春砂仁精油對尼羅羅非魚幼魚生長、消化、抗氧化能力和血清生化指標(biāo)的影響

李成輝，董宏標(biāo)，鄭曉婷，桂福坤，曾祥兵，明俊超，陳 飛，陳 健，張家松

1.浙江海洋大學(xué)/國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316000

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3.海南省深遠海漁業(yè)資源高效利用與加工重點實驗室，海南 陵水 572426

4.廣東南灣水產(chǎn)有限公司，廣東 陽江 529500

5.陽江市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣東 陽江 529500

尼羅羅非魚 (Oreochromisniloticus) 原產(chǎn)于非洲，屬鱸形目、麗魚科、羅非魚屬，具有食性雜、生長快、無肌間刺、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點，現(xiàn)已成為聯(lián)合國糧農(nóng)組織 (Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO) 向全球推廣養(yǎng)殖的品種[1]。我國是世界上最大的羅非魚生產(chǎn)和出口國，隨著羅非魚養(yǎng)殖集約化程度不斷提高，生產(chǎn)上追求低成本和高產(chǎn)出[2]，長期高能量和較高比例植物蛋白飼料的過度投喂可能導(dǎo)致魚體出現(xiàn)如脂質(zhì)蓄積、腸道抗氧化能力下降等不良癥狀[3-4]。此外，病原、霉變飼料、污染物或抗生素等均會造成魚體腸道黏液層損傷，使得共生和病原微生物直接接觸腸上皮，進而誘導(dǎo)腸道組織損傷[5-8]。因此，改善魚類腸道健康和促進魚類消化及脂質(zhì)代謝能力可從根本上助力羅非魚集約化養(yǎng)殖的發(fā)展。

春砂仁 (Amomumvillosum) 是廣東省陽春市的地方特色產(chǎn)品，著名“四大南藥”之一，其味辛、性溫且芳香，具行氣調(diào)中、和胃醒脾和化濕消滯的功效[9-10]。中醫(yī)上常用于治療胃腸疾病，其主要功能成分為其中的天然揮發(fā)油，且砂仁莖葉中的揮發(fā)性成分與砂仁果實中的相似。大量研究表明天然植物精油在抗氧化、抗炎、降血脂、促進傷口愈合和提高機體免疫力等方面療效顯著[11-14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，春砂仁精油能提高大鼠 (Rattusnorvegicus) 潰瘍愈合百分率，顯著增強血清的抗氧化能力[15]；促進功能性消化不良大鼠的胃排空[16]；抑制胃癌細胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡[17]。此外，春砂仁精油還能夠有效抑制大鼠內(nèi)源性脂質(zhì)的合成，降低血清脂質(zhì)水平，預(yù)防脂肪肝的形成[18]。

目前，春砂仁精油在水產(chǎn)動物中尚未見相關(guān)的應(yīng)用報道。本研究通過拌喂不同劑量的春砂仁精油，探究其對羅非魚幼魚生長性能、消化能力、腸道抗氧化能力、血清肝功能和脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響，以為春砂仁在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

實驗用春砂仁精油由陽江市百盛園實業(yè)有限公司提供，為春砂仁莖葉抽提物，其主要成分如表1 所示 (送檢，中國廣州分析測試中心，GC-MS法)。實驗用基礎(chǔ)飼料為淡水魚膨化配合飼料 (江門海大飼料有限公司)。將春砂仁精油稱質(zhì)量后添加蒸餾水至15 mL 振蕩成乳液，混勻后用高壓噴壺按每公斤飼料 0、2.0、4.0 和8.0 g 的劑量均勻噴涂于基礎(chǔ)飼料表面 [最終含水率 (w)≤11.0%]，密封盒盛放，每日投喂前現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 春砂仁精油化學(xué)成分Table 1 Main chemical composition in essential oil of A.villosum

1.2 實驗設(shè)計與養(yǎng)殖管理

實驗用羅非魚幼魚的獲取、暫養(yǎng)和養(yǎng)殖均于廣東南灣水產(chǎn)有限公司 (廣東陽江) 進行。暫養(yǎng)2 周后，隨機選取體表無損傷、規(guī)格相近的健康羅非魚幼魚480 尾 [(20.34±2.08) g]，分為 4 組，即對照組(0 g·kg-1)、低劑量 (2 g·kg-1)、中劑量 (4 g·kg-1) 和高劑量組 (8 g·kg-1)，每組 4 個重復(fù)，每個重復(fù) 30 尾魚，室內(nèi)飼養(yǎng)于16 個300 L 的黑色圓桶中，養(yǎng)殖實驗為期8 周，分別投喂對應(yīng)劑量飼料，日飽食投喂1 次 (9:00) 并記錄投喂量 (投喂30 min 后通過50 目篩網(wǎng)回收殘餌，70 ℃烘干，殘餌量用飼料溶失率校正，測定溶失率時隨機在6 個無魚的缸中各放入1 份稱好的飼料，30 min 后回收，70 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，溶失率為4.29%)。暫養(yǎng)和養(yǎng)殖期間為自然光周期，日換水量為30% (11:00)，水溫 (27±2) ℃ (期間通過暖風(fēng)機根據(jù)實際溫度調(diào)整)，溶解氧質(zhì)量濃度≥4.5 mg·L-1(氣石增氧)，pH 為7.8±1，氨氮質(zhì)量濃度≤1 mg·L-1，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度≤0.02 mg·L-1。

1.3 樣品采集

在養(yǎng)殖實驗結(jié)束后測量和取樣，操作前停喂1 d，每個重復(fù)組隨機取6 尾實驗魚，經(jīng)300 mg·L—1MS-222 浸泡麻醉后，測其體長和體質(zhì)量；隨后使用 1.5 mL 無菌注射器從尾靜脈取血 (混合全血樣品在4 ℃下靜置1 h，待血液分層后，3 000 r·min—1離心10 min，收集血清于1.5 mL 離心管，-80 ℃保存)，用于血清生化指標(biāo)分析；將實驗魚置冰盤上剖取胃和腸道組織于2 mL 離心管中，-80 ℃保存，用于消化酶和腸道抗氧化能力分析。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長指標(biāo)測定

依照以下公式計算體質(zhì)量增長率 (Weight gain rate,RWG,%)、特定生長率 (Specific growth rate,RSG,%·d-1) 、攝食率 (Feeding rate,RF,%)、肥滿度(Condition factor,CF,g·cm-3) 和餌料系數(shù) (Feed conversion ratio,FCR)。

式中：Wt和W0分別為羅非魚幼魚的終末和初始體質(zhì)量；t為實驗時間 (56 d)；L為魚體長 (cm)；F為飼料攝入量 (g)。

1.4.2 血清生化指標(biāo)測定

血清中總蛋白 (TP)、球蛋白 (GLOB)、堿性磷酸酶 (ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、總膽固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-CH) 和低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-CH) 等指標(biāo)，采用專用試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司) 于全自動生化分析儀 (BS200) 檢測。

1.4.3 消化道抗氧化指標(biāo)和消化酶的測定

每個組織樣品取0.1 g 與0.9 mL 的PBS 緩沖液混合制成勻漿，3 500 r·min—1、4 ℃離心10 min 后取上清液分別測定胃蛋白酶 (Pep)、胃淀粉酶 (GAMS)、腸淀粉酶 (I-AMS) 和腸脂肪酶 (LPS) 等消化酶指標(biāo)，以及總抗氧化能力 (T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD) 和丙二醛 (MDA) 等腸道抗氧化指標(biāo)，所有指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所試劑盒參照說明書進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示，用SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，Tukey's 法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 春砂仁精油主要化學(xué)成分分析

采用 GC-MS 法從春砂仁莖葉精油中共測出化合物25 種 (表1)，主要為烯萜類、醇類、醛類和酮類化合物，其中含量最高的是β-蒎烯 (44.67%)，其次是α-蒎烯、檜烯、檸檬烯等烯萜類物質(zhì)。

2.2 春砂仁精油對羅非魚幼魚生長的影響

如表2 所示，與對照組相比，各處理組羅非魚幼魚終末體質(zhì)量、終末體長、體質(zhì)量增長率和特定生長率均有所升高，且隨精油添加劑量的增加，呈先升后降的趨勢，而餌料系數(shù)呈先降低后升高的趨勢，其中低劑量組各項生長指標(biāo)均顯著優(yōu)于其他組(P<0.05)。

表2 春砂仁精油對羅非魚幼魚生長的影響Table 2 Effect of A.villosum essential oil on growth performance of tilapia

2.3 春砂仁精油對羅非魚消化酶的影響

如圖1 所示，低劑量組羅非魚幼魚各項消化酶指標(biāo)均顯著高于其他組 (P<0.05)，而其余組間差異不顯著。隨著精油添加劑量的增加，胃蛋白酶(Pep) 活性呈先升后降的趨勢；胃淀粉酶 (GAMS)、腸淀粉酶 (I-AMS) 和脂肪酶 (LPS) 活性則呈先升再降后升的波動趨勢。

圖1 春砂仁精油對羅非魚幼魚消化酶的影響注：字母不同表示同一時間各實驗組之間存在顯著性差異 (P<0.05)。后圖同此。Fig.1 Effects of A.villosum essential oil on digestive enzymes of juvenile tilapiaNote: Values with different letters represent significant differences at the same time (P<0.05).The same case in the following figure.

2.4 春砂仁精油對羅非魚幼魚腸道抗氧化能力的影響

如圖2 所示，隨著春砂仁精油添加劑量的增加，各實驗組羅非魚幼魚腸道中 T-AOC、SOD 和CAT 活性、GSH 濃度均呈先升后降的趨勢，且低劑量組顯著高于其他組 (P<0.05)；MDA 濃度隨精油劑量的增加呈降低趨勢，且高劑量組顯著低于對照組 (P<0.05)；其余各組腸道抗氧化指標(biāo)與對照組均無顯著性差異 (P>0.05)。

圖2 春砂仁精油對羅非魚幼魚腸道抗氧化指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of A.villosum essential oil on intestinal antioxidant capacity of juvenile tilapia

2.5 春砂仁精油對羅非魚幼魚血清肝功能和脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

2.5.1 對血清肝功能指標(biāo)的影響

如表3 所示，隨著春砂仁精油添加劑量的增加，各實驗組羅非魚幼魚血清中TP、GLOB 含量、ALP 和ALT 活性均呈先降低后升高的趨勢，其中，低劑量組TP 和GLOB 含量顯著低于其他組(P<0.05)。其他處理組血清肝功能指標(biāo)無顯著性差異 (P>0.05)。

表3 春砂仁精油對羅非魚幼魚血清肝功能指標(biāo)的影響Table 3 Effects of A.villosum essential oil on liver function index in serum of juvenile tilapia

2.5.2 對血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

如表4 所示，隨著春砂仁精油添加劑量的增加，各實驗組羅非魚幼魚血清中TG、TC、HDLCH 和LDL-CH 含量均呈先降后升的趨勢，其中，低劑量組T C 和L D L-C H 顯著低于其他組(P<0.05)，且高劑量組HDL-CH 顯著高于對照組(P<0.05)。其他處理組血清指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)。

表4 春砂仁精油對羅非魚幼魚血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響Table 4 Effects of A.villosum essential oil on lipid metabolism index in serum of juvenile tilapia

3 討論

3.1 春砂仁精油主要成分與功能

現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)證實，砂仁具有保護胃腸、抗炎、止痛、止瀉、抗菌和降血糖等作用[19-20]?？紤]春砂仁果實應(yīng)用于實際生產(chǎn)中成本較高的因素，本實驗采用春砂仁莖葉抽提揮發(fā)油，經(jīng)檢測分析，其主要成分為β-蒎烯、α-蒎烯和檜烯等，雖未檢測出砂仁果實揮發(fā)油中所含有的主要成分乙酸龍膽酯[21]，但其他功能成分均有檢出。臨床驗證表明，α-蒎烯和β-蒎烯具有抗凝血、抗腫瘤、保護胃腸道、抗炎鎮(zhèn)痛和抗氧化等諸多功效[22-24]。Salas-Oropeza 等[25]研究發(fā)現(xiàn)α-蒎烯能夠提高傷口愈合活性，加速皮膚傷口閉合并產(chǎn)生具有良好抗拉強度的疤痕。Santos 等[26]研究證明β-蒎烯對糖尿病大鼠有降血糖、降血脂和抗炎的作用。說明實驗用的春砂仁莖葉揮發(fā)油同樣具有抗氧化、保護胃腸道、抗炎和促進糖脂代謝等諸多功能。

3.2 春砂仁精油可提升羅非魚幼魚生長和消化能力

促消化是春砂仁精油腸胃保健功能的直觀體現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)10 g·kg-1的砂仁醇水提物在十二指腸給藥下有利于大鼠膽汁的分泌[27]。Jucá 等[28]亦報道α-蒎烯和β-蒎烯能夠促進大鼠胃竇組織P 物質(zhì) (Substance P) 與胃動素的釋放，加速大鼠胃和小腸的排空。邢蓮影等[29]研究發(fā)現(xiàn)砂仁葉油和砂仁水煎劑的作用一致，具有推進小腸運動的作用。本研究結(jié)果表明，低劑量 (2 g·kg-1) 處理組羅非魚幼魚胃中Pep、AMS 和腸中LPS、AMS 的活性相比于對照組均顯著升高 (P<0.05)，而中劑量 (4 g·kg-1)和高劑量 (8 g·kg-1) 處理組則無顯著性差異，說明拌喂適量的春砂仁精油能夠提高羅非魚幼魚的消化能力。

消化能力的提升有助于機體對營養(yǎng)的吸收，進而促進代謝和生長[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，春砂仁精油添加水平在2～8 g·kg-1時，羅非魚幼魚的終末體長、終末體質(zhì)量、體質(zhì)量增長率和特定生長率均呈先升后降的趨勢，而餌料系數(shù)則呈先降后升的趨勢，其中添加水平在2 g·kg-1時效果最佳，說明適量春砂仁精油能明顯改善羅非魚幼魚的生長狀況和飼料轉(zhuǎn)化利用率。推測這與低濃度的春砂仁精油保護腸道組織結(jié)構(gòu)完整，促進消化酶的分泌有關(guān)，進而提高了機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。有研究表明，春砂仁精油通過抑制三羧酸循環(huán) (TCA)，減少三磷酸腺苷 (ATP) 和活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生以及增強SOD 活性來誘導(dǎo)細菌死亡[31]，推測中高濃度的春砂仁精油可能會破壞腸道菌群結(jié)構(gòu)，引起致病菌感染，進而限制羅非魚的生長及消化能力。

3.3 春砂仁精油可提高羅非魚幼魚腸道抗氧化能力

普遍認為，植物精油具有抗氧化作用，常通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制細胞膜脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)氧化酶等途徑來實現(xiàn)[32-36]。T-AOC 從總體上反映了組織對自由基和活性氧類物質(zhì)的抵抗能力[37]，GSH 是細胞中重要的非酶內(nèi)源性抗氧化劑[38]，而MDA 是脂質(zhì)過氧化的次級產(chǎn)物，被用作細胞膜損傷的指標(biāo)[39]。SOD 和CAT 是兩種關(guān)鍵的抗氧化酶，起到清除活性氧自由基的作用[40]。本研究低劑量組中較高水平的SOD 和CAT 活性表明適量的春砂仁精油能夠提高抗氧化酶的活性，T-AOC和GSH 水平的升高說明其能夠提高羅非魚幼魚腸道的抗氧化和清除自由基能力。研究表明，檸檬烯和芳香醇等萜烯類物質(zhì)暴露在空氣中形成的氧化產(chǎn)物會導(dǎo)致接觸性過敏[41]，而過敏反應(yīng)中會伴隨組織細胞ROS 含量升高[42]。本研究中低劑量組MDA濃度未下降，推測可能是低劑量精油中部分萜烯類物質(zhì)氧化導(dǎo)致其清除腸道組織 ROS 的能力受限，而腸道MDA 濃度隨著精油劑量的增加而降低，推測這與高劑量春砂仁精油發(fā)揮自身清除ROS 的能力有關(guān)，進而導(dǎo)致細胞膜脂質(zhì)過氧化程度降低。

3.4 春砂仁精油可改善羅非魚幼魚血清肝功能指標(biāo)和脂質(zhì)代謝能力

魚類血清肝功能指標(biāo)能反映魚類肝臟的生理狀態(tài)和病理情況[43-45]，血清TP 由白蛋白 (ALB) 和GLOB 組成，ALB 主要由肝臟合成，GLOB 則由B 淋巴細胞合成[46-47]。有研究表明，春砂仁精油能夠改善小鼠的血清肝功能指標(biāo)，降低AST 和ALT 活性，改善衣霉素誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累[18,48]，推測低劑量的春砂仁精油可能通過促進脂質(zhì)代謝，減少肝臟脂質(zhì)累積，進而改善肝功能。本研究中，低劑量組羅非魚幼魚血清中的TP 和GLOB 含量較對照組顯著降低，ALP 和ALT 活性較對照組呈下降趨勢。

血脂水平的高低與機體脂質(zhì)代謝能力密切相關(guān)[49]。血清TC 濃度是評價機體脂質(zhì)代謝能力的重要指標(biāo)[50]，高密度脂蛋白 (HDL) 在血液中攜帶膽固醇后形成HDL-CH，由血液向肝臟輸送，是機體組織膽固醇的“清潔劑”，其含量越高，機體將膽固醇運回肝臟中的能力就越強，而低密度脂蛋白(LDL) 則攜帶膽固醇形成LDL-CH，由肝臟向血液輸送[51]。本實驗中，低劑量組羅非魚幼魚血清中TC 和LDL-CH 的水平顯著低于其他組 (P<0.05)，且隨著春砂仁精油添加劑量的增加，HDL-CH 的水平逐漸升高。這表明飼料中添加適量春砂仁精油具有促進脂質(zhì)代謝的功效。

4 結(jié)論

拌喂適量的春砂仁精油能顯著增強羅非魚幼魚的消化和腸道抗氧化能力，提升脂質(zhì)代謝水平，改善血清肝功能指標(biāo)，進而提高羅非魚幼魚的生長性能。在本實驗條件下，春砂仁精油的適宜添加劑量為2 g·kg-1。