鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑國家參考品的研制

張園園,孫竹林,趙愛華,周亞洲,楊瑞馥,張平平,魏東

1. 中國食品藥品檢定研究院國家衛(wèi)生健康委員會生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室,北京 102629; 2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)引起的自然疫源性烈性傳染病,在《中華人民共和國傳染病防治法》中被列為甲類傳染病。國家衛(wèi)生健康委員會《人間傳染的病原微生物名錄》根據(jù)其危害程度,將鼠疫耶爾森菌列為第二類高致病性微生物。鼠疫耶爾森菌主要在嚙齒類動物中引起原發(fā)性感染,經(jīng)鼠蚤或直接接觸及吸入氣溶膠傳播給人,引起的疾病主要包括腺鼠疫、肺鼠疫和敗血型鼠疫3種類型,其中肺鼠疫病死率較高[1]。人類歷史上曾發(fā)生過3次鼠疫大流行,造成上億人死亡。時至今日,很多地區(qū)如非洲、亞洲、美洲仍將鼠疫視為可能會死灰復燃的烈性傳染性疾病之一[2-4]。

根據(jù)現(xiàn)行的《鼠疫診斷標準(WS279-2008)》規(guī)定,鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測是鼠疫診斷過程中的重要實驗室檢查項目。目前有多種鼠疫耶爾森菌抗體檢測方法均很有效,如間接血凝法、膠體金法、酶聯(lián)免疫法、上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法等[5-7],但我國尚無鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑評價用國家參考品。為此,本團隊研制了一套鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑評價用國家參考品,這對鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑的注冊管理及指導我國該類試劑的健康有序發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種鼠疫耶爾森菌EV株(CMCC～52006)、鼠疫耶爾森菌0614F株、鼠疫耶爾森菌Tjiusidej(R)株(CMCC52010)、鼠疫耶爾森菌田鼠型201株、假結(jié)核耶爾森菌(CMCC53521)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(CMCC52203)、土拉熱弗朗西絲菌LVS株、布魯菌104M株(CMCC55010)、炭疽芽孢桿菌(CMCC63001)、傷寒沙門菌(CMCC50071)均由中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections,CMCC)提供。

1.1.2 動物新西蘭大耳白家兔,體重2.5～3.0 kg,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級,雄性。

1.1.3 樣本鼠疫疫苗人免血清、正常人血漿及兔抗鼠疫耶爾森菌F1抗原血清由蘭州生物制品研究所有限責任公司提供。

1.1.4 主要試劑鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑盒(上轉(zhuǎn)發(fā)光法)(批號:20211001)由北京熱景生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn);鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑盒(上轉(zhuǎn)發(fā)光法)(批號:20210907)由軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所生產(chǎn);鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑(膠體金法)(批號:20210202401)由北京金豪制藥股份有限公司生產(chǎn);鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑(膠體金法)(批號:20210801)、鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(批號:20210201)、鼠疫耶爾森菌F1抗體診斷試劑盒(間接血凝法)(批號:20210201)均由蘭州生物制品研究所有限責任公司生產(chǎn)。

1.1.5 儀器設備生物安全柜購自美國 NuAire公司;MIR-153型恒溫培養(yǎng)箱購自日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 兔免血清的制備首先制備兔抗鼠疫耶爾森菌血清。將鼠疫耶爾森菌EV株(CMCC52006)、鼠疫耶爾森菌0614F株、鼠疫耶爾森菌Tjiusidej(R)株(CMCC52010)、鼠疫耶爾森菌田鼠型201株(其中除EV株外均為滅活菌體)分別免疫家兔,共免疫2次,間隔2周,背部皮下接種,每次免疫1.0 mL[含5×108個菌及1.0 mg氫氧化鋁佐劑(活疫苗除外)]。于第2次免疫后2周采血并分離血清。

再制備兔抗陰性菌血清,將假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、布魯菌、炭疽芽孢桿菌、傷寒沙門菌、土拉熱弗朗西絲菌(均為滅活菌體)分別免疫家兔,共免疫4次,間隔2周,背部皮下接種,每次免疫1.0 mL(含5×108個菌及1.0 mg氫氧化鋁佐劑)。于第4次免疫后2周采血并分離血清。

1.2.2 去纖維血漿的制備每100 mL正常人血漿中加入脫纖維試劑(氯化鈣終濃度為0.012 5 mol/L,凝血酶終濃度為3.5 IU/mL),加入后立即混勻,于37 ℃水浴輕微轉(zhuǎn)動處理30 min至纖維蛋白原凝集,12 000 g離心10 min,收集上清液,即為去纖維血漿。

1.2.3 參考品的組成首先,制備陽性參考品,將4株鼠疫耶爾森菌免疫家兔,制備4份兔免血清。另用正常人去纖維血漿10倍稀釋鼠疫耶爾森菌EV株兔免血清,制備1份弱陽性參考品?？紤]到本套參考品將用于評價人用鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑,將1份鼠疫疫苗人免血清作為陽性參考品。

陰性參考品包括2份正常人脫纖維血漿、6份微生物學分類接近或高致病性微生物的兔免血清。由于高致病性微生物感染者的血清難以獲得,因此使用兔免血清作為相應陰性參考品。

采用純化的鼠疫耶爾森菌F1抗原免疫家兔,制備血清,用作最低檢出限參考品與重復性參考品。

1.2.4 參考品的分裝將6份陽性參考品及8份陰性參考品以每支0.15 mL分裝于凍存管中。將F1抗原兔免血清用凍干保護劑稀釋后定量分裝于安瓿中,每支 0.5 mL,凍干后封口,作為最低檢出限參考品與重復性參考品。分裝精確度不高于1%,水分低于3%。分裝后參考品樣品均于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 分裝后驗證隨機抽取一套參考品,用鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑進行F1抗體檢測。

1.2.6 均勻性檢驗隨機抽取最低檢出限參考品10支,分別加入0.5 mL樣本稀釋液復溶;取復溶樣本0.1 mL,加入0.3 mL樣本稀釋液(4倍稀釋),混勻;用鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑檢測抗體水平。每支樣本重復測定3次。

1.2.7 穩(wěn)定性研究分為以下3類。①凍融穩(wěn)定性試驗。從冰箱中取出陽性參考品及最低檢出限參考品,于室溫放置約4 h,再放回冰箱,如此重復1次及3次,用鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑進行F1抗體檢測。②加速穩(wěn)定性試驗。從-80 ℃冰箱中取出陽性參考品及最低檢出限參考品,分別于-20 ℃、4 ℃、37 ℃各放置2套。陽性參考品放置3 d和5 d,最低檢出限參考品放置14 d和28 d,分別用鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑盒(上轉(zhuǎn)發(fā)光法)及鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)進行F1抗體檢測。③長期穩(wěn)定性試驗。對弱陽性參考品及最低檢出限參考品進行長期穩(wěn)定性觀察,用鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑進行F1抗體檢測。

1.2.8 協(xié)作標定按照國家藥品標準物質(zhì)協(xié)作標定技術(shù)的要求設計方案,制定生物制品標準物質(zhì)協(xié)作標定作業(yè)指導,并邀請北京熱景生物技術(shù)股份有限公司、軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所、北京金豪制藥股份有限公司、蘭州生物制品研究所有限責任公司共4家實驗室,使用各自生產(chǎn)的鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑進行參考品協(xié)作標定工作[8]。采用上轉(zhuǎn)發(fā)光法、膠體金法、酶聯(lián)免疫法、間接血凝法的鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑分別有2、2、1、1個,編號為1～6。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用IBM SPSS Statistics 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,其中上轉(zhuǎn)發(fā)光法測定結(jié)果以T/C值進行統(tǒng)計分析,酶聯(lián)免疫法以樣品吸光度值與臨界值(cut off)的比值(S/CO值)進行統(tǒng)計分析。均勻性和穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)分別采用單因子方差分析和配對t檢驗進行分析,P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 參考品的組成

共6份陽性參考品,編號為P1～P6;8份陰性參考品,編號為N1～N8;1份最低檢出限參考品,編號為L;1份重復性參考品,編號為R。

2.2 分裝后驗證結(jié)果

使用鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑檢測分裝后的參考品,陽性參考品檢測結(jié)果均為陽性,陰性參考品檢測結(jié)果均為陰性,檢測結(jié)果與預期一致。

2.3 均勻性檢驗結(jié)果

均勻性檢驗結(jié)果如表1所示,F臨界值為F0.05(9,20)=2.42,計算的F值為0.571,該值小于F臨界值,P=0.805,表明在顯著性水平為0.05時,樣品中的抗體含量是均勻的。

表1 均勻性檢驗結(jié)果(T/C值)

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.1 凍融穩(wěn)定性試驗結(jié)果凍融1次及3次后,6份陽性參考品的F1抗體檢測結(jié)果均仍為陽性,且F1抗體水平與未凍融對照相比無顯著性差異(均P>0.05)(見圖1);最低檢出限參考品凍融3次后的最低檢出水平與未凍融對照一致。

圖1 陽性參考品凍融穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.2 加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果6份陽性參考品在不同溫度下加速3 d和5 d后,F1抗體檢測結(jié)果均仍為陽性,各樣本的F1抗體水平與對照樣品相比無顯著性差異(均P>0.05)(見圖2)。最低檢出限參考品在不同溫度下加速14 d后,F1抗體水平未見明顯變化;在不同溫度下加速28 d后,隨著加速溫度的升高,F1抗體水平出現(xiàn)降低趨勢(見圖3)。

A: The results of accelerated stability test at -20 ℃. B: The results of accelerated stability test at 4 ℃. C: The results of accelerated stability test at 37 ℃.

A: The results of accelerated stability test for 14 d. B: The results of accelerated stability test for 28 d.

2.4.3 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果最低檢出限參考品及弱陽性參考品的長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果分別如表2和表3所示,觀察期內(nèi)F1抗體水平均未見明顯變化。

表2 最低檢出限參考品長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表3 弱陽性參考品長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5 協(xié)作標定結(jié)果

采用6種鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑盒來檢測本參考品。對于陽性參考品,所有檢測試劑的陽性符合率均為100%;對于陰性參考品,所有檢測試劑的陰性符合率均為100%。最低檢出限參考品方面, 1種檢測試劑的最低檢出限為原倍血清,3種檢測試劑的最低檢出限為10倍稀釋血清,2種檢測試劑的最低檢出限為100倍稀釋血清。重復性參考品分別檢測10次,人工判讀的檢測試劑(膠體金法、間接血凝法)實驗結(jié)果一致,儀器判讀的檢測試劑(上轉(zhuǎn)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法)實驗結(jié)果的變異系數(shù)均小于15%。具體結(jié)果詳如表4所示。

表4 協(xié)作標定結(jié)果

3 討論

我國鼠疫發(fā)病率低,近10年來每年發(fā)病人數(shù)均為個位數(shù),因此在研制鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑參考品時難以獲得鼠疫患者的血清[9]?，F(xiàn)用鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑中的間接血凝法和雙抗原夾心法對待檢血清的來源沒有嚴格的種屬限制[10-11],且常見的鼠疫抗體檢測試劑主要針對的是鼠疫耶爾森菌F1抗體[12]。因此,本套參考品在制備陽性參考品時,采用表達鼠疫耶爾森菌F1抗原的4株鼠疫耶爾森菌免疫家兔,制備兔免血清,并用正常人血漿10倍稀釋其中的EV株兔免血清制備了1份弱陽性參考品。同時考慮到本套參考品將用于人用鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑的評價,所以選取了1份鼠疫疫苗人免血清作為陽性參考品。采用上轉(zhuǎn)發(fā)光法和膠體金法鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑對候選的陽性參考品分別進行F1抗體驗證,檢測結(jié)果均為陽性。采用酶聯(lián)免疫法對6份陽性參考品進行F1抗體效價測定,結(jié)果在1∶250～1∶4 000。

陰性參考品包括正常人血漿、微生物學分類接近或高致病性微生物的兔免血清。鑒于難以獲得高致病性微生物感染者的血清,本研究使用兔免血清作為相應的陰性參考品。在制備陰性參考品兔免血清時,免疫次數(shù)比陽性參考品多2次。血清中針對免疫用菌體抗原的抗體檢測結(jié)果均為陽性。分別用酶聯(lián)免疫法、上轉(zhuǎn)發(fā)光法和膠體金法鼠疫耶爾森菌抗體檢測試劑進行F1抗體驗證,檢測結(jié)果均為陰性。

本套參考品具有較好的均勻性和穩(wěn)定性,12個月的穩(wěn)定性檢測結(jié)果表明參考品的質(zhì)量未見明顯變化。協(xié)作標定結(jié)果表明,本套參考品可用于對多種鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑的質(zhì)量評價。

綜上所述,本研究所建立的鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑評價用參考品可用于鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測試劑的質(zhì)量評價,對提高該類產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。