姜荷花桑巴雜種后代鑒定及遺傳多樣性

柯玲俊，彭坤樺，陸鑾眉，余惠文*

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.閩臺(tái)特色園林植物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363000）

姜荷花（Curcumaalismatifolia）為姜科姜黃屬球根花卉，在夏秋季節(jié)開花，其不育苞片形態(tài)類似荷花，花形一般較大，具有顏色艷麗、瓶插期長(zhǎng)的特點(diǎn).因姜荷花具有形花色優(yōu)美，觀賞價(jià)值高；花期長(zhǎng)，在熱帶亞熱帶適種地區(qū)花期可從5 月一直持續(xù)到11 月；種球不易發(fā)生退化現(xiàn)象，病蟲害少，易栽培等優(yōu)點(diǎn)，近年來作為園林花境、花壇、盆花以及鮮切花等被廣泛推廣應(yīng)用.但當(dāng)前國(guó)內(nèi)姜荷花品種資源的數(shù)量較少，一定程度上限制了姜荷花的市場(chǎng)應(yīng)用.雜交育種是選育姜荷花新品種行之有效的一種方法[1]，而雜種后代及時(shí)的甄別，去偽存真，是進(jìn)行雜交育種工作的重要環(huán)節(jié).

SSR (simple sequence repeats)即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是一種以特異引物PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù).SSR分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析及育種研究.胡偉等[2]進(jìn)行了姜黃屬花卉種質(zhì)資源表型性狀分析的研究，對(duì)16 份姜黃屬植物的11 個(gè)數(shù)量性狀及7 個(gè)質(zhì)量性狀進(jìn)行因子和聚類分析，毛俐慧等和Taheri等以前期高通量測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SSR位點(diǎn)進(jìn)行發(fā)掘和分析，研究分析了姜荷花全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星序列的組成，開發(fā)了姜荷花SSR 標(biāo)記，且SSR 被用于研究姜荷花品種遺傳多樣性[3-6].這些研究為姜荷花雜種后代的鑒定及遺傳多樣性研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

分別采集來自漳州的29 份姜荷花桑巴×黃色夢(mèng)幻及27 份桑巴×清邁粉雜交子代，利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行真雜種鑒定，并開展遺傳多樣性分析，闡明其親緣關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)，為下一步進(jìn)行姜荷花新品種選育提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

所采用的樣品黃色夢(mèng)幻（'Siam TM Sitrone'）、桑巴（'Siam TM Samba'）、清邁粉（'Chiang Mai Pink'）、桑巴×黃色夢(mèng)幻、巴×清邁粉（圖1）及桑巴后代的采集來自均漳州.實(shí)驗(yàn)所用材料為各種質(zhì)材料生長(zhǎng)良好的健康葉片.

圖1 3份姜黃屬種質(zhì)資源親本及子代Fig.1 Three parents germplasms of Curcuma and offsprings

1.2 SSR及數(shù)據(jù)分析

在前人合成的84對(duì)SSR 引物[3-4]和閩南師范大學(xué)閩臺(tái)特色園林植物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的97對(duì)引物中篩選出了11 對(duì)條帶清晰，多態(tài)性高，重復(fù)性好的SSR 引物（表1）用于56 個(gè)姜黃屬種質(zhì)資源的真雜種鑒定和遺傳多樣性分析.PCR 擴(kuò)增體系為10 μL，由ddH2O 3.4 μL、正反向引物各0.3 μL、Thermo Scientific? DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 5 μL、濃度為100 ng/μL 的模板DNA 1 μL 組成.循環(huán)步驟為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性45 s，54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸5 min.用6%聚丙烯酰胺凝膠對(duì)變性PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè).運(yùn)用PowerMarker 3.25 分析多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)[7].用MEGA 6中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[8].

表1 SSR引物Tab.1 SSR markers used in this study

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 真雜種鑒定

利用5對(duì)具有父本特征條帶的SSR引物對(duì)以黃色夢(mèng)幻為父本和7對(duì)具有父本特征條帶的SSR引物對(duì)以清邁粉為父本的2 個(gè)雜交群體和對(duì)應(yīng)親本分別進(jìn)行分子鑒定.桑巴×黃色夢(mèng)幻的29 株F1 采用引物c20439、c20865、CuA51、CuA60、CuAl15 進(jìn)行鑒定.引物c20439 可將25 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為86.21%；引物c20865可將23株材料鑒定為真雜種，鑒定率為79.31%；引物CuA51可將23株材料鑒定為真雜種，鑒定率為79.31%；引物CuA60 可將26 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為89.66%；引物CuAl15 可將26株材料鑒定為真雜種，鑒定率為89.66%.5對(duì)SSR引物鑒定桑巴×黃色夢(mèng)幻的29株子代均為真雜種.

桑巴×清邁粉的27 株F1 采用引物c20865、c12365、c27068、CuA7、CuAl20、CuAl25、CuA62 進(jìn)行鑒定.引物c20865可將20株材料鑒定為真雜種，鑒定率為74.07%；引物c12365可將24株材料鑒定為真雜種，鑒定率88.89%；引物c27068可將19株材料鑒定為真雜種，鑒定率為70.37%；引物CuA7可將9株材料鑒定為真雜種，鑒定率為70.37%；引物CuAl20可將22株材料鑒定為真雜種，鑒定率為81.48%；引物CuAl25可將22 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為81.48%；引物CuA62 可將22 株材料鑒定為真雜種，鑒定率為81.48%.7對(duì)SSR引物鑒定桑巴×清邁粉的27株子代均為真雜種.

2.2 親緣關(guān)系分析

基于GenAlEx 6.5分別計(jì)算2個(gè)桑巴姜荷花雜交組合的子代間的遺傳距離，利用MEGA 6中的鄰接法（Neighbor-joining）法進(jìn)行親緣關(guān)系分析，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育聚類圖(圖2).桑巴×黃色夢(mèng)幻雜交后代29 份姜荷花種質(zhì)資源可分成兩個(gè)組群，其中：紅色部分為亞群1，綠色部分為亞群2.亞群1 包括9 個(gè)雜種，該9 個(gè)雜種與父母本遺傳距離較近，亞群2包括20份雜種，該20個(gè)雜種與父母本遺傳距離較遠(yuǎn)，這部分或產(chǎn)生綜合父母本優(yōu)良性狀的新品種的可能性更高.桑巴×清邁粉雜交后代27份姜荷花種質(zhì)資源可分成三個(gè)組群，紅色部分為亞群1，綠色部分為亞群2，藍(lán)色部分為亞群3.亞群1 包括9 個(gè)雜種，該9 個(gè)雜種與父本清邁粉遺傳距離較近，亞群2 包含4 個(gè)雜種，該4 個(gè)雜種與母本桑巴遺傳距離較近，亞群3 包括14 個(gè)雜種，與父母本遺傳距離較遠(yuǎn)，這部分或產(chǎn)生綜合父母本優(yōu)良性狀的新品種的可能性更高.

圖2 2組姜荷花子代種質(zhì)資源鄰接法聚類分析Fig.2 Neighbor-joining clustering analysis of 2 groups offspring germplasm resources of Curcuma alismatifolia.

2.3 遺傳多樣性分析

使用PowerMaker 軟件分析了桑巴后代56 份姜荷花種質(zhì)資源的遺傳多樣性.桑巴×黃色夢(mèng)幻雜交后代篩選出的引物見表2，基因多樣性平均值為0.696，最高的引物為CuA60（0.807）.雜合度平均值為0.755，最高的引物為CuAl15 和CuA60（0.903）.引物多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.646，其中PIC 最高的為CuA60（0.781）.桑巴×清邁粉雜交后代篩選出的引物見表3，基因多樣性平均值為0.744，其中基因多樣性最高的為CuA7（0.797）.雜合度平均值為0.640，其中雜合度最高的為CuA62（0.828）.引物多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.703，最高的引物為CuA7（0.766）.篩選出的11 對(duì)引物均為高多態(tài)性引物（PIC＞0.5）.

表2 桑巴×黃色夢(mèng)幻的SSR分析Tab.2 SSR analysis of 'Siam TM Samba' × 'Siam TM Sitrone'

表3 桑巴×清邁粉的SSR分析Tab.3 SSR analysis of 'Siam TM Samba' × 'Chiang Mai Pink'

3 討論

雜交是品種選育、群體構(gòu)建和重要基因定位等操作的基礎(chǔ).目前，雜交育種仍是新品種選育的有效手段，通過雜交重組可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)性狀基因的改良.但是在雜交過程中，人工操作不規(guī)范、自花授粉等原因易造成雜交后代混雜，因此對(duì)雜交后代進(jìn)行早期真雜種鑒定，淘汰假雜種是植物種質(zhì)創(chuàng)新工作中的重要環(huán)節(jié)，也能為后期其他分子標(biāo)記輔助育種如指紋圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等工作提供參考[9-10].種質(zhì)資源收集鑒定是育種工作的基石，而種質(zhì)資源的鑒定及優(yōu)良基因的發(fā)現(xiàn)，均離不開分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析.

SSR 標(biāo)記技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性高、成本較低，在種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性的研究中廣泛被應(yīng)用.賴小群等[11]應(yīng)用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行新臺(tái)糖25號(hào)×云蔗89-7真雜種鑒定.田春艷等[12]利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行甘蔗野生種割手密F1 代的鑒定和遺傳分析.桃汪陽(yáng)等[13]應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記鑒定黑麥草F1 代雜種鑒定.應(yīng)用EST-SSR 標(biāo)記進(jìn)行花楸樹和少葉花楸雜交F1 代群體的遺傳關(guān)系分析和雜種鑒定[14].李洋益等[15]利用ISSR引物分子標(biāo)記分析國(guó)產(chǎn)姜黃屬植物的遺傳多樣性等不同標(biāo)記類型以及表型分析.

本研究中應(yīng)用篩選的11 對(duì)SSR 標(biāo)記引物c20439、c20865、c12365、c27068、CuA7、CuA51、CuA60、CuA62、CuAl15、CuAl20和CuAl25均為高多態(tài)性引物其PIC值均高于0.5，將桑巴兩個(gè)雜交組合的56個(gè)雜種鑒定為真雜種.研究結(jié)果通過親緣關(guān)系分析和和遺傳多樣性分析表明姜荷花桑巴×黃色夢(mèng)幻和姜荷花桑巴×清邁粉后代類群具有較高的遺傳多樣性.研究中使用的SSR分子標(biāo)記僅能對(duì)子代進(jìn)行真雜種鑒定，未能對(duì)具有育種目標(biāo)性狀的子代進(jìn)行早期篩選和鑒定.因此，在未來的姜荷花相關(guān)研究中，可擴(kuò)大研究群體的范圍，選擇遺傳背景差異大且親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的姜荷花材料作為親本，根據(jù)育種目標(biāo)開發(fā)與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，在子代早期進(jìn)行鑒定和篩選，以此增加獲得優(yōu)勢(shì)雜種以及優(yōu)良性狀的姜荷花新品種的幾率，提高育種效率并加快育種進(jìn)程.