鳳仙花霜霉病的病原菌鑒定

高國香 王 艷,2 張 婷 李 錚

鳳仙花霜霉病的病原菌鑒定

高國香1王 艷1,2張 婷1李 錚1

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 甘肅蘭州 730000；2.西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 甘肅蘭州 730000）

為鑒定鳳仙花霜霉病的病原菌類型，對(duì)病原菌進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定，并提取菌物DNA，利用cox2-mtDNA和ITS、LSUrDNA基因序列進(jìn)行分子鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其分類地位。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，病原菌孢囊梗長90.00 μm～530.12 μm（平均435.94 μm），寬8.00 μm～15.00 μm（平均10.82 μm），主軸長50.05 μm～340.70 μm（平均164.88 μm），占全長1/3～2/3，基部略膨大，平均寬12.65 μm；孢子囊淡褐色，圓形或橢圓形，長11.37 μm～28.55 μm（平均17.30 μm），寬12.00 μm～21.15 μm（平均15.00 μm），分布較多，符合軸霜霉屬菌物的形態(tài)特征。cox2-ITS-LSU基因序列串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)育樹表明，病原菌與鳳仙花軸霜霉（）聚類在一起，相似度為100%。因此，采集于甘肅省隴西縣首陽藥圃園內(nèi)的鳳仙花霜霉病病原菌鑒定為鳳仙花軸霜霉。

鳳仙花；霜霉?。徊≡b定；鳳仙花軸霜霉

鳳仙花（L.）為鳳仙花科鳳仙花屬一年生草本植物，因其花朵艷麗，培育方法簡單，現(xiàn)普遍作為園藝觀賞花卉，我國各地庭院廣泛栽培[1]，主產(chǎn)于江蘇、浙江、河北、安徽等地[2]。鳳仙花霜霉病是鳳仙花最主要的病害之一，自1877年在德國的野生鳳仙花（）上首次發(fā)現(xiàn)霜霉病以來，其在世界范圍內(nèi)廣泛流行[4]，已侵染同屬的水金鳳、齒萼水金鳳、峨山水金鳳等多種植物[5]。鳳仙花霜霉病是一種極具破壞性的葉面病害，尤其在潮濕、夜間涼爽的環(huán)境下容易發(fā)病，一旦發(fā)病便迅速傳播。發(fā)病時(shí)鳳仙花葉片出現(xiàn)白色霉層，嚴(yán)重時(shí)會(huì)侵染整株植物，葉片、葉柄、莖稈均布滿白色至灰白色霜狀霉層，花朵和葉片凋落，甚至植株倒伏、枯死，降低植株觀賞性，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。本研究通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段，對(duì)鳳仙花霜霉病病原菌進(jìn)行了鑒定，從而為病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)樣采集

于2020年8月在甘肅省定西市隴西縣首陽鎮(zhèn)首陽藥圃園（104°24′E，35°50′N，海拔1 904 m）調(diào)查鳳仙花霜霉病的病害。記錄病害植株的癥狀，拍照，采集標(biāo)樣并置于裝有冰袋的泡沫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用，將部分標(biāo)樣壓制成標(biāo)本留存。

1.2 病原菌形態(tài)鑒定

從低溫保存的發(fā)病葉片上輕輕刮取新鮮有活力的霉層，以蒸餾水為浮載劑制成玻片，置于顯微鏡（BX51T-32H01，Olympus，日本）下，觀察病原菌形態(tài)，測定大小并拍照。測定項(xiàng)目包括孢囊梗長和寬、主軸長、基部寬、分枝數(shù)、末枝長，以及孢子囊長和寬，并計(jì)算孢囊梗主軸占全長的比例，每個(gè)項(xiàng)目測定100個(gè)數(shù)據(jù)。

1.3 吸器和卵孢子的觀察

采用NaOH組織透明法：用直徑1 cm的打孔器在回軟葉片的霜霉病斑處打取圓片，置于燒杯中，加入10％NaOH溶液少許，煮沸5 min～7 min，至葉片透明但未消解為止，用挑針輕輕地劃開葉片細(xì)胞，在細(xì)胞之間鏡檢吸器的形狀及卵孢子有無、形狀、大小、顏色等。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)尹玲等[7]的研究，利用一種改良的CTAB法提取病原菌的DNA。利用引物對(duì)cox2-F/cox2-R[8]、ITS300/ITS4[9]和LROR/LR6-O[10]分別擴(kuò)增病原菌的cox2-mtDNA和ITS、LSUrDNA片段。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中，2×TaqPCRMix 10 μL，模板DNA2 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 6 μL，混勻離心，置于PCR儀（Agilent Sure Cycler 8800，博日科技有限公司）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得目標(biāo)產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化和測序。登錄GenBank，將所得序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，下載相關(guān)序列，利用MEGAX軟件中的鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

在病害發(fā)生初期，病原菌侵染葉片，葉片背面產(chǎn)生白色霜狀霉層（見圖1 a），相應(yīng)的葉片正面出現(xiàn)黃綠色病斑（見圖1 b），霉層較厚的葉片正面也會(huì)出現(xiàn)白色霜霉（見圖1 c）。之后，霉層逐漸擴(kuò)大、增厚（見圖1 d），葉片正面呈黃綠色。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，霉層逐漸變成灰白色，侵染整個(gè)葉片、葉柄和莖稈，植株布滿灰白色霉層，葉片向下卷曲，花朵脫落，莖稈光禿，在持續(xù)潮濕和陰冷的條件下植株會(huì)發(fā)生倒伏或整株枯萎死亡，嚴(yán)重影響植株的觀賞性。

a.發(fā)病初期葉片正面癥狀；b.發(fā)病初期葉片背面癥狀；c.霉層較厚的葉片正面出現(xiàn)霉層；d.發(fā)病盛期霜狀霉層增厚。

圖1 鳳仙花霜霉病病害癥狀

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)特征

病原菌孢囊梗直立，分枝發(fā)達(dá)，近直角（圖2 a），頂部二叉狀分枝2次～7次，頂端鈍圓（圖2 b）。孢囊梗長90.00 μm～530.12 μm（平均435.94 μm），寬8.00 μm～15.00 μm（平均10.82 μm），主軸長50.05 μm～340.70 μm（平均164.88 μm），占全長的1/3～2/3，基部略膨大（見圖2 c），平均寬12.65 μm。孢子囊為淡褐色，呈圓形或橢圓形，長11.37 μm～28.55 μm（平均17.30 μm），寬12.00 μm～21.15 μm（平均15.00 μm），分布較多（見圖2 d～f）。吸器透明，呈不規(guī)則形（見圖2 g～h），卵孢子未見。

a.孢囊梗；b.孢囊梗頂部；c.孢囊?；?；d～f.孢子囊；g～h.吸器。

圖2 鳳仙花霜霉病病原菌形態(tài)

本研究中的鳳仙花霜霉病病原菌孢囊梗長度（90.00 μm～530.12 μm），與《中國真菌志·第六卷·霜霉目》記載的鳳仙花軸霜霉孢囊梗長（425.00 μm～820.12 μm）相差較大，同2014年夏威夷群島報(bào)道的鳳仙花軸霜霉孢囊梗長度（94.00 μm～300.00 μm）更為接近[12]。以上三者兩兩之間孢囊梗長度差異較大，其余指標(biāo)則無明顯差別，根據(jù)形態(tài)和寄主，擬鑒定本研究中的鳳仙花霜霉病病原菌為鳳仙花軸霜霉（）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序得到的cox2、ITS和LSU基因序列分別用DNASTAR中的SeqMan進(jìn)行拼接，其長度分別為416 bp、1 409 bp和1 213 bp。將它們分別在NCBI庫中進(jìn)行BLAST檢索，3個(gè)序列均與鳳仙花軸霜霉的相似度最高，分別為97.36%、99.72%和99.92%。下載相關(guān)序列（見表1），在MEGAX軟件中利用鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

構(gòu)建cox2-ITS-LSU多基因序列聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，發(fā)育樹分為兩個(gè)大支，一支為寄生在鳳仙花屬不同植物上的鳳仙花軸霜霉的4個(gè)菌株，另一支為葡萄生單軸霉（）、本菌和水金鳳上的鳳仙花軸霜霉。本菌FXHSM與來自水金鳳上的鳳仙花軸霜霉相似度最高，為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為鳳仙花軸霜霉。

表1 本研究構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用序列GenBank菌株號(hào)和登錄號(hào)

圖3 菌株FXHSM的cox2-ITS-LSU基因片段聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

鳳仙花是一種重要的觀賞植物，但是由于種植越來越多，病害發(fā)生也越來越多，而霜霉病是鳳仙花最嚴(yán)重的病害。為防止病害的發(fā)生，近年來，科學(xué)家們培育出了抗鳳仙花霜霉病的雜交品種——非洲鳳仙，其花色艷麗，易于栽培管理，有很高的生產(chǎn)性。發(fā)生在鳳仙花上的軸霜霉屬菌物有三種，分別為、和，明確鳳仙花霜霉病病原菌的類型，有助于進(jìn)一步了解病害的發(fā)生、發(fā)展及致病機(jī)理，以便快速采取相應(yīng)的防治措施。

本研究通過形態(tài)學(xué)觀察和指標(biāo)測量顯示病原菌孢囊梗直立，分枝近直角，符合軸霜霉屬的特征。但是本研究測得的孢囊梗長度為90.00 μm～530.12 μm（平均435.94 μm），與《中國真菌志·第六卷·霜霉目》中記載的發(fā)生在我國西南地區(qū)的鳳仙花軸霜霉孢囊梗長度（425.00 μm～820.12 μm）相比明顯較短，而2014年夏威夷群島報(bào)道的鳳仙花霜霉病病原菌孢囊梗長度為94.00 μm～300.00 μm。三者均為寄生在鳳仙花上的軸霜霉，但孢囊梗長度有較大的差別，可能與病原菌生長的地理環(huán)境、測量中的差異有關(guān)。cox2-ITS-LSU多基因序列聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，本研究中的病原菌在分子水平與鳳仙花軸霜霉相應(yīng)序列的相似性較高，結(jié)合田間癥狀，確定了甘肅省隴西縣首陽藥圃園內(nèi)的鳳仙花霜霉病病原菌為鳳仙花軸霜霉。

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S436.8

A

2095-1205(2023)11-25-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2023.11.07

國家自然科學(xué)基金（31960004）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目“名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)”（2060302）；西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項(xiàng)目（Xbzzy-2022- 02）；道地藥材生態(tài)種植及質(zhì)量保障項(xiàng)目（國中醫(yī)藥科技〔2020〕153號(hào)）；甘肅省2021年度優(yōu)秀研究生“創(chuàng)新之星”（2021CXZX753）

高國香（1997—），女，漢族，甘肅蘭州人，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)樗幱弥参锉Ｗo(hù)與微生物開發(fā)利用。

王艷（1978—），女，漢族，安徽碭山人，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锉Ｗo(hù)與微生物開發(fā)利用。