基于網(wǎng)絡藥理學探究中藥沙苑子抗腫瘤的作用機制

王 茜，王 燁，李玉梅，王楚盈，楊 波

（長春中醫(yī)藥大學藥學院·吉林 長春·130117）

1 引言

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪 （Astragalus complanatus R.Br）的干燥成熟種子，在我國具有悠久的用藥歷史, 始載于《神農本草經(jīng)》，以蒺藜為名[1]。 屬藥食同源類藥材，其味甘，性溫，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)[2]。 主要用于治療早泄、腰痛、腎虛、小便不盡、白濁帶下等?，F(xiàn)代藥理學研究表明，其具有抗腫瘤、降壓降脂、保肝、抗輻射等作用[3]。

目前，癌癥（腫瘤疾病）已成為嚴重威脅人類健康和生命的一大疾病[4]，中醫(yī)學認為機體正氣不足是癌癥發(fā)生發(fā)展的根本原因之一，腎為先天之本，腎虛則一身正氣虧虛[5]?，F(xiàn)代研究表明沙苑子有抗腫瘤作用，但其發(fā)揮抗腫瘤的活性成分和作用機制尚不明確。沙苑子是補陽藥的一種，近年來對其活性成分也有不少的研究，由于其成分復雜，故在作用機制方面還尚未完全清晰， 有待進一步研究來促進沙苑子的開發(fā)應用。 近年來網(wǎng)絡藥理學的快速發(fā)展，已成為中醫(yī)藥研究的熱門工具， 以網(wǎng)絡藥理學為主題在知網(wǎng)上搜索，僅2021年就有2000 余篇。越來越多的中藥或復方制劑通過網(wǎng)絡藥理學對“藥物-疾病-靶點-通路”等復雜生物信息網(wǎng)絡關系的分析與研究，對作用機制進行模擬分析、預測探討，系統(tǒng)的表征藥物對疾病的干預與影響，通過網(wǎng)絡藥理學方法進行研究有利于揭示中藥的復雜作用機制[6]。 這種分析方法具有系統(tǒng)性和動態(tài)性的特點，與中藥防病治病的理論一致，為中藥現(xiàn)代化研究提供新的思路和方法[7]。因此，本研究致力于通過網(wǎng)絡藥理學方法，探討沙苑子治療腫瘤疾病的作用機制，系統(tǒng)的闡述沙苑子標志性成分作用與腫瘤疾病的作用機制，為深入開發(fā)利用中藥沙苑子提供理論依據(jù)。

2 方法與結果

2.1 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站和分析軟件

本篇文章使用的數(shù)據(jù)庫以及軟件如下：

2.2 沙苑子的活性成分及其作用靶點的篩選

使用傳統(tǒng)的中藥藥理平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)（中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺）[8]， 其數(shù)據(jù)庫包括500 味常用中藥，30069個中藥化合物。該數(shù)據(jù)庫自2012年面世以來，已引起學者們越來越多的重視，并被越來越多的醫(yī)藥研究工作者所使用。 TCMSP 能捕捉藥物、靶標和疾病之間的關系，包括化學物質、靶點和藥物靶點網(wǎng)絡，以及相關的藥物靶點網(wǎng)絡，涉及口服生物利用度、藥物相似度、腸上皮通透性、血腦屏障、水溶性等天然化合物的藥代動力學特性。因此，學者們可以根據(jù)自己的需要，利用具有相關性的藥物和吸收、 分布、 代謝、 排泄（ADME）等特征的復合物用于進行更深層次的研究。以沙苑子為關鍵詞進行檢索，篩選條件為口服利用度OB%≥30%和藥物相似性DL≥0.18， 篩選出沙苑子的有效活性成分以及對應靶點[9]。 使用Uniprot[10](https://www. uniprot. org/)數(shù)據(jù)庫中智人（英文選項）選項中的化合物數(shù)據(jù)庫與從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出的沙苑子有效化合物靶點進行比對篩選，去除其化合物中非人源有效化合物靶點[11]，以獲取從TCMSP 得到的藥物靶點基因符號和相關信息。

2.3 腫瘤疾病靶點的獲取

以tumour 為關鍵詞，分別在Genecards[12]（https://www.genecards.org/），OMIM，Disgenent（DisGeNET - a database of gene-disease associations）以上三個數(shù)據(jù)庫來檢索獲得所研究的相關腫瘤疾病靶點。 Genecards這個數(shù)據(jù)庫是一個免費搜索的綜合性網(wǎng)絡數(shù)據(jù)資料庫，提供所有注釋和預測的人類基因信息。 Genecards自動整合來自約150 個以基因為中心的數(shù)據(jù)庫資源，包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、遺傳學、臨床和功能等多方面的信息。 Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）[13]（https://omim.org/）中文意思是指“在線《人類孟德爾遺傳》”和“網(wǎng)上《人類孟德爾遺傳》”。 發(fā)布的這些年來一直在不斷地更新著所有Human 的遺傳基因和遺傳紊亂的數(shù)據(jù)庫，主要著眼于遺傳性的基因疾病，包括文本信息、相關參考信息、基因序列和相關其他數(shù)據(jù)庫。 Disgenent 整合了公共數(shù)據(jù)庫、GWAS 目錄、動物模型和科學文獻的數(shù)據(jù)。同時這個數(shù)據(jù)庫的收據(jù)還采用了統(tǒng)一的標準進行注釋。除此之外，還提供了一些初始指數(shù)和標準，用來幫助研究人員確定表型與基因型關系的等級高低，同時也可以通過Cytoscape 應用程序、web 接口、幾種編程語言和腳本來訪問這些重要信息。 Disgenent 是一個具有多功能的平臺，可用于不同的研究目的，包括特定的人類疾病的分子基礎及其并發(fā)癥的研究，致病基因特性分析，輔助構建藥物治療作用及藥物不良反應假說，疾病候選基因的驗證及文本挖掘方法的評價性能。

2.4 藥物與疾病共同靶點的篩選與蛋白質相互作用網(wǎng)絡的構建

將從三個疾病數(shù)據(jù)庫中篩選得到的相關的腫瘤靶點與TCMSP 中獲得的藥物靶點來進行比對，在STRING 數(shù)據(jù)庫中進行網(wǎng)絡構建， 這個數(shù)據(jù)庫是一個可以用來檢索已經(jīng)存在且被發(fā)現(xiàn)的目前蛋白和預測蛋白之間相互作用關系的數(shù)據(jù)庫。除了可以對這些蛋白生成一目了然的PPI 圖，還可以提供所傳輸?shù)挠嘘P蛋白的解析，向數(shù)據(jù)庫中導入上述所得沙苑子治療腫瘤疾病的有關靶點，以獲取這些蛋白質的相互作用有關內容信息。 STRING 數(shù)據(jù)庫設置后可以評判打分，一般是根據(jù)每一個輸入的蛋白質相互作用信息來進行，所評判的分值越高，則表明此蛋白質的相互作用置信度也就越高。為保證這個數(shù)據(jù)庫所輸出數(shù)據(jù)的可信度， 這個研究選取打分值高于高置信度的數(shù)據(jù)，由此標準來構建由導入基因表所表達產物組成的PPI網(wǎng)絡， 并采用Cytoscape3.70 軟件來進行網(wǎng)絡分析和可視化處理。

2.5 KEGG 通路富集分析

將2.4 項下得到的沙苑子中有效成分治療腫瘤疾病的基因靶點導入Metascape[15]平臺進行富集分析，選擇物種為“H. sapiens”，在分析出的前50 條通路里篩選腫瘤相關通路，并將篩選出的通路靶點進行整理。此時得到沙苑子治療腫瘤疾病的相關通路及對應的靶點， 作為數(shù)據(jù)文件。 將得到的相關數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.0 軟件得到疾病通路-靶點圖。 將上述得到的相關通路的富集名、 富集倍數(shù)、P 值和基因數(shù)整理好，應用于微生信網(wǎng)站的富集氣泡圖，即得到沙苑子治療腫瘤疾病的核心靶點KEGG 通路富集分析圖。

2.6 GO 富集分析

如2.4 項下所陳述， 將得到的基因靶點導入Metascape 平臺進行GO 富集分析。GO 富集分析包括GO 分子功能 （Molecular Functions）、GO 細胞組成（Cellular Components）、GO 生物學過程（Biological Process）。 GO Biological Processes 富集分析可以描述基因產物可能行使的分子功能；GO Cellular Components 富集分析可以描述基因產物所處的細胞環(huán)境；GO Molecular Functions 富集分析作用是描述基因產物所參與的生物學過程。 按%InGO 排序分別取三種GO 富集分析的前10 名，整合處理。 將上述得到的三種GO 富集分析的GO term、分類、富集分數(shù)整理好，應用于微生信網(wǎng)站的BP CC MF 三合一圖，得到沙苑子治療腫瘤疾病的BP CC MF 三合一圖。

3 實驗結果

3.1 沙苑子有效靶點篩選

使用TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)（藥理學數(shù)據(jù)庫中藥系統(tǒng)分析平臺），可以得到沙苑子中所含的有效成分為358 種，再通過該中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺以口服利用度OB%≥30%且藥物相似性DL≥0.18 為條件， 篩選出沙苑子有效活性化合物以及對應靶點， 得到活性成分10 個： 芒柄花素（formononetin）、 槲皮素 （quercetin）、 山奈酚（Kaempferol）、楊酶酮（Myricanone）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、β-谷甾醇 （beta-sitosterol）、 芳香素（Laricitrin）、a-D-吡喃葡萄糖苷（a-D-glucopyranoside）等，詳見表1。 通過Uniport 數(shù)據(jù)庫進行查找，去重，共得到276 個靶點蛋白。

表1 沙苑子有效成分及分子名稱

3.2 沙苑子治療腫瘤疾病靶點的收集

以tumour 為關鍵詞， 分別在Genecards（https://www.genecards.org/）， 人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man）（OMIM）（https://omim.org/），Disgenent（https://www.disgenet.org/browser/1/ 1/0/894/） 三個數(shù)據(jù)庫中進行搜索獲取相關腫瘤的疾病靶點。 在Genecards 中獲得腫瘤疾病靶點10859 個，取評分0.70 以上的2743 個；OMIM 數(shù)據(jù)庫中獲得345 個；Disgenent 數(shù)據(jù)庫中獲得968 個靶點，與藥物做交集得到126 個重復靶點，詳見表2。

表2 沙苑子與腫瘤的126 個交集靶點

3.3 沙苑子-有效成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建

將表2 得到的10 個藥物有效成分，126 個作用靶點以Excel 文件格式分別定義數(shù)據(jù)和相關文件，導入Cytoscape 軟件中繪制沙苑子-有效成分-靶點-腫瘤疾病網(wǎng)絡圖。 其中SYZ 代表沙苑子，和疾病有8 種有效成分含有共同靶點，詳見圖1。 由圖1 可知，中藥沙苑子治療腫瘤疾病的關鍵成分有a-D-glucopyranoside（a-D-吡喃葡萄糖苷）、山奈酚（Kaempferol）、毛蕊異黃酮 （Calycosin）、 槲皮素（quercetin）、 楊酶酮（Myricanone）、Laricitrin（芳香素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、芒柄花素（formononetin）。

圖1 沙苑子有效成分－靶點－疾病網(wǎng)絡圖

3.4 PPI 網(wǎng)絡及核心靶點篩選與分析

將3.2 項下經(jīng)去重后所得到的藥物與疾病的共同靶點導入到String 數(shù)據(jù)庫來創(chuàng)建PPI 的網(wǎng)絡通識圖，把所得網(wǎng)絡圖導入Cytoscape 軟件進行處理，詳見圖2。根據(jù)Degree 值篩選出前18 個關鍵靶點，詳見表3， 分別為過氧化物酶體增生激活受體（PPARG）TP53、白細胞介素-6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、前列腺素內過氧化物合成酶2（PTGS2）、缺氧誘導因子-1A（HIF1A）、CASP3、蛋白激酶（AKT1）、重組人白介素8（CXCL8）、MYC、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、白細胞介素-1B（IL1B）、表皮細胞生長因子（EGF）、ESR1、人表皮生長因子受體 （EGFR）、 血管內皮生長因子A（VEGFA）。

圖2 治療腫瘤疾病的靶蛋白PPI 網(wǎng)絡圖

表3 關鍵靶點拓撲參數(shù)

3.5 KEGG 通路富集分析

KEGG 富集到188 條信號通路， 其主要參與IL-17 信號通路、 糖尿病并發(fā)癥中的toll 樣受體信號通路、T 細胞受體信號通路、AGE-RAGE 信號通路、NFkappa B 信號通路、c 型凝集素受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路，詳見圖3、表4。

圖3 沙苑子治療腫瘤疾病的作用靶點KEGG 通路富集分析

表4 10 條通路的KEGG 富集分析信息

3.6 GO 富集分析

應用Metascape 數(shù)據(jù)平臺對沙苑子的124 個潛在靶點進行GO 基因富集分析。根據(jù)%InGO 篩選排名前10 位進行BP CC MF 三合一，多類型氣泡圖可視化處理。共得到生物學過程(biological process，BP)146 條功能條目，主要包括細胞增殖的負調控，細胞對脂質的反應，對營養(yǎng)水平層次的反應。細胞組成主要包括：膜微區(qū)、轉錄調節(jié)復合物、質膜蛋白復合物。 分子功能(molecular function，MF)共62 個，主要包括轉錄因子結合，蛋白結構域特異性結合，DNA 結合轉錄因子結合等。 選取這三種GO 分析過程排名前5 的列表，詳見表5。 運用Cytoscape3.7.0 軟件進行拓撲分析，構建通路-疾病靶點網(wǎng)絡圖，篩選關鍵靶點，詳見圖4。 用微生信數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)站（www.bioinformatics.com.cn/）制作GO、KEGG 富集氣泡圖以及三合一柱狀圖。通過富集因子數(shù)值大小來分析沙苑子治療腫瘤疾病的可能有效成分以及作用機制。

圖4 沙苑子有效成分治療腫瘤疾病的作用靶點GO 富集分析BP CC MF 三合一圖

表5 3 個過程中排名前5 的GO 富集分析信息

GO 功能富集分析多類型氣泡圖，詳見圖5。 GO功能富集分析多類型氣泡圖中，count 代表主要活性成分富集在該通路下的靶點數(shù)目。 圓點越大,富集越多,P 值越小,表明該生物功能的富集顯著性越可靠,顏色越紅。通過氣泡圖表明中藥沙苑子可以通過調控多種生物過程治療腫瘤疾病。

圖5 沙苑子有效成分治療腫瘤疾病的作用靶點GO 富集分析多類型氣泡圖

4 小結與討論

4.1 目前來說，腫瘤在人類的漫長發(fā)展中不知不覺的成為危害人類生命安全健康的最嚴重的疾病之一，預計到2030年全球腫瘤導致死亡的病例將高達3000多萬人，我們國家的腫瘤發(fā)病率也在逐年上升。 中醫(yī)藥在抗腫瘤方面的作用越來越占優(yōu)勢， 研究顯示，沙苑子是補益肝腎的代表性藥物之一，主要成分有黃酮類、有機酸、蛋白質、微量元素等成份。近年來，對沙苑子的藥理作用研究報道很多， 但在作用機制方面很少，尤其抗腫瘤方面的作用機制尚不明確，所以此方面的研究具有重要意義。

4.2 本研究經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選得到沙苑子有效成分8 個，腫瘤疾病的對應靶點共276 個，映射后得到沙苑子有效成分用于腫瘤疾病的潛在靶點126 個。中藥沙苑子治療腫瘤疾病的關鍵成分有槲皮素（quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、楊酶酮（Myricanone）、芒柄花素（formononetin）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、β-谷甾醇（betasitosterol）、a-D-吡喃葡萄糖苷 （a-D-glucopyranoside）、芳香素（Laricitrin）。 槲皮素是一類具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，能殺死自由基，防止機體脂質發(fā)生過氧化反應， 能夠直接抑制腫瘤生長，同時， 也可能通過抑制STAT3 信號通路來抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖[14,15]。山奈酚屬于黃酮類化合物，沙苑子黃酮可以明顯抑制血管瘤的生成，誘導人肝癌細胞的凋亡[16]。芒柄花黃素可能通過調節(jié)CyclinD1 使細胞周期停滯及減少Bcl-2 蛋白以誘導細胞凋亡，進而影響人體腫瘤細胞的生長與增殖[17]。 楊酶酮是從楊梅的樹皮中提取的一種黃酮醇類化合物，具有強抗氧化作用，避免機體產生大量氧化中間產物妨礙創(chuàng)傷修復形成腫瘤細胞[18]。

4.3 本研究發(fā)現(xiàn)沙苑子治療腫瘤疾病的關鍵靶點有蛋白激酶、TP53、腫瘤壞死因子、前列腺素內過氧化物合成酶2、血管內皮生長因子、白細胞介素-6、CASP3、EGFR、CXCL8、MYC、EGF、ESR1。TP53 又是一種抑癌有關基因，這個基因能夠編碼一種分子量為53kDa 的蛋白質。 MYC 基因包括N-MYC、C-MYC、R-MYC、L-MYC 共4 種。C-MYC 是最常見的活化原癌基因之一， 參與調控的癌癥占人類所患癌癥的五分之一左右，受C-MYC 原癌基因影響致死的癌癥患者每年可達幾十萬。 MYC 是一種作用廣泛的轉錄因子，它通過多種機制調節(jié)細胞的分化和增殖，包括靶基因的轉錄擴增。 MYC 調控細胞生長和增殖，因此也可以控制腫瘤的生長，表皮生長因子測定可用于診斷各種腫瘤和潰瘍病[19]。 許多腫瘤中有EGF 及其受體的異常表達，且與腫瘤轉移和患者預后有密切關系，如胃癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等。

4.4 KEGG 富集分析結果顯示，沙苑子有效成分治療腫瘤細胞的主要通路是信號通路AGE-RAGE、IL-17信號通路、TNF 受體信號通路等10 個通路。 IL-17 能有效地介導組織的炎癥反應， 有研究表明通過抑制IL-17 信號通路可能直接影響細胞的活化、 增殖，進而影響腫瘤細胞的產生。 GO 富集分析顯示沙苑子治療腫瘤疾病的生物學過程 （biological process，BP）與146 條功能條目相關， 主要包括細胞增殖的負調控，細胞對脂質的反應，應對營養(yǎng)，對營養(yǎng)水平的反應，膜筏。 與細胞組成相關主要包括膜微區(qū)，轉錄調節(jié)復合物，質膜蛋白復合物，囊腔。與分子功能相關共62 個，主要包括激酶綁定，DNA 結合轉錄因子結合，蛋白結構域特異性結合，轉錄因子結合，蛋白激酶結合等。

4.5 綜上所述，由本文可知沙苑子有效成分可能通過山奈酚、芒柄花素、槲皮素、β-谷甾醇等有效成分，作用于IL6、TNF、VEGFA 、AKT1 等靶點，涉及IL-17 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 受體信號通路等通路來實現(xiàn)治療腫瘤疾病的目的[20]。 本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法確認沙苑子多個有效成分、關鍵靶點、通路對腫瘤疾病發(fā)揮治療作用[21-24]。為后續(xù)沙苑子的研究提供了理論基礎和依據(jù)， 可能對闡明沙苑子抗腫瘤的機制和識別潛在靶點提供幫助，未來需要進一步實驗驗證。但是基于理論技術方面和數(shù)據(jù)庫信息的限制，本研究存在一定的局限性，有待進一步研究驗證。