棘胸蛙腐皮病病原菌分離鑒定及五倍子水提液的治療效果探究

徐 莉，黃其鍛，陳友鈴*，黃 鎮(zhèn)，4*

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350117;2.福建省健豐生物科技有限公司,福建 泉州 362500; 3.福建省石凍王生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司,福建 泉州 362500; 4.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350117)

棘胸蛙Quasipaaspinosa隸屬于兩棲綱無尾目叉舌蛙科棘胸蛙屬，主要分布于我國南方丘陵地區(qū)[1]。棘胸蛙肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，作為藥食兩用的新型養(yǎng)殖蛙類品種，受到了廣大消費(fèi)者的喜愛[2]。近年來，隨著棘胸蛙的養(yǎng)殖規(guī)模和密度的增加，棘胸蛙疾病出現(xiàn)的類型、頻率和嚴(yán)重性明顯增加，其中影響較為嚴(yán)重的疾病之一就是腐皮病。腐皮病的病原種類較多，根據(jù)病因不同，腐皮病可分為營養(yǎng)型和病原型腐皮病。營養(yǎng)型腐皮病的主要病因是飼料單調(diào)，缺少多種維生素或微量元素而導(dǎo)致的皮膚潰爛，從而引發(fā)病菌感染。該種腐皮病可以通過增加維生素的方式進(jìn)行治愈，對于棘胸蛙的致死率很低。而另一種病原型腐皮病的主要病因是由細(xì)菌直接引起，通常情況下在高密度養(yǎng)殖過程中發(fā)生，表現(xiàn)為初期棘胸蛙食欲減退、行動(dòng)遲緩，表皮光澤度減退、脫落出現(xiàn)白斑，甚至指骨和頜骨外露，后期因傷口潰爛、病菌感染而逐漸死亡[3]。該病具有強(qiáng)傳染性，幾天時(shí)間可造成棘胸蛙的大量死亡，甚至全部死亡。在前人的研究中，發(fā)現(xiàn)了引起腐皮病的致病菌有多種，例如潰瘍分枝桿菌Mycobacteriumulcerans[4]和斯氏分枝桿菌Mycobacteriumszulgai[5]可引起熱帶爪蟾Xenopustropicalis腐皮?。灰灿醒芯糠治霰砻?，棘胸蛙腐皮病可由嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila[3]、奇異變形桿菌Proteusmirabilis[6]、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa[7]引起。在養(yǎng)殖過程中，該病的病原菌很難通過顯微鏡判定，導(dǎo)致在實(shí)際養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖戶濫用抗生素治療該疾病，從而造成了其他病菌的耐藥，因此需要進(jìn)一步找到更綠色環(huán)保的治療棘胸蛙腐皮病的措施。

隨著人們的綠色健康養(yǎng)殖意識(shí)不斷加強(qiáng)，對抗生素在動(dòng)物疾病預(yù)防和養(yǎng)殖上產(chǎn)生的副作用也越來越關(guān)注。天然中草藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，具有資源豐富、藥效顯著、可再生、對環(huán)境壓力小等特點(diǎn)，隨著對中草藥功能和藥理作用機(jī)制不斷深入研究，中草藥在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中的添加使用日益廣泛。中草藥五倍子Rhuschinensis具有斂肺降火、解毒止血、澀腸止瀉、收濕斂瘡等功效[8]，楊香玉等[9]也在研究中發(fā)現(xiàn)五倍子對痤瘡致病細(xì)菌具有較強(qiáng)抑制作用，齊云云等[10]在研究中證實(shí)了五倍子中的雙沒食子酸與三-O-沒食子?；咸烟悄苡行Т龠M(jìn)大鼠潰瘍面的愈合、減輕炎癥。

因此，本研究將從患腐皮病棘胸蛙的病變組織中分離出病原菌，對其進(jìn)行16S rRNA基因鑒定和藥敏試驗(yàn)等研究，進(jìn)一步設(shè)計(jì)五倍子水提液及抗生素藥浴治療方案，以期為棘胸蛙腐皮病的疾病防治、中草藥合理利用以及棘胸蛙的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患腐皮病棘胸蛙及正常健康棘胸蛙均由三明市某棘胸蛙養(yǎng)殖場提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1患腐皮病棘胸蛙剖檢及病原菌分離純化 在無菌條件下取患病棘胸蛙的肝臟、肌肉、腐皮組織，使用手持研磨槍進(jìn)行研磨，于超凈工作臺(tái)中分別取少量各組織研磨液涂布劃線于不同固體腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，28℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h后挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2棘胸蛙腐皮病病原菌鑒定 將挑取的單菌落分別溶于10 μL無菌雙蒸水中制成菌懸液，吸取8 μL菌懸液入液體培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)增后保菌，吸取剩余2 μL作為DNA模板加入PCR體系，使用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物[11]F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)擴(kuò)增基因片段，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送生物公司測序，最終得到10株單菌落的16S rRNA基因的測序結(jié)果，將得到的各菌落基因序列從JXW01連續(xù)編號(hào)至JXW10，各測序結(jié)果序列通過NCBI的BLAST檢索序列同源性分析，使用MEGA軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)[12]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行菌株的鑒定。

1.2.3五倍子水提液制備及棘胸蛙腐皮病病原菌藥敏試驗(yàn)

1.2.3.1五倍子水提液的制備 精確稱取10 g五倍子粉末于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水，浸泡30 min，煮沸20 min后紗布過濾，剩下的藥渣加入50 mL蒸餾水，煎煮15 min過濾。合并兩次的濾液，重新導(dǎo)入干凈錐形瓶中，加熱煮沸濃縮至10 mL，此時(shí)五倍子水提液的濃度為1 g·mL-1。滅菌后，于4℃冰箱內(nèi)存放備用。

1.2.3.2棘胸蛙腐皮病病原菌藥敏試驗(yàn) 根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙(2022年1號(hào)、2022年2號(hào))》篩選出常見治療藥物，一共11種抗生素，分別為：甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹、恩諾沙星、維生素C磷酸酯鎂鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸新霉素、磺胺間甲氧嘧啶片、磺胺嘧啶片、磺胺二甲嘧啶、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素。按照最小用藥單位將各類抗生素及五倍子水提液制成藥敏紙片。根據(jù)k-b紙片擴(kuò)散法[13]，將分離到的致病菌于腦心浸液肉湯液體培養(yǎng)液中，28℃下震蕩培養(yǎng)24 h，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛群?，均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，將藥敏紙片均勻放置其中。培養(yǎng)16 h后，觀察各抑菌圈大小。根據(jù)各抑菌圈直徑大小判斷敏感性，抑菌圈直徑d>20 mm 判定為高度敏感，表示為“S”；10 mm

1.2.4患腐皮病棘胸蛙治療試驗(yàn) 本研究前期對于棘胸蛙腐皮病的治療進(jìn)行了調(diào)研，總結(jié)出養(yǎng)殖戶使用五倍子進(jìn)行腐皮病的治療是一個(gè)有效的經(jīng)驗(yàn)方法。為進(jìn)一步驗(yàn)證五倍子對于棘胸蛙腐皮病的治療效果，采用五倍子水提液，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果挑選了2種抗生素，設(shè)計(jì)了硫酸新霉素、恩諾沙星、五倍子水提液的藥浴治療試驗(yàn)。

整個(gè)治療試驗(yàn)周期為20 d，將患病棘胸蛙分為4組，每組3只，A組為五倍子水提液治療組，每天換水1 L后加入100 μL五倍子水提液，每治療3 d休藥1 d；B組為硫酸新霉素治療組，每天換水1 L后加入1 mL硫酸新霉素藥液浸泡1 h；C組為恩諾沙星治療組，每天換水1 L后加入1 mL恩諾沙星藥液；D組為患病對照組，每天換水1 L后不做任何處理。另外設(shè)置一組3只健康棘胸蛙的健康對照組，每天換水1 L后不做任何處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 患腐皮病棘胸蛙組織剖檢觀察

患腐皮病棘胸蛙的臨床癥狀與解剖學(xué)觀察見圖1，病蛙外觀主要癥狀為體色較深，眼部渾濁，腿部伴有紅腿癥狀，體表四肢關(guān)節(jié)處、吻部、額部出現(xiàn)不同大小不規(guī)則潰爛，潰爛處肌肉紅腫，重癥者深達(dá)骨骼。解剖后，病蛙內(nèi)部肝臟膨大呈紅棕色并出現(xiàn)一定量的花斑，膽、腸道、心臟未見異常。

注：A為腿部潰爛；B為吻部潰爛，眼部泛白；C為腹部潰爛；D為肝臟膨大出現(xiàn)花斑。

2.2 棘胸蛙腐皮病病原菌的分離純化與鑒定

從患腐皮病的棘胸蛙中選取肝臟、肌肉和腐皮組織進(jìn)行病原菌的分離，然后從中挑選10個(gè)細(xì)菌單菌落通過16S rRNA序列進(jìn)行鑒定，將得到的10株細(xì)菌的16S rRNA測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析，用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示菌株JXW01、JXW02、JXW03、JXW04、JXW05與嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的同源關(guān)系最近；菌株JXW06、JXW07、JXW08、JXW09、JXW10與維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)的親緣關(guān)系最近。因此，從結(jié)果可以分析得出，此患腐皮病的棘胸蛙主要病原菌為嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌。

圖2 基于16S rRNA序列的進(jìn)化樹鑒定棘胸蛙病原菌

2.3 分離到的棘胸蛙腐皮病病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟甲喹等7種藥物高度敏感，對五倍子水提液、磺胺二甲嘧啶等3種藥物中度敏感，對復(fù)方新諾明、磺胺嘧啶2種藥物耐藥；維氏氣單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、強(qiáng)力霉素等9種藥物高度敏感，對五倍子水提液、氟甲喹2種藥物中度敏感，對磺胺嘧啶片耐藥。2種病原菌均對其高度敏感的藥物有7種，分別為：甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、維生素C磷酸酯鎂鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸新霉素、強(qiáng)力霉素。

表1 病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 患腐皮病棘胸蛙的藥物治療試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，健康蛙對照組的棘胸蛙20 d內(nèi)均未死亡；硫酸新霉素治療組用藥第15 d后棘胸蛙均未存活，存活率為0%，與患病對照組情況相同；恩諾沙星治療組棘胸蛙在用藥后第20 d后存活1只，存活率為33.3%；五倍子水提液治療組棘胸蛙在用藥后均存活，存活率為100%。

表2 腐皮病棘胸蛙治療試驗(yàn)結(jié)果

五倍子水提液治療組在棘胸蛙均存活的前提下，對棘胸蛙腐皮病癥狀的治愈效果最好，五倍子水提液治療組棘胸蛙患處前后對照見圖3。

注：A為第0 d腐皮病棘胸蛙患處；B為第7 d腐皮病棘胸蛙患處；C為第15 d腐皮病棘胸蛙患處；D為第20 d腐皮病棘胸蛙患處。

3 討論與結(jié)論

棘胸蛙腐皮病是棘胸蛙養(yǎng)殖過程中的一種常見的細(xì)菌性疾病，大量研究證據(jù)表明蛙的死亡是由于細(xì)菌感染引起的器官組織炎癥。在本試驗(yàn)中，患該病的棘胸蛙病癥主要表現(xiàn)是身體多部位潰爛，肝臟部位腫大，出現(xiàn)花斑，這與已有的報(bào)道[3，7，14]一致。已有的研究表明引起蛙類腐皮病的病原菌有很多種，戚建華等[15]發(fā)現(xiàn)布韋不動(dòng)桿菌Acinetobacterbuvestris能引起牛蛙腐皮病；舒新華等[16]發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌也能獨(dú)立引起牛蛙的腐皮??；肖波[3]的研究證實(shí)引起棘胸蛙腐皮病的致病菌是嗜水氣單胞菌。本研究中從病蛙身上分離出了嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌，嗜水氣單胞菌為棘胸蛙腐皮病的致病菌這與肖波[3]的研究結(jié)果相似，雖然維氏氣單胞菌在蛙類中引起腐皮病的病例尚未見報(bào)道，但在金魚Carassiusauratus[17]以及中國大鯢Andriasdavidianus[18]等養(yǎng)殖動(dòng)物中曾被反復(fù)證實(shí)是引起腐皮病及敗血癥的主要致病菌。說明細(xì)菌性疾病具有“一病多因，一因多病”的特點(diǎn)，嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌等都能引起腐皮病的發(fā)生，而同一種腐皮病，也有可能是因?yàn)椴煌闹虏【?。因此在蛙類?xì)菌性疾病治療的過程中，要明確疾病的主要致病菌，針對性用藥，不能僅憑主觀判斷盲目用藥，耽誤病情，進(jìn)而影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益。

本研究結(jié)果表明嗜水氣單胞菌對7種藥物高度敏感，2種藥物耐藥；維氏氣單胞菌對9種藥物高度敏感，1種藥物耐藥。硫酸新霉素與恩諾沙星是病原菌敏感性最高的兩種藥物，但在實(shí)際治療中效果不佳，硫酸新霉素治療組存活率為0%，恩諾沙星治療組存活率為33.33%，推測可能與不同宿主來源、研究樣本數(shù)量及地域分布等因素有關(guān)，因此硫酸新霉素與恩諾沙星的治療方案還需進(jìn)一步探究。在藥敏試驗(yàn)中兩種病原菌對五倍子水提液僅為中度敏感，但在實(shí)際治療中，五倍子水提液治療組存活率為100%，且患處得到明顯改善，腐爛傷口逐漸愈合，這表明五倍子水提液可有效控制與治療棘胸蛙的腐皮病，推測五倍子水提液不僅具有抑菌作用，還具有免疫方面的功能。相關(guān)文獻(xiàn)也表明五倍子除了擁有體外抑菌效果[19-21]之外，還含有大量的鞣質(zhì)以及五倍子酸，其中鞣質(zhì)成分含量非常豐富，具有諸多功效，能夠抗菌消炎、抗氧化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)其毒性較小，能夠廣泛用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[22]。還有研究表明五倍子中的鞣質(zhì)可以通過ERK1/2介導(dǎo)的信號(hào)通路有效促進(jìn)傷口愈合，顯著增加細(xì)胞數(shù)量和遷移，減少細(xì)胞死亡和乳酸脫氫酶的釋放，以及誘導(dǎo)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA過度表達(dá)，增加膠原蛋白的總?cè)芙舛龋⒓せ顫撛诘目寡趸匦?，從而加速傷口愈合[23]。目前對五倍子治療蛙類疾病的研究主要集中在藥敏試驗(yàn)和藥理方面，缺少五倍子在實(shí)際蛙類細(xì)菌性疾病中治療的研究報(bào)道，本研究提供了五倍子水提液在實(shí)際蛙類疾病中的治療效果，為棘胸蛙腐皮病的實(shí)際治療提供了一種參考方案。

在棘胸蛙腐皮病的實(shí)際預(yù)防治療中，建議養(yǎng)殖戶采取預(yù)防為主的理念，在養(yǎng)殖初期，運(yùn)輸、放苗時(shí)應(yīng)小心操作，注意防止蛙體剮蹭，做好蛙池的平整度檢查工作，防止有尖銳凸起劃傷蛙體；在日常的養(yǎng)殖活動(dòng)中，及時(shí)清理蛙池，定期定時(shí)進(jìn)行消毒，加強(qiáng)水體質(zhì)量檢測，保持水質(zhì)干凈合格；由于棘胸蛙性格上膽小易受驚，在日常工作中應(yīng)保持環(huán)境的安靜與濕潤；疾病高發(fā)季節(jié)，應(yīng)適當(dāng)在日常飼料中添加一些礦物質(zhì)和微量元素，例如蛙多維等，防治營養(yǎng)性腐皮病的發(fā)生；在發(fā)病初期，應(yīng)及時(shí)隔離病蛙與正常蛙，觀察病蛙具體病癥，明確病蛙主要致病菌，針對性進(jìn)行藥物治療。