P16/Ki-67雙染診斷宮頸上皮內(nèi)病變的價(jià)值及與宮頸活檢的一致性分析*

錢(qián)秀紅,邱承敏

上海市松江區(qū)中心醫(yī)院病理科,上海 201600

宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,可使患者出現(xiàn)陰道不規(guī)則流血、白帶異常、腰腹酸痛等癥狀,若治療不及時(shí),還可能引起多器官功能衰竭,甚至危及患者生命[1]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是由宮頸不典型增生連續(xù)發(fā)展至宮頸癌的過(guò)程。宮頸不典型增生是一種癌前狀態(tài),包括宮頸上皮內(nèi)病變(CIN)Ⅰ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)3個(gè)等級(jí),若未能及時(shí)采取有效的干預(yù)措施,則其惡變率分別可達(dá)15%、30%、60%[2]。因此,尋找有效的診斷方法早期發(fā)現(xiàn)高?；颊?并給予規(guī)范、科學(xué)的干預(yù)措施對(duì)防治宮頸癌具有重要意義。自1950年初宮頸巴氏涂片用于宮頸癌篩查以來(lái),宮頸癌的早期病變檢出率已明顯提升了,宮頸癌病死率大大降低,但傳統(tǒng)巴氏涂片的假陽(yáng)性率約為30%,假陰性率為15%～50%,診斷準(zhǔn)確度仍不理想[3]。隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展,宮頸薄層細(xì)胞學(xué)檢查被逐漸應(yīng)用于宮頸癌篩查,通過(guò)將宮頸內(nèi)、外細(xì)胞刷洗在細(xì)胞保存液中,并采用計(jì)算機(jī)控制程序化處理碎片,分離上皮細(xì)胞與血液、黏液,再均勻平鋪于玻片上觀察。與傳統(tǒng)巴氏涂片相比,該檢查方式具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、背景清晰易辨等優(yōu)點(diǎn),便于更好地發(fā)現(xiàn)CIN[4]。然而,宮頸薄層細(xì)胞學(xué)檢查不典型鱗狀細(xì)胞時(shí),易出現(xiàn)模棱兩可的診斷結(jié)果,如何篩查不典型鱗狀細(xì)胞的CIN患者仍值得探討。

近年研究表明,人乳頭瘤病毒(HPV)與CIN及宮頸癌存在關(guān)系,尤其是HPV-16、18型等高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV),其中約90%的宮頸鱗狀上皮癌患者可檢出HR-HPV,HPV-16檢出率超過(guò)70%[5-6]。而P16已被證實(shí)在HR-HPV感染中高表達(dá),被認(rèn)為是CIN的替代標(biāo)志物[7]。但P16高表達(dá)不僅存在于異常增生的細(xì)胞中,也存在于子宮內(nèi)膜細(xì)胞、輸卵管化生細(xì)胞及正常子宮頸柱狀細(xì)胞中,特異性較低。Ki-67是一種核抗原和細(xì)胞增殖標(biāo)志物,正常生理狀態(tài)下,Ki-67與P16相互排斥。因此,有研究認(rèn)為,細(xì)胞內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)Ki-67和P16高度表達(dá)則預(yù)示著細(xì)胞周期失調(diào),可能發(fā)展為HR-HPV感染[8]。基于此,本研究以疑似CIN患者為研究對(duì)象,探討P16/Ki-67雙染診斷CIN的價(jià)值及分析其與宮頸活檢的一致性,以期為CIN患者的診療提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2021年11月至2023年4月上海市松江區(qū)中心醫(yī)院的92例疑似CIN患者為研究對(duì)象,年齡31～69歲,平均(46.38±7.63)歲;體重指數(shù)19～29 kg/m2,平均體重指數(shù)(25.61±2.18)kg/m2;臨床癥狀:白帶增多46例,同房出血10例,白帶夾血28例,絕經(jīng)后出血4例,其他4例。

1.2入組標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均完成HR-HPV、P16/Ki-67雙染檢查;(2)接受宮頸活檢;(3)檢測(cè)報(bào)告完整;(4)患者或家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)檢測(cè)前接受放射治療、化學(xué)治療或生物免疫治療;(2)合并宮頸息肉、宮頸尖銳濕疣等其他宮頸疾病;(3)合并自身免疫性疾病;(4)合并嚴(yán)重肝腎功能異常;(5)既往有子宮切除治療史或存在其他子宮破壞性治療;(6)合并認(rèn)知功能障礙或精神異常;(7)妊娠或哺乳期女性。

1.3方法 囑咐受檢者檢查前2～3 d禁止性生活,以及陰道用藥、婦科檢查等。受檢者取膀胱截石位,使用陰窺器充分暴露宮頸,采用細(xì)胞刷收集宮頸細(xì)胞,置入保存液中于4 ℃環(huán)境下保存待測(cè)。

1.3.1HR-HPV DNA分析 取1 mL細(xì)胞學(xué)標(biāo)本,采用cobas HPV檢測(cè)法(美國(guó)Roche Molecular Systems公司)進(jìn)行HR-HPV檢測(cè)和基因分型。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和自動(dòng)制樣技術(shù)檢測(cè)14種HR-HPV基因型,分別為HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型,DNA提取采用KG203快速DNA提取檢測(cè)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司],DNA擴(kuò)增采用T100PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3.2P16/Ki-67雙染 取保存液中剩余細(xì)胞學(xué)標(biāo)本置于離心管中,以2 500 r/min離心10 min,去除上層液體,保留底部沉渣,加入“細(xì)胞快速固定劑組合物”(本院專(zhuān)利)使沉渣快速凝聚成團(tuán),取出后用濾紙紗布包好置于包埋盒中,中性福爾馬林固定不少于1 h,置于脫水機(jī)常規(guī)脫水,石蠟包埋,以4 μm的厚度連續(xù)切片石蠟標(biāo)本2張,一張切片行常規(guī)HE染色,另一張切片采用P16/Ki-67檢測(cè)試劑盒(河南賽諾特生物),遵循說(shuō)明書(shū)行手工免疫組織化學(xué)雙重染色,最后用水性封片劑封片,自然風(fēng)干后讀取檢測(cè)結(jié)果。判讀標(biāo)準(zhǔn):1個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)P16信號(hào)、Ki-67信號(hào)胞核紅染和胞質(zhì)棕染視為陽(yáng)性;P16信號(hào)、Ki-67信號(hào)均不顯色或單獨(dú)顯色則視為陰性。所有載玻片均由2名資深病理醫(yī)師進(jìn)行盲檢。見(jiàn)圖1、2。

圖1 病例1細(xì)胞塊P16/Ki67雙染(×200)

圖2 病例2細(xì)胞塊P16/Ki-67雙染(×200)

1.3.3宮頸活檢 由具有5年以上經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師采用德國(guó)萊斯康公司生產(chǎn)的光學(xué)電子陰道鏡(LEISEGANG-3ML型)進(jìn)行宮頸活檢,受檢者取膀胱截石位,陰窺器輔助暴露宮頸,清理宮頸表面分泌物,取3%～5%的冰醋酸涂抹于宮頸表面,觀察宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)、柱狀上皮、鱗狀上皮等部位的宮頸上皮表面構(gòu)型、血管形態(tài)、邊界清晰度,并進(jìn)行異常陰道鏡圖像篩查,再于宮頸涂抹2%的盧戈碘液,進(jìn)一步觀察病變,依據(jù)患者個(gè)體情況選擇單一陰道鏡檢查取材或?qū)m頸管搔刮術(shù)取材,由資深病理醫(yī)師判讀結(jié)果,完成CIN診斷,并判定CIN分級(jí)。陰道鏡圖像判定標(biāo)準(zhǔn):陰道鏡圖像鎖定范圍內(nèi)存在醋酸白斑、白色上皮、鑲嵌、異型血管、點(diǎn)狀血管及碘陰性區(qū)、白環(huán)/白色腺體、真性糜爛等視為異常;受檢者宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)、柱狀上皮、原始鱗狀上皮的陰道鏡圖像鎖定范圍內(nèi)無(wú)任何病變跡象視為未發(fā)生異常。CIN分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)[9]:依據(jù)國(guó)際宮頸病理與陰道鏡聯(lián)盟制定的CIN診斷標(biāo)準(zhǔn)判定CIN分級(jí),所有診斷均依據(jù)受檢者宮頸臨床表現(xiàn)、顏色及醋酸反應(yīng)、位置、邊界清晰度、表面構(gòu)型、病變面積和既往資料等綜合判斷。受檢者宮頸存在輕度不典型增生為CIN Ⅰ級(jí),受檢者宮頸存在中度不典型增生為CIN Ⅱ級(jí),受檢者宮頸存在重度不典型增生和原位癌為CIN Ⅲ級(jí)。見(jiàn)圖3、4。

圖3 病例1細(xì)胞塊HE切片(×100)

圖4 病例2細(xì)胞塊HE切片(×100)

1.4觀察指標(biāo) (1)統(tǒng)計(jì)宮頸活檢結(jié)果。(2)以宮頸活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),分析HR-HPV、P16/Ki-67雙染檢查診斷CIN的效能。(3)分析HR-HPV、P16/Ki-67雙染檢查評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢的一致性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);繪制受試者工作特征(ROC)曲線分析HR-HPV、P16/Ki-67雙染診斷CIN的價(jià)值,曲線下面積(AUC)≤0.50視為無(wú)診斷價(jià)值;0.500.9視為診斷價(jià)值較高;HR-HPV、P16/Ki-67雙染檢查評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢的一致性,采用Kappa一致性檢驗(yàn),Kappa>0.75表明一致性極好,0.40～0.75表明一致性較為理想,<0.40表明一致性差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1宮頸活檢結(jié)果 宮頸活檢結(jié)果顯示,92例疑似CIN患者中陽(yáng)性74例(80.43%),其中CIN Ⅰ級(jí)26例,Ⅱ級(jí)32例,Ⅲ級(jí)16例;陰性18例(19.57%)。

2.2HR-HPV、P16/Ki-67雙染檢查診斷CIN的價(jià)值 以宮頸活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),P16/Ki-67雙染診斷CIN的準(zhǔn)確度高于HR-HPV檢查(P<0.05);兩組診斷靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); ROC曲線分析結(jié)果顯示,HR-HPV、P16/Ki-67雙染診斷CIN的AUC分別為0.760、0.890,均具有一定診斷價(jià)值。見(jiàn)表1～4。

表1 HR-HPV檢查診斷CIN的價(jià)值(n)

表2 P16/Ki-67雙染檢查診斷CIN的價(jià)值(n)

表3 HR-HPV、P16/Ki-67雙染對(duì)CIN的診斷效能(%)

表4 HR-HPV、P16/Ki-67雙染診斷CIN的效能

2.3HR-HPV、P16/Ki-67雙染檢查評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢的一致性 HR-HPV評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢一致性較為理想(Kappa=0.707,P<0.05),P16/Ki-67雙染檢查評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢的一致性極好(Kappa=0.832,P<0.05)。見(jiàn)表5、6。

表5 HR-HPV評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢的一致性(n)

表6 P16/Ki-67雙染檢查評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢的一致性(n)

3 討 論

現(xiàn)階段,宮頸癌仍是威脅我國(guó)女性健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題,積極探索合適的宮頸癌篩查方法十分必要。目前,發(fā)達(dá)國(guó)家常采用HPV檢查聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢查篩查宮頸癌,診斷準(zhǔn)確性較高,但該檢查方式價(jià)格高昂,且對(duì)醫(yī)生專(zhuān)業(yè)技能要求較高,導(dǎo)致其難以在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用[10]。宮頸活檢是臨床診斷宮頸癌的金標(biāo)準(zhǔn),但該檢查方式屬有創(chuàng)性操作,會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生一定創(chuàng)傷,易誘發(fā)宮頸出血或?qū)m頸炎癥,不適用于宮頸癌普查[11]。因此,積極探索無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確、價(jià)格低廉的宮頸疾病篩查方式成為研究熱點(diǎn)。

當(dāng)前,宮頸薄層細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HR-HPV檢測(cè)是臨床篩查宮頸癌的重要手段,但宮頸薄層細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)病理科醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)依賴(lài)性較強(qiáng),診斷結(jié)果具有較高主觀性,靈敏度較低,易出現(xiàn)漏診情況;HR-HPV檢測(cè)難以區(qū)分轉(zhuǎn)化型HR-HPV感染和一過(guò)性HR-HPV感染[12]。HR-HPV陽(yáng)性、宮頸薄層細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果陰性在臨床較為常見(jiàn),大量陰道鏡轉(zhuǎn)診易造成過(guò)度醫(yī)療。因此,尋找一種分流HR-HPV陽(yáng)性、宮頸薄層細(xì)胞學(xué)檢查陰性患者的客觀管理方法,明確CIN風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)指標(biāo)具有重要價(jià)值。

近年來(lái),P16/Ki-67雙染檢查逐漸應(yīng)用于疑似CIN患者中,且取得理想診斷效能。P16蛋白是多種腫瘤抑制基因所編碼的蛋白,是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性抑制劑,該蛋白高度表達(dá)表明宮頸細(xì)胞處于細(xì)胞周期阻滯期[13]。Ki-67是在分裂細(xì)胞中表達(dá)的一種核蛋白,能夠反映細(xì)胞增殖活躍和細(xì)胞周期進(jìn)展,其染色陽(yáng)性表示宮頸細(xì)胞處于細(xì)胞周期的增殖期[14]。LORENZI等[15]研究指出,P16/Ki-67雙染陽(yáng)性是檢測(cè)宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的準(zhǔn)確工具。TAKACS等[16]研究表明,P16/Ki-67雙染檢查能夠確定高級(jí)別宮頸病變。本研究對(duì)比HR-HPV檢查與P16/Ki-67雙染檢查診斷CIN,結(jié)果顯示,以宮頸活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),P16/Ki-67雙染檢查診斷CIN的準(zhǔn)確度(89.13%)高于HR-HPV檢查(78.26%)。P16能夠引起細(xì)胞周期紊亂,介導(dǎo)細(xì)胞的無(wú)限增殖,在CIN診斷、評(píng)估中應(yīng)用廣泛。有研究指出,P16是一種抑癌基因,參與細(xì)胞周期的調(diào)控,在CIN的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用,P16持續(xù)高表達(dá)能夠影響腫瘤細(xì)胞活性及細(xì)胞周期[17]。國(guó)外研究表明,P16被發(fā)現(xiàn)能轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的異常細(xì)胞,在一定程度上提示宮頸病變[18]。但在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中P16具有較強(qiáng)的非特異性著色,在發(fā)育不良的細(xì)胞、萎縮細(xì)胞或正?；?xì)胞中均可發(fā)現(xiàn)P16高表達(dá),甚至染色于宮頸正常柱狀細(xì)胞及子宮內(nèi)膜細(xì)胞中,而在未經(jīng)處理的液基細(xì)胞標(biāo)本中,P16陽(yáng)性率超過(guò)80%。此外,P16染色結(jié)果判讀需結(jié)合細(xì)胞形態(tài),增加閱片醫(yī)師工作量,單純P16染色仍未能獲得理想效果。一般情況下,Ki-67屬增值性細(xì)胞核抗原,僅在G0期表達(dá)缺失,是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物,在惡性腫瘤輔助診斷及預(yù)后評(píng)估中應(yīng)用廣泛[19]。正常情況下,Ki-67和P16表達(dá)相互制約,不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)于同一細(xì)胞中。當(dāng)Ki-67和P16同時(shí)染色陽(yáng)性時(shí)則表明細(xì)胞周期調(diào)控失衡,提示HPV感染,高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變可能性較大,且可能發(fā)展為宮頸癌[20]。因此,P16/Ki-67雙染能夠進(jìn)一步診斷病變細(xì)胞,且不依賴(lài)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè),能夠保證檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性和客觀性,便于更好地區(qū)分假陽(yáng)性和真陽(yáng)性結(jié)果,在臨床診療中具有重要指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果還顯示,P16/Ki-67雙染檢查評(píng)估CIN分級(jí)與宮頸活檢的一致性極好。考慮其原因在于,良性宮頸組織與惡性宮頸組織增殖情況不同,正常細(xì)胞需更新?lián)Q代,但細(xì)胞增值率不足3%,而良性腫瘤增值率在5%～10%,惡性腫瘤增值率則超過(guò)10%,且多數(shù)情況下Ki-67可隨腫瘤細(xì)胞惡性程度增高而增殖[21]。P16/Ki-67雙染診斷靈敏度及特異度均較高,能夠提高宮頸癌篩查效能,預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)展方向,提高疾病早期檢出率。此外,P16/Ki-67雙染檢查是無(wú)需依賴(lài)細(xì)胞形態(tài)學(xué),對(duì)儀器、設(shè)備要求較低,學(xué)習(xí)周期較短,可有效減輕檢驗(yàn)人員工作強(qiáng)度及壓力,節(jié)約醫(yī)療資源。

綜上所述,P16/Ki-67雙染在CIN中具有較高診斷價(jià)值,在判定CIN分級(jí)中與宮頸活檢一致性極好,可作為一種有效的患者分流工具或細(xì)胞聯(lián)合篩查工具,能夠相對(duì)客觀、明確地幫助醫(yī)師判斷是否需要做進(jìn)一步檢查,為臨床診療提供依據(jù)。