指紋圖譜技術(shù)在動物藥質(zhì)量評價中的應(yīng)用進(jìn)展

遲東澤，馬玉芯，郭 鑫

(1.吉林省藥品審核查驗(yàn)中心，長春 130062；2.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化 134002)

動物藥是指動物整體、器官、生理或病理產(chǎn)物等可供藥用的中藥材，是中藥材的主要來源之一[1]。動物藥在我國應(yīng)用歷史悠久，歷代本草中都有記載，具有療效顯著、活性強(qiáng)、應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)[2]。現(xiàn)代研究表明，動物藥與同體積、同重量的植物藥相比，大多數(shù)都具有極強(qiáng)的生物活性，尤其在治療頑癥、重病方面，更顯示出其獨(dú)特的生理活性。 由于臨床需求量增大，藥源緊缺，需求旺盛，價格昂貴，動物藥材的質(zhì)量問題，屢有報(bào)道，備受公眾關(guān)注[3]。 因此，藥用動物以及動物藥的品種鑒定與質(zhì)量評價工作急需現(xiàn)代技術(shù)的介入和支持。 隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，高效液相色譜、凝膠電泳、高效毛細(xì)管電泳、液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、DNA 分子鑒定技術(shù)等方法在動物藥的鑒定中起到了重要作用[4]。本研究對動物藥的質(zhì)量現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，并針對一些指紋圖譜技術(shù)和方法的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 動物藥質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀

動物藥的主要成分多為多糖、蛋白質(zhì)、核苷等，研究難度較大，導(dǎo)致動物藥在應(yīng)用中品種混亂，其各部分成分與藥材的功能主治難以相互對應(yīng)，質(zhì)量評價進(jìn)展緩慢[5]。 因此，亟待結(jié)合動物藥特點(diǎn)，尋找出符合當(dāng)前動物藥實(shí)際應(yīng)用的質(zhì)量檢測方法與指標(biāo)，這是解決動物藥品質(zhì)評價問題的關(guān)鍵[6]。

動物藥雖然種類少于植物藥，但具有一定的藥用價值，其特效性強(qiáng)、發(fā)展快和前景好等優(yōu)勢，已受到人們廣泛的重視和關(guān)注[7]。隨著人們對動物藥深入了解，其市場需求量不斷擴(kuò)大，但大部分動物藥材并沒有明確的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，無法構(gòu)建完善的質(zhì)量評價體系[8]。2015 版《中國藥典》一部收載動物藥材質(zhì)量評價方法包括液-質(zhì)聯(lián)用法鑒別阿膠、龜甲膠、鹿角膠；PCR 法鑒別烏梢蛇和蘄蛇；薄層色譜法檢測龜甲、穿山甲、鹿茸、水蛭等重金屬和有害元素，地龍等藥材中黃曲霉毒素檢查等。 2020 版《中國藥典》四部附錄收載48 種動物藥材，僅有藥材來源，無具體質(zhì)量評價和控制項(xiàng)目[9]。

2 動物藥質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)方法

2.1 色譜法

2.1.1 薄層色譜法

動物類藥材一般市場價格較高，通過簡單的色譜方法，可鑒別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。 薄層色譜法是根據(jù)各成分對同一吸附劑吸附能力不同而將其成分分離出來的一種簡單方法，可同時鑒別多種樣品，具有簡單和快速等特點(diǎn)，是傳統(tǒng)的中藥材定性、定量的分析方法[10]。張建英等[11]采用薄層色譜鑒別法對珍珠層粉膠囊中氨基酸成分進(jìn)行研究，該方法斑點(diǎn)清晰、分離度好、專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，由此建立了珍珠層粉膠囊質(zhì)量控制的有效方法。 林爽等[12]采用薄層色譜（TLC）法建立指紋圖譜和含量測定方法，識別了16 個共有峰，評價不同產(chǎn)地龍血竭藥材質(zhì)量情況。

2.1.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜技術(shù)(HPLC) 具有分離度高、重復(fù)性好、圖譜信息豐富等特點(diǎn)，可用于分析中藥有效成分的含量和構(gòu)建指紋圖譜的研究中，是《中國藥典》中應(yīng)用最廣泛的中藥檢測方法之一[13]。 HPLC 已廣泛應(yīng)用于動物藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量評價和控制方面的研究[14]。 曹越等[15]建立10 批鹿茸的HPLC 指紋圖譜，利用計(jì)算機(jī)對鹿茸主成分進(jìn)行相似度比較，能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地梅花鹿茸和馬鹿茸進(jìn)行識別。 蔡萍等[16]建立土鱉蟲超微粉體中游離氨基酸的HPLC 指紋圖譜，采用異硫氰酸苯酯(PITC) 柱前衍生， 梯度洗脫進(jìn)行色譜分離， 初步建立了土鱉蟲超微粉體中游離氨基酸的HPLC 指紋圖譜，標(biāo)定了24 個共有峰，該法分離效果好，靈敏、準(zhǔn)確、簡單，可作為土鱉蟲超微粉體質(zhì)量評價的方法。

2.1.3 氣相色譜法

氣相色譜法是利用氣體作為流動相的色層分離分析方法。 氣化的試樣被載氣（流動相）帶入色譜柱中， 柱中的固定相與試樣中各組份分子作用力不同，各組份從色譜柱中流出時間不同，組份彼此分離。 采用適當(dāng)?shù)蔫b別和記錄系統(tǒng)，制作標(biāo)出各組份流出色譜柱的時間和濃度的色譜圖[17]。 根據(jù)色譜圖中表明的出峰時間和順序，可對化合物進(jìn)行定性分析；根據(jù)峰的高低和面積大小，可對化合物進(jìn)行定量分析[18]。 具有效能高、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析速度快、應(yīng)用廣泛、操作簡便等特點(diǎn)， 適用于易揮發(fā)有機(jī)化合物的定性、定量分析。 對非揮發(fā)性的液體和固體物質(zhì)，可通過高溫裂解，氣化后進(jìn)行分析[19]。吳萍等[20]以此方法測定羚羊角塞注射液和未醇沉液中游離氨基酸的含量，為羚羊角進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.1.4 其他聯(lián)用技術(shù)

各種聯(lián)用色譜分析技術(shù)可對成分復(fù)雜的動物藥進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和定性鑒別，適合于缺乏明確對照品的動物藥鑒別和質(zhì)量控制的研究， 如二維液相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以及新的高效通用檢測器如蒸發(fā)光散射檢測器等分析技術(shù)方法[21]。

2.2 光譜法

光譜分析技術(shù)在動物藥的質(zhì)量評價中應(yīng)用廣泛，其中包括紅外光譜、紫外光譜、原子光譜、質(zhì)譜、核磁共振光譜以及X 射線衍射光譜等[22]。 金向群等[23]采用紅外光譜和紫外光譜分析蟾蜍耳后腺分泌物來區(qū)分和鑒別中華大蟾蜍和與其相似的華西大蟾蜍。 此外，紅外光譜也可對冬蟲夏草、北蟲草及其偽品等蟲體脂肪量的差異進(jìn)行比較鑒別[24]。 王麗娟等[25]用粉末X 射線衍射Fourier 譜法對鹿角、 麋鹿角及鹿角偽品牛腿骨進(jìn)行比較鑒別，結(jié)果動物角類藥材含有大量無機(jī)成分， 利用X 射線衍射可以得到較為尖銳的X 射線衍射峰，根據(jù)其幾何拓?fù)鋱D形和特征標(biāo)記峰值的差異可對各角類藥材進(jìn)行鑒別比較。

2.3 高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜技術(shù)

高效毛細(xì)管電泳法是近幾年興起的一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)[26]。 毛細(xì)管電泳實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，它使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析乃至單分子分析成為可能，高效毛細(xì)管電泳法可用于長期困擾我們的生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析[27]。 苑廣信等[28]通過毛細(xì)管電泳的鹿鞭D(zhuǎn)NA 指紋鑒定方法得出結(jié)論， 梅花鹿鞭指紋圖譜中有9 個共有峰， 馬鹿鞭指紋圖譜中有21 個共有峰，與馴鹿鞭、赤鹿鞭有明顯差異，而且，其相似度均小于0.7，說明該方法客觀、準(zhǔn)確、方便，可有效區(qū)分梅花鹿鞭、馬鹿鞭及其偽品。

2.4 生物指紋圖譜技術(shù)

中藥生物指紋圖譜包括作DNA 分子遺傳標(biāo)記的中藥材DNA 指紋圖譜，以及將色譜分離與分子生物醫(yī)學(xué)二者的成果緊密結(jié)合的分子生物色譜指紋圖譜[29]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，DNA 分子技術(shù)已經(jīng)越來越多的用于中藥材品種鑒別的研究[30]。 史磊[31]通過生物指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)，采用同一種引物對產(chǎn)地的全蝎樣品進(jìn)行RAPD 擴(kuò)增， 可以得到多條共同條帶，表明其遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)基本類似。 但山東省內(nèi)不同產(chǎn)地全蝎樣品擴(kuò)增后所得的條帶具有一定的特異性，表明不同產(chǎn)地全蝎DNA 有所變異，RAPD 分子標(biāo)記作為一種有效的鑒別方法，可以從物種的遺傳本質(zhì)出發(fā)，揭示其親緣關(guān)系和遺傳背景，對全蝎養(yǎng)殖、品種開發(fā)具有重要意義。

3 動物藥指紋圖譜評價方法

在對動物藥指紋圖譜進(jìn)行評價時，只要好好把握指紋圖譜整體性和模糊性這兩大特征，建立直觀而又全面、合理而又簡易、精確而又方便的色譜指紋圖譜計(jì)算機(jī)處理方法，就可能對動物藥指紋圖譜的質(zhì)量進(jìn)行合理評價[32]。

3.1 直觀分析比較法

將待測樣品的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行直接比較，可以鑒定判別藥材真?zhèn)巍５@種方法缺乏量化的數(shù)據(jù)和統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)， 不利于指紋圖譜的推廣應(yīng)用及規(guī)范化，因其缺點(diǎn)太多近年來已經(jīng)很少使用[33]。

3.2 化學(xué)識別評價模式

3.2.1 聚類分析

聚類分析是用相似度來衡量樣品之間的親疏程度，并以此來實(shí)現(xiàn)分類。對于不同批次的藥材樣品，其色譜指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)快速辨識處理，可依據(jù)樣品批與批之間的相似度，確定藥材樣品批次間的穩(wěn)定性。色譜指紋圖譜常用模糊聚類分析， 它是依據(jù)樣品的特征、親疏關(guān)系程度和相似性，通過建立模糊相似關(guān)系對樣品進(jìn)行分類的方法，能反映樣品整體的、主要的特性[34]。 李勇[35]采用聚類分析方法發(fā)現(xiàn)成都、大連、黑龍江、南京、北京這5 個產(chǎn)地的水蛭藥材聚集緊密，質(zhì)量相對穩(wěn)定，能夠聚成一類。

3.2.2 主成分分析

主成分分析法是一種應(yīng)用廣泛的多元統(tǒng)計(jì)方法，用于簡化數(shù)據(jù)， 快速實(shí)現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識別。在中藥材指紋圖譜研究中，一般先選定個別已知化學(xué)成分的相對峰面積作為特征值，采用主成分分析求出指標(biāo)的相關(guān)矩陣特征值[36]。 孫偉杰等[37]通過主成分分析方法鑒別并區(qū)分4 種鹿茸飲片，以所測定的6 種成分的含量為變量進(jìn)行主成分分析，由分析結(jié)果可知前2 個主成分累積貢獻(xiàn)率為92.9%， 其中第1 主成分貢獻(xiàn)率為81.1%，第2 主成分貢獻(xiàn)率為11.2%。 由初始因子載荷矩陣可知，前2 個成分已基本反映出4 種鹿茸飲片的主要特征。

3.3 相似度評價方法

相似度評價方法最常用的為相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法。 這兩種方法有良好的穩(wěn)健性和敏感性，即對圖譜的細(xì)微改變能夠反應(yīng)為數(shù)值變化以及對儀器誤差能有效克服[38]。 相關(guān)系數(shù)法是以指紋圖譜兩組向量的相關(guān)系數(shù)來反映樣品間相似性的一種方法， 適用于同屬不同種的藥材分析，可以鑒別樣品的真?zhèn)蝺?yōu)劣[39]。夾角余弦法是以兩組向量的夾角余弦大小來反映兩種樣品之間相似性的方法，能夠較好地評價指紋圖譜間的相似性[40]。 黃玉明等[41]采用相似度評價法將相似度數(shù)值0.85 當(dāng)作區(qū)分蛤蟆油藥材是否合格的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)11 批優(yōu)質(zhì)蛤蟆油藥材的相似度在0.866～0.972區(qū)間內(nèi)， 而4 批劣質(zhì)蛤蟆油藥材的相似度在0.560～0.802 區(qū)間內(nèi)，為蛤蟆油的深度開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

4 展望

動物藥作為祖國醫(yī)藥寶庫中重要的組成部分，在中醫(yī)臨床上有著廣泛的應(yīng)用，隨著藥理作用方面的開發(fā)研究越來越受到重視。 由于動物藥具有療效好、活性強(qiáng)、應(yīng)用廣、潛力大的特點(diǎn)，越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和重視。動物藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的研究和建立必將成為動物藥質(zhì)量評價的重要發(fā)展趨勢之一，成為動物藥鑒定的重要平臺。動物藥指紋圖譜正處于初步建立的階段， 其發(fā)展的高級階段是功能指紋圖譜，需在中藥譜效學(xué)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展研究，采用生物信息學(xué)方法把指紋圖譜和生物活性、藥效等相關(guān)的化合物群對應(yīng)的聯(lián)系起來，最終建立指紋圖譜的綜合數(shù)據(jù)庫。 隨著科技的進(jìn)步，動物藥的質(zhì)量控制水平也得到了質(zhì)的提升，但是進(jìn)行研究的品種還很少，對其含有的活性成分、藥理作用等還沒有取得突破性進(jìn)展。 在加強(qiáng)動物藥材基礎(chǔ)研究的同時，還需利用現(xiàn)代生物化學(xué)分析技術(shù)大力開展其質(zhì)量控制研究，改變動物中藥標(biāo)準(zhǔn)相對植物中藥嚴(yán)重落后的局面。