苦參皮軟膏的制備及其對(duì)足癬致病菌的抑制作用研究

許玲玲 曹穎堃 楊曉東 易文

中醫(yī)稱(chēng)足癬為臭田螺、爛腳丫、腳氣等, 是一種常見(jiàn)的感染性皮膚病, 世界上大部分地區(qū)發(fā)病率為18%～39%［1］, 主要是由紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、須癬毛癬菌等淺部真菌引起［2-6］, 臨床中常見(jiàn)真菌的混合感染。足癬患者足部還容易被金黃色葡萄球菌等細(xì)菌感染［7］?；颊咦悴砍３霈F(xiàn)干燥、脫屑、皸裂、水皰、糜爛等, 伴有瘙癢、疼痛等癥狀, 臨床上常分為水皰鱗屑型、角化過(guò)度型和浸漬糜爛型［8-10］。西醫(yī)治療主要采取抗真菌藥物, 雖有療效, 但易產(chǎn)生耐藥性, 停藥后易復(fù)發(fā)。中醫(yī)藥治療足癬以外治為主, 療效較好, 不良反應(yīng)小且價(jià)格低廉［11］。姜鑒航等［12］通過(guò)對(duì)近40 年發(fā)表的中藥外用治療淺部真菌病的相關(guān)文獻(xiàn)分析, 發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻次最多的中藥是苦參, 最常見(jiàn)的藥物組合有苦參和白鮮皮?？鄥⒁蚱渚哂星鍩嵩餄?、抗菌殺蟲(chóng)功效, 多外用于治療濕疹、濕瘡、足癬等皮膚病?？鄥A、氧化苦參堿是苦參中最主要的成分［13］。白鮮皮在臨床上常用于足癬、疥癬、蕁麻疹等慢性頑固性皮膚病的治療, 研究表明其具有抗炎、抗真菌等作用［14］。中醫(yī)藥治療足癬多用中藥泡洗劑, 作用時(shí)間短, 如果將中藥泡洗劑和中藥藥膏聯(lián)合應(yīng)用于治療足癬, 作用時(shí)間長(zhǎng),效果更好。臨床上, 治療足癬的中藥軟膏劑不是很多,本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦參皮軟膏的制備工藝及其對(duì)足癬的致病菌抑制作用進(jìn)行了研究, 為開(kāi)發(fā)和應(yīng)用苦參皮軟膏奠定基礎(chǔ)。

1 材料與菌種

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 DHP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海和呈儀器制造有限公司)、LDZX-75KBS 型號(hào)高壓滅菌鍋(上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)、SCIENTZ-192 高通量組織研磨器(寧波新芝ENTZ 生物科技股份有限公司)、賽默飛世爾U3000 高效液相色譜、數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州恒溫儀器制造有限公司)等。

1.2 受試菌種 須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)和紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)標(biāo)準(zhǔn)株, 購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所；金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、綠膿桿菌(P.Aeruginosa)和大腸桿菌(Escherichia coli)標(biāo)準(zhǔn)株由金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 藥材和試劑 經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院吳遠(yuǎn)文副教授鑒定, 在藥店購(gòu)買(mǎi)的苦參、白鮮皮分別為豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait.)的干燥根、蕓香科植物白鮮(Dictamnus dasycarpus Turcz.)的干燥根皮。苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品、氧化苦參堿購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所(批號(hào)分別為110805-202109、110780-202108)。色譜純乙腈(北京京科瑞達(dá)科技有限公司)、乙醇、液體石蠟、三乙醇胺和硬脂酸等為分析純等。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參皮軟膏的制備 稱(chēng)取苦參和白鮮皮粗粉各50.00 g, 加入95%乙醇800 ml, 浸泡30 min 后, 超聲提取30 min, 抽濾, 濾液減壓回收溶劑, 濃縮成膏狀, 制成每克浸膏相當(dāng)于含生藥3.2 g, 得到白鮮皮和苦參的提取物稠膏。

稱(chēng)取液體石蠟8 g、羊毛脂5 g、單硬脂酸甘油酯4 g、白凡士林3 g 和硬脂酸12 g 置于一個(gè)燒杯中, 置于恒溫80℃的水浴鍋中, 加熱融化, 攪拌均勻, 作為油相；另稱(chēng)取三乙醇胺0.4 g、甘油7.5 g 和56 g 蒸餾水放入另一個(gè)燒杯中, 保持恒溫80℃, 混合均勻, 作為水相。將油相邊攪拌邊加入水相中, 邊攪拌邊加入提取物稠膏3 g 和用少許95%乙醇溶解的防腐劑羥苯乙酯0.3 g, 繼續(xù)攪拌, 待溫度降至室溫, 加入佛手油2 滴,攪拌均勻, 分裝, 研制成有香味的黃色質(zhì)地細(xì)膩的苦參皮軟膏。

2.2 苦參皮軟膏含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 取苦參皮軟膏5 g, 精密稱(chēng)重, 精密加入濃氨1 ml、氯仿25 ml, 密塞, 于80℃水浴中超聲提取15 min, 放至室溫, 然后放入冰箱冷凍20 min, 取出抽濾, 濾液濃縮至干, 殘?jiān)右掖既芙? 轉(zhuǎn)移至5 ml 容量瓶中, 定容至刻度。進(jìn)樣前用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

2.2.2 對(duì)照品的制備 精密稱(chēng)取苦參堿13.5 mg、氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品7 mg、加乙醇溶解, 轉(zhuǎn)移至25 ml 容量瓶中, 用乙醇定容至刻度。制成每1 毫升含苦參堿540 μg 和氧化苦參堿280 μg 對(duì)照品混合溶液。

2.2.3 高效液相色譜法(HPLC)色譜條件 賽默飛Syncronis 色譜柱C18(4.6 mm×250 mm, 25 μm), 流動(dòng)相為乙腈-無(wú)水乙醇-2%磷酸溶液(81∶10∶9), 檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm, 柱溫25℃；進(jìn)樣量20 μl。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品混合溶液1.00、2.00、4.00、5.00、10.00 ml 放入5 個(gè)10 ml容量瓶中, 用乙醇定容至刻度。進(jìn)樣, 測(cè)峰面積, 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(X 軸)、對(duì)峰面積(Y 軸)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 苦參堿的線(xiàn)性回歸方程：Y=0.3567X-0.0872, r2=0.9997,線(xiàn)性范圍54～540 μg/ml；氧化苦參堿的回歸方程：Y=0.2753X-0.0148, r2=0.9998, 線(xiàn)性范圍28～280 μg/ml。標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液的HPLC 圖分別見(jiàn)圖1, 圖2。

圖1 苦參堿和氧化苦參堿的HPLC 圖

圖2 供試品溶液的HPLC 圖

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于第0、2、4、8、12 h, 精密吸取供試品溶液20 μl, 進(jìn)樣, 測(cè)得5 次苦參堿和氧化苦參堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.33%、0.56%, 說(shuō)明樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液20 μl, 連續(xù)6 次進(jìn)樣, 測(cè)得6 次的苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD 分別為1.12%、0.83%, 說(shuō)明精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取苦參皮軟膏5 份, 平行制備供試液, 測(cè)得5 份樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量的RSD 分別為4.76%、4.05%, 說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知含量的苦參皮軟膏5 份, 每份約5 g, 精密稱(chēng)定, 每份分別精密加入2.00 ml對(duì)照品混合溶液, 按照供試液的制備方法制備, 測(cè)定含量。結(jié)果表明, 苦參堿的平均回收率為94.23%, RSD為4.81%(n=5)；氧化苦參堿的平均回收率為103.44%,RSD 為4.51%(n=5)。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確率高。

2.2.9 苦參堿的含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液20 μl, 測(cè)定苦參皮軟膏中苦參堿和氧化苦參堿的含量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次, 計(jì)算平均含量。見(jiàn)表1。

表1 苦參皮軟膏中苦參堿、氧化苦參堿的含量(n=3, %)

2.3 苦參皮軟膏的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將苦參皮軟膏放在溫度35±2℃、相對(duì)濕度70%±5%的環(huán)境下, 分別于第1、2、3、6 月末時(shí)取樣觀察檢測(cè)。結(jié)果表明, 在這6 個(gè)月內(nèi), 黃色軟膏色澤均一、質(zhì)地細(xì)膩, 無(wú)發(fā)霉變質(zhì), 無(wú)油水分離, 有效成分的含量無(wú)顯著變化, 說(shuō)明該軟膏性質(zhì)非常穩(wěn)定。

2.4 苦參皮軟膏抑菌活性實(shí)驗(yàn)(抑菌環(huán)法)

2.4.1 供試品的制備 稱(chēng)取4 份復(fù)方苦參皮軟膏各5 g, 分別放入4 個(gè)無(wú)菌小燒杯中, 一份不加水稀釋, 其余3 份分別加蒸餾水稀釋成1∶10、1∶20、1∶30 的軟膏稀釋液。

2.4.2 試驗(yàn)樣片的制備 取處理好的干燥無(wú)菌濾紙片(孔徑5 mm)放入無(wú)菌平面皿上, 用無(wú)菌棉拭子蘸取供試品均勻涂布在濾紙上, 置于無(wú)菌室晾干。

2.4.3 陰性對(duì)照樣片的制備 將無(wú)菌干燥濾紙片(孔徑5 mm)放入無(wú)菌平面皿內(nèi), 用無(wú)菌棉拭子蘸取空白基質(zhì)涂布在濾紙上, 晾干后備用。

2.4.4 菌懸液的制備 將紅色毛癬菌、犬小孢子菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌和絮狀表皮癬菌分別接種于瓊脂培養(yǎng)基, 置于26℃恒溫箱培養(yǎng)2 周, 將綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)18 h。挑取已轉(zhuǎn)種活化的菌塊, 置于組織研磨器中加無(wú)菌生理鹽水研磨均勻, 在震蕩器上震蕩1 min 后, 將菌懸液濃度調(diào)節(jié)到(1～6)×106cfu/ml。

2.4.5 抑菌試驗(yàn) 用無(wú)菌棉拭子蘸取制備好的菌懸液, 在培養(yǎng)基平板表面涂沫均勻, 然后干燥5 min。用無(wú)菌鑷子將樣片放在每個(gè)平板表面上, 蓋好。試驗(yàn)菌如果是紅色毛癬菌等真菌時(shí), 將培養(yǎng)皿置于26℃培養(yǎng)1 周；如果試驗(yàn)菌是綠膿桿菌等細(xì)菌時(shí), 于37℃培養(yǎng)18 h。然后觀察結(jié)果, 見(jiàn)圖3。試驗(yàn)重復(fù)3 次, 結(jié)果表明,軟膏的稀釋液對(duì)各試驗(yàn)菌的抑制作用非常弱, 因此只測(cè)量軟膏對(duì)各試驗(yàn)菌抑菌環(huán)的直徑(包括濾紙片), 計(jì)算平均直徑。見(jiàn)表2, 表3。

表2 苦參皮軟膏對(duì)試驗(yàn)真菌的抑菌圈直徑(n=3, mm)

表3 苦參皮軟膏對(duì)試驗(yàn)細(xì)菌的抑菌圈直徑(n=3, mm)

圖3 苦參皮軟膏及其稀釋液的抑菌效果

3 討論

因與其他基質(zhì)相比, O/W 軟膏基質(zhì)具有膏體細(xì)膩、易涂抹、易清洗等優(yōu)點(diǎn), 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多次實(shí)驗(yàn), 最終采用乳化法研制成O/W 型苦參皮軟膏。桂蜀華等［15］研究表明苦參堿對(duì)絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌、紅色毛癬菌有抑制作用。孫磊等［16］研究發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有一定抑菌作用。因此,本實(shí)驗(yàn)以苦參堿和氧化苦參堿為指標(biāo), 測(cè)定苦參皮軟膏中有效成分的含量, 為苦參皮軟膏的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。通過(guò)體外抑菌試驗(yàn), 結(jié)果表明苦參皮軟膏對(duì)絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌都有抑制作用, 對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌也有抑制作用。說(shuō)明苦參皮軟膏對(duì)引起足癬的致病菌有抑制作用, 為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)苦參皮軟膏應(yīng)用于臨床治療足癬提供理論依據(jù)。