來提高抗菌效果[6]。自1989年日本首次批準ε-PL用作食品防腐劑后，還有美國、韓國、中國和其他一些國家也紛紛獲批準使用[7]，且ε-PL還應用于醫(yī)學、材料和農(nóng)業(yè)等其他領域[8]。

1977年，日本學者Shima等[9]在白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）發(fā)酵液中首次發(fā)現(xiàn)ε-PL。ε-PL一般是通過白色鏈霉菌的好氧發(fā)酵法進行生產(chǎn)，但野生型菌株合成ε-PL的能力通常較低，必須對ε-PL產(chǎn)生菌進行育種改造。最經(jīng)典的，要數(shù)日本科學家Hiraki等[10]于1998年采用“S-2-（氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC）+甘氨酸（Gly）”抗性篩選結合誘變方法選育出了一株“AECr+Glyr”誘變株S. albulus 11011A，其ε-PL產(chǎn)量達到2.11 g/L，為野生菌產(chǎn)量的10倍。為了早日實現(xiàn)ε-PL的大規(guī)模生產(chǎn)，研究者們在發(fā)酵生產(chǎn)工藝上更深入研究。自2001年Kahar等[11]首次建立兩階段pH調控策略（ε-PL產(chǎn)量為48.3 g/L）以來，對ε-PL發(fā)酵工藝的研究更多了，如培養(yǎng)基的優(yōu)化、pH的控制、溶解氧（DO）的控制等策略。

本文首先簡要介紹ε-PL生物合成機理、微生物育種和發(fā)酵生產(chǎn)工藝進展，在簡要概述了其抑菌機制的基礎上，著重介紹了近年來ε-PL在食品、材料、醫(yī)學等各個領域的最新應用研究進展。最后對ε-PL應用研究及相關研究進行了展望。期望本文能為有關科研人員提供一定的幫助和參考，同時也為進一步拓展ε-PL應用范圍提供借鑒。

1 ε-聚賴氨酸生物合成途徑與機理

自?-PL發(fā)現(xiàn)以來，其生物合成機理一直被廣大研究人員所關注。作為?-PL的前體，L-賴氨酸是通過二氨基庚二酸途徑（DAP）合成，最終由ε-PL合成酶（Pls）聚合形成?-PL。Hamano等[12]發(fā)現(xiàn)白色鏈霉菌在表達天門冬氨酸激酶后，細菌對L-賴氨酸的耐受性顯著提高。因此，推測ε-PL的合成可能是先通過糖酵解途徑（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）途徑合成草酰乙酸，草酰乙酸被催化成L-天冬酰胺。接著，L-天冬酰胺被天門冬氨酸激酶和天冬氨酸-β-半醛脫氫酶通過二氨基庚二酸途徑轉化為L-賴氨酸。最后，在ε-PL合成酶（Pls）的催化下，L-賴氨酸聚合形成ε-PL。

Yamanaka等[13]從白色鏈霉菌中分離并鑒定了Pls，Pls是一種非核糖體肽合成酶（NRPSs），含有1319個氨基酸。如圖1所示，與傳統(tǒng)NRPSs相比，Pls是一個典型的具有腺苷化結構域（A結構域）和硫代化結構域（T結構域）的NRPSs，不包含縮合域（C結構域）和硫酯酶域（TE結構域），但是它有6個跨膜結構域（TM1-TM6）和3個在C端的串聯(lián)可溶性結構域（C1-C3）。有研究學者基于Pls的結構，推測其催化機理并進行實驗驗證[14-15]。首先，A結構域借助ATP將離散的L-賴氨酸進行腺苷?；浯?，T結構域對其硫醇化，分子延伸部分由3個可溶性結構域（C1-C3）與6個跨膜結構域（TM1-TM6）來完成，最后產(chǎn)生一個L-賴氨酸二聚體，L-賴氨酸二聚體進一步發(fā)生聚合反應，生成一系列具有多鏈長的ε-聚賴氨酸。另外有研究表明[16]，Pls與聚L-二氨基丙酸（PDAPs）的合成酶具有類似的結構域，這種單獨模塊NRPS結構有可能是這類同聚氨基酸合成酶的共同特征。ε-PL的生物合成和聚合程度可以直接由Pls控制，細胞內(nèi)ATP影響Pls的活性，且聚合度的大小與抑菌的活性密切相關，通常微生物產(chǎn)生的ε-聚賴氨酸的聚合度在25～35，當其聚合度大于9時便具有明顯的抑菌性能，即理論上講，根據(jù)人們的需求對其聚合度進行選擇性地調控就能制造出有益的抗菌衍生產(chǎn)品[17]。

此外，ε-PL產(chǎn)生菌能夠分泌ε-PL降解酶（Pld），Yamanaka等[18]發(fā)現(xiàn)白色鏈霉菌中存在另一種具有內(nèi)源性肽酶活性的Pld（PldII），理論上講，敲除plds基因可以減少ε-PL的降解，提高ε-PL的產(chǎn)量。Li等[19]基于pSET152的整合質粒CRISPRI系統(tǒng)對ε-PL降解酶（pldII）進行轉錄抑制，通過改變dCas9的識別位點來調節(jié)pldII的表達，抑菌實驗發(fā)現(xiàn)pldII的抑制提高了ε-PL產(chǎn)物的抗菌效果。然而，研究發(fā)現(xiàn)plds基因的敲除對ε-PL的產(chǎn)生和聚合程度沒有直接影響，這表明Pld不參與ε-PL的生物合成和聚合物長度的調控，因此，ε-PL的生物合成主要受Pls的作用。目前，關于Pls和Pld的結構和功能已有不少研究，但ε-PL生物合成機制的框架還需進一步完善。

2 ε-聚賴氨酸生產(chǎn)菌育種

2.1 誘變育種

野生菌株在發(fā)酵過程中ε-PL產(chǎn)量往往較低，不能夠滿足工業(yè)上的需求，為了提高ε-PL的產(chǎn)量，不少研究集中在改良?-PL產(chǎn)生菌上。日本學者Hiraki

等[10]最早通過AEC抗性選育方法，獲得一株突變菌株S. albulus 11011A，其ε-PL產(chǎn)量為2.11 g/L，是野生菌的10倍。其后大多的育種方法都是基于此進行改良，如傳統(tǒng)的物理化學誘變、核糖體工程、基因組重排以及基因工程等方法，都被用作ε-PL高產(chǎn)菌的選育。

物理化學誘變是指用物理或者化學的方法以誘發(fā)遺傳物質的突變，從而引起細胞形態(tài)特征的變異，來獲得高產(chǎn)菌株。如常壓室溫等離子體（ARTP）誘變，該法是現(xiàn)階段較為先進的物理誘變方法，其優(yōu)點是突變效率高、適用范圍廣[22]。Xiang等[23]通過ARTP誘變結合抗性平板與抑菌圈篩選得到了突變菌株S. albulus SAR 14-116，搖瓶產(chǎn)量為1.04 g/L，較初始菌株提高了18.46%?；瘜W誘變?nèi)鐟枚喾N誘變劑的方法，Song等[24]采用NTG（亞硝基胍）+UV（紫外）+LiCl（氯化鋰）復合突變，得到了高產(chǎn)的生產(chǎn)菌株Streptomyces diastatochromogenes 6#-7，結果顯示ε-PL在72 h時搖瓶產(chǎn)量可達到（0.775±0.046） g/L，比初始菌株高42.2%?；蚪M重排（genome shuffling）是指通過對一些經(jīng)過傳統(tǒng)誘變之后的目的突變株進行多輪原生質體融合，使他們的染色體重組，從而達到獲得目的產(chǎn)物大量提升的正向突變株。Li等[25]利用基因組重組的方法提高了ε-PL產(chǎn)量，篩得的突變株S. albulus FEEL-1的?-PL產(chǎn)量達到24.5 g/L，比親本株提高了63%。Wang等[26]使用慶大霉素誘導白色鏈霉菌珠W-156，經(jīng)過3輪基因組重組，得到一個AG3-28突變體，在搖瓶中ε-PL產(chǎn)量為3.43 g/L。核糖體工程是一種通過引入抗生素對核糖體蛋白S12、RNA聚合酶和其他核糖體蛋白和翻譯因子進行激活或增強次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的方法。Wang等[27]引入鏈霉素、慶大霉素和利福平等抗生素，篩選出單抗和雙抗突變體（S-88和SG-31），提高ε-PL的產(chǎn)量分別為2.81和3.83 g/L，是初始菌株S. albulus FEEL-1的1.75和2.39倍。而后Wang等[28]在之前的基礎上，經(jīng)過對Str、Gen、Rif、Gnt、Par和Lin 6種抗生素抗性的耐藥篩選，選育出突變菌株S. albulus R6，其ε-PL的搖瓶產(chǎn)量提高至4.41 g/L，較出發(fā)菌株提高了2.75倍。

值得一提的是，菌株在長期使用同一誘變劑后會產(chǎn)生誘變劑“疲勞效應”，會引起菌種生長周期延長、孢子量減少以及代謝減慢等，這對發(fā)酵工藝的控制不利，在實際生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復合處理、交叉使用的方法進行菌株誘變。另外，不管是單一誘變還是復合誘變，誘變的過程中都具有隨機性，因此高效的篩選方法顯得尤為重要，應提高篩選效率，如采用高通量篩選技術等[29]。

2.2 基因工程育種

基因工程是在分子水平上對基因進行操作的技術。為了提高氮的利用能力，Xu等[30]使用基因工程技術在白色鏈霉菌PD-1中表達了一個銨轉運蛋白基因（amtB），ε-PL產(chǎn)量從22.7 g/L提高到35.7 g/L。

Hamano等[12]為了研究細胞對?-PL的反饋抑制作用，設計了一個突變的Ask基因，并將此基因在S. albulus中表達，其突變基因Ask（M68V）能有效抵抗反饋抑制，顯著提高了ε-PL的產(chǎn)量。最近，Li等[31]在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中表達了二氫吡啶二羧酸合酶基因（dapA），延長了5 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵時間，重組菌株12#-2的ε-PL產(chǎn)量提高至30.54 g/L，較原菌株提高了19.8%。賴氨酸是合成ε-PL的唯一前體，它是由ε-聚賴氨酸合成酶（Pls）聚合而成，因此，過表達pls基因也是一種提高ε-PL產(chǎn)量的可行策略。張重陽等[32]從ε-PL的合成途徑出發(fā)，篩選出一系列酶進行基因過表達，對比發(fā)現(xiàn)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ppc）、丙酮酸羧化酶基因（pyc）、ε-聚賴氨酸合成酶基因（pls）能夠有效提高ε-PL產(chǎn)量。Wang等[33]

利用啟動子連接噬菌體的核糖體結合位點，在

S. albulus CICC11022進行pls過表達，得到一株變異菌株S. albulus Q-PL2，較野生菌株在搖瓶發(fā)酵中提高88.2%±8.3%。無獨有偶，Purev等[34]在真菌

E. festucae E437過表達epls基因，結果顯示，較野生菌株ε-PL的產(chǎn)量提高近7倍之多。又如其他途徑的基因工程育種，Purev等[34]在E. festucae F11中過表達VibA基因，該基因能夠提高Pls活性，其最終ε-PL的產(chǎn)量提高近4倍之多。此外，消除產(chǎn)生副產(chǎn)物的代謝途徑，通常也能夠增加ε-PL的濃度。如Yamanaka

等[35]使用靶向滅活技術，消除ε-PL生產(chǎn)菌株S. albulus 14147的基因組中類抗生素的生物合成基因，增加了20%的ε-PL的生物合成通量，這種新型敲除技術為ε-PL菌株提供了新的選育思路。隨著對?-PL生物合成途徑及機理的深入研究，相信誘變育種與代謝工程和基因工程相結合的方法將在?-PL高產(chǎn)菌選育中發(fā)揮越來越大的作用。

3 ε-聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝

經(jīng)典的?-PL發(fā)酵策略為兩段pH控制策略，即發(fā)酵液pH先保持在5.0以上一段時間以促進細胞生長，然后降至pH為4.0左右以促進?-PL生物合成。該策略最早是由Kahar等[11]于2001年提出的，使用該法將?-PL產(chǎn)量提高到48.3 g/L，該產(chǎn)量在隨后十幾年時間內(nèi)，保持了最高水平，之后相關發(fā)酵工藝的研究都是基于此進行優(yōu)化，如培養(yǎng)基的優(yōu)化、pH的調控、溶解氧的控制等策略（表1）。

3.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

自1977年研究者Shima等[9]首次將產(chǎn)生菌S. albulus篩選出來后，發(fā)現(xiàn)以硫酸銨和酵母粉為氮源，甘油或葡萄糖為碳源的營養(yǎng)條件比較適合該菌發(fā)酵生成?-PL，當時產(chǎn)量很低僅有0.3 g/L。

一開始M3G培養(yǎng)基先應用到ε-PL的生產(chǎn)中，其中涉及到的酵母提取物的費用較高，為了降低?-PL發(fā)酵的成本，研究人員尋找其他可代替碳源（如甘油或糖蜜）來生產(chǎn)?-PL[48]。甘油作為碳源時，在5 L生物反應器中發(fā)酵192 h后?-PL的產(chǎn)量為62.36 g/L[47]。Sivaramakrishnan等[36]利用衣藻菌Chlamydomonas在補充4 mmol/L檸檬酸發(fā)酵110 h后，將?-PL產(chǎn)量提高到2.24 g/L。由于蝦青素能夠增強抗氧化能力，Li等[37]嘗試添加1.0 g/L的蝦青素并將灰褐鏈霉菌Streptomyces griseofuscus發(fā)酵的ε-PL產(chǎn)量提升至36.1 g/L，比對照組提高36.3%。Li等[31]在添加部分氨基酸后，能夠將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌S. diastatochromogenes 12#2發(fā)酵的?-PL產(chǎn)量提高到30.54 g/L，比對照組增長了19.8%。Wang等[38]使用S. albulus X-18在搖瓶發(fā)酵中，產(chǎn)量提高了41.42%，在10 L發(fā)酵罐中加入1%乙醇發(fā)酵，產(chǎn)量提高了37.02%。綜上表明在不同碳源下對ε-PL的產(chǎn)量有不同，葡萄糖和甘油的協(xié)同消耗加速了能量代謝和碳通量，提供足夠的含碳有機分子和ATP用于生產(chǎn)更多的ε-PL[21， 49]。

3.2 pH控制策略

最早的一種發(fā)酵?-PL的兩段pH控制策略是由Kahar等[11]提出的，隨后，研究人員對該策略進行改進。ε-PL產(chǎn)生菌受到酸脅迫時，耐酸能力的增強有利于發(fā)酵，Wang等[28]采用了酸性pH脅迫策略，篩選出的突變菌株R6在5 L生物反應器中的ε-PL最高產(chǎn)率為70.3 g/L。同樣，另一種新型的兩段發(fā)酵（培養(yǎng)階段和發(fā)酵階段）在傳統(tǒng)pH酸性脅迫的基礎上，提高ε-PL產(chǎn)量至32.22 g/L，比常規(guī)發(fā)酵提高32.3%[50]。然而pH沖擊策略提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)能的機制尚不清楚[51]。Ren等[39]在5 L發(fā)酵罐中，研究了酸性pH沖擊對鏈霉菌Streptomyces sp. M-Z18的ε-PL產(chǎn)量的影響，發(fā)酵192 h后ε-PL產(chǎn)量達到54.70 g/L，比未受pH沖擊的對照組提高52.50%。綜上所述，當在pH小于5.0時，pH才對ε-PL合成有積極影響，并且在pH為4.0左右時其合成速率最大，而較高的pH（大于4.5）有利于細胞生長，因此，嚴格控制pH對實現(xiàn)ε-PL的高產(chǎn)量至關重要[39]。

3.3 溶解氧（DO）控制策略

溶解氧（DO）水平是ε-PL發(fā)酵的另一個關鍵影響因素。在ε-PL發(fā)酵過程中，高濃度的細胞密度導致氧氣難以從氣體傳遞到培養(yǎng)液中，這就需要改進氧氣供應的方法，如提高發(fā)酵罐的曝氣率、攪拌速度、微生物輸送氧氣的能力和添加載氧劑等方法均能有效供氧。

高DO水平有利于ATP的形成，進而促進細胞生長和ε-PL生物合成。比如，在細胞生長期將DO水平固定在40%，之后在ε-PL生物合成階段將DO水平降低到20%，最終使生物量和ε-PL的產(chǎn)量分別提高到1.99 mg/L和20.73 g/L[52]。細胞生理學和轉錄組學分析表明，過量活性氧（ROS）導致氧化應激反應，影響ε-PL的合成產(chǎn)量下降[53]。這種情況可以通過添加還原劑，如抗氧化谷胱甘肽和外源蝦青素，添加此類還原劑能夠緩解過度的氧化應激反應，有助于在發(fā)酵過程中保持較高的ε-PL合成率[37]。在添加抗氧化劑谷胱甘肽后的菌株Streptomyces sp. AF3-44的ε-PL產(chǎn)量為46.5 g/L，提高了68.8%[41]。此外，由于菌絲纏繞在一起，細胞密度高，培養(yǎng)基變得黏稠，導致氧傳遞效率降低[54]，僅通過增強攪拌速率和曝氣較難提高DO水平，因此，可通過向發(fā)酵液中添加氧載體來保持DO的水平，如添加0.5%正十二烷使DO保持在32%以上，ε-PL產(chǎn)量從23.4 g/L提高到30.8 g/L[43]。同樣，在白色鏈霉菌S. albulus PD-1的染色體中引入類血紅蛋白基因后，白色鏈霉菌的氧結合能力相應增強，ε-PL的產(chǎn)量比野生型株增加了50.7%[42]。

3.4 其他策略

細胞固定化也是一種提高微生物發(fā)酵產(chǎn)能的有效策略。在分批發(fā)酵過程中，能重復利用微生物細胞、有效縮短發(fā)酵時間，提高生產(chǎn)效率，還可以增強細胞對有毒物質的抗性，不污染環(huán)境等特點。Zhang等[44]發(fā)現(xiàn)絲瓜海綿作為固定化材料可以顯著提高?-PL產(chǎn)量至34.1 g/L。在發(fā)酵液中，?-PL濃度過高可能導致最終產(chǎn)物的反饋抑制，因此，在發(fā)酵過程中通常采用原位產(chǎn)物去除法（ISPR）。Liu等[46]使用D152樹脂結合ISPR的方法來提高Streptomyces sp. GIM8菌株發(fā)酵的ε-PL，該產(chǎn)量從3.76 g/L提高到

23.4 g/L。Liu等[55]對固定化培養(yǎng)瓶進行連續(xù)ISPR，ε-PL產(chǎn)率高達3.51 g/L，而對照組的ε-PL產(chǎn)率僅為0.51 g/L。Wang等[45]利用絲瓜海綿（rGOLS）載體制備還原氧化石墨烯，用于ε-聚賴氨酸的細胞固定化生產(chǎn)，rGOLS-1與好氧植物纖維床生物反應器（rGOLS-1-AFPB）順序分批培養(yǎng)白色鏈霉菌時，ε-PL濃度和生產(chǎn)率最高可達（39.2±0.63） g/L和0.48 g/（L·h），該研究設計了一種先進的固定化載體，為提高固定化細胞的發(fā)酵性能提供了有效途徑。另外，Ren等[47]添加

10 g/L滑石粉微粒，最終使Streptomyces sp. M-Z18在5 L發(fā)酵罐的?-PL產(chǎn)量達到62.36 g/L，然而，這種方法也有缺點，例如營養(yǎng)、基質和氧氣等不能被充分吸收。

4 ε-聚賴氨酸抑菌機制

研究表明，ε-PL能夠增強大腸埃希菌細胞表面的疏水性、細胞膜的通透性，在破壞細胞壁后，能與細胞膜表面的負電荷結合，改變膜內(nèi)外電勢，造成細胞膜裂解，引起細胞內(nèi)物質大量滲出[56]。ε-PL與大腸埃希菌的作用機制中，ε-PL和磷脂基共同作用導致細胞膜以一種非特異性的、地毯狀的機制扭曲和收縮，細胞膜被迫向自身折疊，膜上出現(xiàn)孔洞、囊泡和微膠團[5]。

ε-PL對大腸埃希菌的作用類似于抗菌肽抑菌機制中的氈毯模型，即ε-PL先是通過靜電作用與細胞膜結合，鋪滿細胞膜表面，使大腸埃希菌細胞磷脂雙分子層彎曲受損，細胞膜逐漸分解，細胞內(nèi)物質如電解質、胞內(nèi)核酸與蛋白質流出，進而導致菌體死亡。如圖2中所示，大腸埃希菌的細胞膜包含細胞外膜、肽聚糖層和細胞膜，外膜由脂多糖構成。ε-PL和脂多糖之間存在靜電作用，最終將移除脂多糖層。ε-PL能夠進入周漿間隙，但是否以一種氈毯機制與肽聚糖層作用，或穿過肽聚糖層與細胞膜作用是未知的。當ε-PL在細胞膜上達到一定濃度時，它能使部分膜發(fā)生彎曲。一旦細胞膜的外層、內(nèi)層依次被ε-PL除去，去除內(nèi)外層的磷脂會形成小泡，在膜間隙留下孔隙，大量的ε-PL可以通過這個孔進入細胞質，對細胞進一步造成損傷。上述說明，ε-PL能夠破壞大腸埃希菌的細胞結構，從而達到抑菌效果。

隨著研究學者對抗菌肽的深入研究，發(fā)現(xiàn)不少抗菌肽的抑菌過程可以用ROS誘導細胞凋亡模型進行解釋。如圖3所示，ε-PL進入細胞質后，會刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，影響細胞對氧化應激和自衛(wèi)的反應，最終阻礙細胞呼吸，影響細胞活力，進而誘導細胞死亡。Ye等[60]發(fā)現(xiàn)ε-PL在大腸埃希菌中可誘導細胞內(nèi)ROS的積累，提高氧化應激基因（sodA和oxyR）的表達。ε-PL除了殺死動物、植物的某些病原體外，還可以觸發(fā)宿主的防御信號，例如，ε-PL在已染菌的棗中誘導了防御反應基因的表達[61]。另外，蛋白質組學顯示ε-PL可下調腐敗希瓦菌蛋白質合成組分的表達[58]，代謝組學分析表明ε-PL誘導的應激反應會抑制釀酒酵母和葡萄球菌的主要代謝途徑（糖酵解和三羧酸循環(huán)）[62]。

最近，白森萌等[63]提出ε-PL的抑菌機制可能存在一種復合模型。當ε-聚賴氨酸發(fā)生抑菌作用時，先是沿著細胞膜周圍鋪滿抑菌肽，使脂雙分子層發(fā)生變形出現(xiàn)間隙，ε-聚賴氨酸沿著間隙進入細胞，引起ROS脅迫，導致細胞死亡。由于該模型還只是一種猜想，所以日后還需實驗驗證。

5 ε-聚賴氨酸應用研究進展

通常細菌的外膜帶有負電荷，而ε-PL是一種帶正電荷的抗菌肽，能夠通過靜電作用與細菌的細胞壁和細胞膜結合來破壞其完整性和通透性，ε-PL破壞細胞壁后，進而與細胞膜表面負電荷結合，使細胞膜裂解，引起細胞內(nèi)的物質、能量和信息傳遞中斷，最終導致細胞死亡，這種作用機制使得細菌難以產(chǎn)生耐藥性，從而提高了抑菌效率，使ε-PL能夠應用于更寬的領域[91-92]（表2）。

5.1 ε-聚賴氨酸在食品領域的應用

ε-PL在食品領域廣泛用作食品防腐劑，如淀粉類、乳制品、海鮮、肉制品和果蔬等食品，且相較于其他常見食品抗菌劑抑菌范圍更廣、穩(wěn)定性更優(yōu)（表3）。

5.1.1 淀粉類

米飯、面條、面包、饅頭、包子等一系列高淀粉類食物，pH值介于中性和弱堿性之間。由于ε-PL的最適抑菌pH值范圍為弱酸性，所以將ε-PL添加入淀粉類食物中能達到很好的抑菌效果。Cheng等[64]以不同ε-聚賴氨酸含量的淀粉/明膠（S/G）為原料，采用低溫擠壓吹塑法制備了食用抗菌膜。S/G膜中含有ε-PL，改善了鮮面包的膜柔度、水接觸角值、膨脹度和保鮮期，也降低了鮮面包的水蒸氣滲透性和抗拉強度，該實驗表明ε-PL在食品保鮮/包裝方面的潛在價值。Lu等[65]研究使用ε-聚賴氨酸處理過的酵母對凍融循環(huán)后面團面筋聚合和饅頭品質的影響，與未處理過的酵母的冷凍面團制成的饅頭相比，ε-PL處理過的酵母的冷凍面團制成的饅頭比體積更大，硬度更低，氣孔更大，整體口感更好。

5.1.2 乳制品

Ning等[66]發(fā)現(xiàn)ε-PL在貯藏期（0～5 d）能有效滅活或殺死巴氏奶中的金黃色葡萄球菌。ε-PL不僅能使金黃色葡萄球菌的跨膜電位明顯降低，并引起K+離子的泄漏，造成細胞損傷，還能刺激金黃色葡萄球菌產(chǎn)生活性氧，誘導細菌細胞凋亡。Lin等[67]表明ε-PL在0.1 mg/mL的ε-PL低劑量下對奶酪中的單核增生乳桿菌具有良好的抗菌活性，呼吸代謝結果表明ε-PL能抑制Embden-Meyerhof-Parnas通路及該通路中的三種關鍵酶，ε-PL不僅能最大限度地減少奶酪的變質，還能保持奶酪的感官品質。

5.1.3 水產(chǎn)類

為抑制太平洋白蝦中一種重要的嗜冷腐壞菌腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）的活性，Qian

等[69]研究ε-聚賴氨酸（ε-PL）和牛至精油（OEO）對肉湯和蝦中腐敗希瓦氏菌QY38的抑制效果，在原位實驗中，ε-PL+OEO聯(lián)合處理抑制了腐爛鏈球菌QY38在蝦中的總活菌數(shù)從9.11 log cfu/g （CK）至6.35 log cfu/g

（CK），質子磁共振成像結果表明，防腐劑可以延緩蝦肌的水分遷移和水分流失。侯溫甫等[68]分析ε-聚賴氨酸對草魚魚肉微生物群落結構的影響，并鑒定出優(yōu)勢腐敗菌菌株，1.0 mg/mL的ε-PL可以完全抑制假單胞菌屬、腐敗希瓦菌和氣單胞菌的生長。Kazem

等[70]研究了復合刺蕁麻提取物（3%和6%）和?-聚賴氨酸（0.1%和0.2%）對聚乙烯袋裝（常壓條件下）4 ℃冷藏12 d的虹鱒魚魚片微生物特性和穩(wěn)定性的影響。在貯藏過程中，虹鱒魚樣品中揮發(fā)性堿氮（TVB-N）含量增加，而總酚含量下降，這些天然成分可以用來維持虹鱒魚的肉質。

5.1.4 肉制品

Lee等[71]采用結晶紫試驗和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察ε-PL時，發(fā)現(xiàn)ε-PL可誘導細菌細胞膜的損傷，這些結果表明在雞肉加工時ε-PL可作為抗生素的內(nèi)在潛力。Kazem等[72]研究了?-聚賴氨酸涂層（0.5%和1%）和刺蕁麻提取物（3%、6%和9%）在4 ℃條件下放置12 d對牛肉品質性狀和貨架期的組合影響。結果表明，?-聚賴氨酸復合蕁麻提取物（SNE）對聚乙烯袋裝牛肉樣品灰分、脂肪、蛋白質和水分含量無顯著影響，ε-PL包覆SNE可以有效地延長牛肉的貨架期，且不會對感官屬性產(chǎn)生負面影響。Huang

等[73]研發(fā)了一種納米乳化劑可食性涂層作為一種新型的抗菌和抗氧化材料，能有效地維持活性化合物在肉表面的釋放，提高即食肉制品安全和質量，與對照組相比，納米乳劑涂層的炭化雞肉的貨架期延長了至少6 d。

5.1.5 果蔬

高倩等[74]研發(fā)了一種涂膜保鮮液，成分含有連翹精油1.50%、殼聚糖2.0%、ε-聚賴氨酸0.50%、nisin（乳酸鏈球菌素）0.05%，在濕度65%條件下，能延長番茄儲藏10 d，維持番茄新鮮的表面。除了將ε-PL與抗菌劑、保鮮劑等聯(lián)合使用，還可以結合物理保鮮方法（超聲處理、紫外線輻射、脈沖電場等）來破壞病原菌細胞結構，二者聯(lián)合使用能有效協(xié)同抑制病原菌的生長[95]。郁杰等[75]用低強度的紫外光結合ε-PL重復照射鮮切菠菜，有效抑制腐敗菌的生長，減緩營養(yǎng)成分的丟失和葉綠素的消耗，并延長貨架期半天時間。Li等[76]研究表明，超聲波技術結合ε-PL能夠穩(wěn)定水分子水平，從而抑制果蔬的新陳代謝，延長保質期。以上研究表明，將ε-PL與抗菌劑、保鮮劑、物理保鮮等方法聯(lián)合使用時可有效提高其保鮮效果，延長果蔬貨架期，也維持食物的營養(yǎng)價值和風味。

5.2 ε-聚賴氨酸在醫(yī)學領域的應用

ε-PL在醫(yī)學領域的應用主要包括：醫(yī)學材料、藥物載體和核酸載體等。

5.2.1 醫(yī)學材料

ε-PL與羧甲基纖維素結合時，可形成一種能夠自降解、凝膠化速度快、刺激性低的水凝膠，該凝膠在未來可能用于醫(yī)用止血敷料[78]。Hyon等[77]開發(fā)出1種含有ε-PL的醫(yī)用黏合劑，在止血方面有良好的醫(yī)用價值。Fazli等[96]報道了含有ε-聚賴氨酸的BC（細菌纖維素）基敷料，由生物相容性和貽貝激發(fā)的聚多巴胺（PDA）交聯(lián)，可促進感染性傷口愈合，與照組相比，改性膜組新生兒皮膚厚度更大、更光滑。糖尿病足潰瘍（DFUs）是一種難以愈合的慢性傷口，易受細菌感染，傳統(tǒng)的水凝膠敷料在高溫下容易失水或在低溫下容易結冰，不適合長期使用或在極端環(huán)境中使用。Liu等[97]采用聚丙烯酰胺、明膠和ε-聚賴氨酸拼合制備了耐高溫（20 ℃～60 ℃）的抗菌水凝膠敷料，結果表明，雙網(wǎng)絡G-PAGL水凝膠敷料能促進膠原沉積、血管生成，抑制細菌繁殖，有效促進DFUs愈合。這些結果表明，功能化膜在感染傷口的敷料的臨床應用中具有巨大潛力。

銅綠假單胞菌是最常見的分離性院內(nèi)病原體之一，約占所有醫(yī)院獲得性感染的10%，由于其抗生素耐藥性而難以用已知的抗生素治療，Zhang等[98]合成了涂有ε-聚賴氨酸和聚乙烯亞胺（PEI）的AgNPs材料，這些材料在低濃度（IC50： 7.284 μg/mL）下顯示出很強的抗銅綠假單胞菌能力。Liu等[79]合成了一種磁性介孔二氧化硅/ε-PL納米復合材料對血液中鉛離子有較高的去除能力，在治療重金屬中毒方面具有不錯的潛力。

5.2.2 藥物載體

臨床上抗腫瘤藥物如阿霉素、紫杉醇和長春新堿等均存在水溶性差、適用性差和毒副作用大等問題。申有青等[80]制備了一種復合的ε-PL納米膠束，該納米膠束載藥效率高、兼容性好、毒作用小且持續(xù)時間長，可作為一種安全可靠的疏水性藥物載體。Wu等[81]使用鹽酸二甲雙胍（MetHCL）作為原始藥物，設計了由羧甲基纖維素/聚賴氨酸/三聚磷酸鹽復合（CMC/PLL/TPP）形成的藥片，該藥片載藥效率好且溶解速度快。

5.2.3 核酸載體

不安全的基因載體問題是當前臨床治療面臨的最大困難之一，陽離子聚合物（非病毒載體）是一類很有應用潛力的載體。楊波等[82]研發(fā)了一種新型ε-PL-聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精聚合物，該聚合物具有水溶性好、兼容性佳和幾乎沒有毒副作用的優(yōu)點，在基因載體領域有很好的應用潛能。袁曉燕等[83]制備了一種核酸載體，包含葡聚糖、ε-PL和多肽VAPG，可以運載核酸藥物安全地進入靶細胞，運輸效率高達63.2%，有效減輕了對其他細胞的生物毒性，在生物醫(yī)用基因治療領域有較大的應用前景。ε-PL還是酶的理想保護劑，因為它的線性結構為酶表面的氨基修飾提供了足夠的空間，從而提高了酶活性位點[99]。

5.3 ε-聚賴氨酸在材料領域的應用

ε-PL在材料領域的應用主要包括：纖維素材料、納米材料、凝膠復合材料等。

5.3.1 纖維素材料

Wu等[84]提出了一種合成抗菌ε-聚賴氨酸錨定二羧基纖維素小球的新方法，采用溶膠-凝膠過渡法制備纖維素小球，經(jīng)高碘酸鈉和亞氯酸鈉氧化形成羧基，用碳二亞胺介導的酰胺化反應將ε-PL固定在小球上，樣品在12 h內(nèi)對金黃色葡萄球菌、酸性土化脂肪酸環(huán)桿菌和大腸埃希菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性，20 d后可在土壤中被生物降解，這種生物可降解珠子對環(huán)境較友好。Nie等[85]制備了一種接枝纖維素珠，包含2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基（TEMPO）、碳二亞胺和ε?PL，該類球珠對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等具有良好的抑菌活性，此類生物復合微珠在水凈化方面具有潛在的應用前景。

5.3.2 其他材料

納米材料具有比表面積大、孔隙率高和安全性高的特點[100]。Jiang等[86]用納米沉淀法結合ε-PL與脫氧核糖核酸（DNA）合成納米復合物，該納米顆粒具有廣泛的抑菌能力，即使在含磷酸鹽的不利條件下也能保持抑菌能力。Zhen等[87]采用甲基丙烯酸縮水甘油酯通過接枝反應制備了一種基于ε-PL的光固化水凝膠復合材料，由于添加了TA，水凝膠的抗菌性能和抗氧化活性大大增強，以上研究說明ε-PL在與其他材料結合時顯示出重要的應用價值。

5.4 ε-聚賴氨酸在其他領域的應用

在其他領域，ε-PL可以應用到生物電子領域，如納米級電路、光學存儲器和多通道陣列方傳感器等的制造，又如ε-聚賴氨酸在環(huán)境監(jiān)測的生物傳感器中作為固定劑，其應用前景相當可觀[101]。ε-PL可制成高吸水性的材料，如ε-PL和γ-PGA用γ-射線交聯(lián)，能得到高吸水性的樹脂[88]，所以還可用于女性衛(wèi)生巾、嬰兒尿片等生活用品。又如ε-PL作為膳食劑時在農(nóng)業(yè)領域的應用，能夠抑制脂肪從小腸吸收，ε-PL可通過調控豬腸道菌群來改善營養(yǎng)物質的利用（如蛋白質、脂質和纖維素）[89]，在未來的研究中ε-PL的應用潛力可能不僅局限于豬這一動物，也有可能應用于雞、牛和羊等。侯馨怡等[90]將納他霉素

50 mg/L和ε-聚賴氨酸500 mg/L混合應用于植物組織培養(yǎng)中，有效抑制了真菌生長，豐富了ε-PL在農(nóng)業(yè)領域的應用。

6 總結與展望

本文在簡要概述ε-PL抑菌機制的基礎上，著重介紹ε-PL在應用領域的最新研究進展，提到ε-PL生物合成機理、微生物育種和發(fā)酵生產(chǎn)工藝進展，旨在為開拓ε-PL的應用范圍提供幫助。根據(jù)當前的研究情況，提出以下幾點展望：①近年來，國內(nèi)ε-PL的合成產(chǎn)量取得了較大的突破，研究主要集中在生產(chǎn)菌株選育和發(fā)酵工藝兩方面，但對生物合成高產(chǎn)機制的探索不夠深入，因此，使用基因組、轉錄組等方法對比高、低產(chǎn)菌株，解析高產(chǎn)機制顯得尤為重要，日后ε-PL生產(chǎn)菌株的基因組可能被確定，有可能運用基因工程等先進技術進行基因組裝，提高其合成產(chǎn)量。②由于ε-PL易吸潮的缺點，常將其制成鹽酸鹽儲備使用，但ε-PL生物合成成本較高，與其他食品防腐劑缺乏競爭力。為盡快實現(xiàn)ε-PL的日常使用，一方面要大力開發(fā)在食品領域的應用，另一方面要進一步提高生物合成ε-PL的效率，才能使得ε-PL及其鹽酸鹽的使用成本降低。③當前，雖然ε-PL的主要用途是食品防腐劑，但其在臨床醫(yī)學、農(nóng)業(yè)病蟲害防治及抗菌材料研發(fā)等領域展現(xiàn)出良好的應用潛能，未來應深入擴寬ε-PL的抑菌范圍，如加強ε-PL對人體致病菌和植物病原菌的抗菌研究。

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收稿日期：2022-10-24

項目基金：國家自然科學基金（No. 21676173）；蘇州科技大學科研基金資助項目（No. XKZ201411）

作者簡介：莊孝東，男，生于1998年，在讀碩士研究生，研究方向為微生物代謝工程，E-mail： 970690820@qq.com

*通信作者，E-mail： jlfu999@126.com