基于高通量測(cè)序的抑郁癥患者腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

王雅萍,潘苗苗,夏欣媛,肖振明,楊浩,吳志國(guó),趙超,4

1. 上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院 心理醫(yī)學(xué)科,上海 201800; 2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032; 3. 上海市楊浦區(qū)精神衛(wèi)生中心科教科,上海健康醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生臨床研究中心,上海 200433; 4. 國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院),上海 200040

重性抑郁障礙(major depressive disorder,MDD)也被稱為臨床抑郁癥,是一種常見(jiàn)的慢性、致殘性精神障礙[1]。全球有超過(guò)3.5億人罹患抑郁癥,造成了嚴(yán)重的醫(yī)療衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。高度復(fù)雜的遺傳差異和環(huán)境因素共同導(dǎo)致了抑郁癥的高復(fù)發(fā)性和易感性[2],同時(shí)也導(dǎo)致現(xiàn)有醫(yī)療手段治療效果的有限性。不少研究已關(guān)注到腸道菌群平衡在維護(hù)宿主健康中發(fā)揮了重要的作用[3-4]。近年來(lái)有研究證實(shí)腸道微生物能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,而腸道菌群失調(diào)與多種神經(jīng)精神疾病有很高的相關(guān)性[5]。因此,本研究通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序,對(duì)抑郁癥患者與健康人的糞便樣本進(jìn)行對(duì)比分析,并基于抑郁癥患者的腸道菌群結(jié)構(gòu),為抑郁癥的治療干預(yù)提供潛在的微生物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

抑郁癥患者組為2020年5月—2021年2月上海市嘉定區(qū)瑞金醫(yī)院南翔分院門診就診的患者,共19例(男性9例,女性10例),年齡22～40歲。研究隊(duì)列的入組標(biāo)準(zhǔn)為:①符合美國(guó)《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》(第五版DSM-5)“重性抑郁障礙”診斷標(biāo)準(zhǔn),由2名主治醫(yī)師以上職稱的精神科醫(yī)師診斷一致;②無(wú)胃腸道、高血壓、糖尿病等系統(tǒng)性疾病,無(wú)雙相情感障礙等其他精神障礙;③糞便標(biāo)本收集前3個(gè)月無(wú)抗生素、益生元等微生態(tài)制劑使用史。健康對(duì)照組為同期參與體檢的健康志愿者,共20名(男性10名,女性10名),年齡24～40歲。入組標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)精神疾病及家族史,無(wú)精神發(fā)育遲滯/障礙;②無(wú)重大軀體疾病,不合并胃腸道、高血壓、糖尿病等系統(tǒng)性疾病;③糞便標(biāo)本收集前3個(gè)月無(wú)抗生素、益生元等微生態(tài)制劑使用史。參與者均自愿參與并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意執(zhí)行(倫理編號(hào)2020-6)。

1.2 糞便樣本收集與腸道微生物DNA提取

在清晨未進(jìn)食前,使用一次性15 mL無(wú)菌采便管收集患者和健康人的糞便標(biāo)本2～3 g,于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。使用OMEGA DNA試劑盒(Omega Bio-Tek, Norcross,美國(guó)),按照制造商的說(shuō)明書(shū)提取總基因組DNA樣本,并在進(jìn)一步分析之前儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中。使用NanoDrop NC2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)和瓊脂糖凝膠電泳來(lái)評(píng)估提取的DNA樣品的數(shù)量和質(zhì)量。

1.3 量表評(píng)估

告知所有參與者問(wèn)卷調(diào)查的目的和具體要求,并進(jìn)行抑郁癥自我評(píng)估量表(PHQ-9)、廣泛性焦慮障礙量表(GAD-7)評(píng)估和一般情況調(diào)查表評(píng)估。①PHQ-9用于篩查及評(píng)估抑郁癥狀,共有9個(gè)條目,總分值越高則抑郁程度越嚴(yán)重;②GAD-7為簡(jiǎn)明的焦慮癥狀自評(píng)表,共7個(gè)條目,總分值越高則焦慮程度越嚴(yán)重;③一般情況調(diào)查表主要包括對(duì)年齡、性別、家族有無(wú)精神疾病史、既往病史和現(xiàn)病史、失眠及便秘等情況的調(diào)查。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增及測(cè)序

使用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAG-GCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTA-CHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增。PCR體系包含 5 μL 緩沖液(5×),0.25 μL快速pfu DNA聚合酶(5 U/μL),2 μL(2.5 mmol/L)dNTPs,1 μL(10 μmol/L)正向和反向引物,1 μL DNA模板和14.75 μL ddH2O。反應(yīng)條件為98 ℃初始變性5 min,98 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s的25個(gè)循環(huán),最后在72 ℃延伸5 min。用Vazyme VAHTSTM DNA清潔珠(南京Vazyme)純化PCR擴(kuò)增子,并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen)進(jìn)行定量。擴(kuò)增子經(jīng)量化匯集后,使用Illumina NovaSeq平臺(tái)和NovaSeq 6000 SP試劑盒(500個(gè)循環(huán))進(jìn)行成對(duì)端2×250 bp測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)

使用DADA2進(jìn)行引物去除、質(zhì)量過(guò)濾、拼接和嵌合體去除,并使用QIIME2進(jìn)行評(píng)估。使用Vsearch(v2.13.4_linux_x86_64)在97%的相似度水平上對(duì)測(cè)序讀數(shù)進(jìn)行映射。參照Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 13.8, http://greengenes.secondgenome.com/)對(duì)獲得的運(yùn)算分類單元(operational taxonomic unit, OTU)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用QIIME2調(diào)用mafft和FastTree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。在OTU水平上使用了Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析物種Alpha多樣性。使用Unifrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析。使用QIIME2統(tǒng)計(jì)特征表來(lái)分析門和屬水平的物種組成。使用線性判別分析(LEfSe)來(lái)分析樣本間存在的差異微生物(Kruskal-WallisP值小于0.05,LDA得分閾值大于2.0)。R(4.0.0版)用于心理量表和樣品的OTU豐度的Pearson相關(guān)分析及可視化。使用SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Kolmogorov-Smirnov來(lái)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性,采用t檢驗(yàn)和Wilcoxon檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)差異的顯著性,雙側(cè)P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況統(tǒng)計(jì)

健康組與抑郁癥組男女比例均接近1∶1,抑郁癥組年齡為29.00±8.09歲,健康對(duì)照組年齡為34.65±4.44歲。抑郁癥組出現(xiàn)失眠和便秘情況的比例分別達(dá)到了79.0%和57.9%,而健康組失眠和便秘比例分別為10%和15%,兩組失眠與便秘狀況的構(gòu)成比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 一般情況統(tǒng)計(jì)

2.2 微生物結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 腸道菌群多樣性分析Alpha多樣性稀釋曲線顯示,兩組樣本的測(cè)序量都達(dá)到了飽和,多樣性指標(biāo)趨于穩(wěn)定(見(jiàn)圖1A)。抑郁癥組與健康對(duì)照組Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.547 5,P=0.493 8),即兩組腸道微生物樣本的群落豐富度無(wú)顯著差異。兩組Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明兩組被試腸道微生物群落的多樣性沒(méi)有顯著差異(見(jiàn)表2)。使用Unifrac距離算法對(duì)比兩組樣本的Beta多樣性,健康組樣本分布較為集中,抑郁癥組樣本較為分散,兩組樣本點(diǎn)重合度較低,提示了兩組被試腸道微生物群落構(gòu)成存在差異(見(jiàn)圖1B)。

A: Alpha多樣性稀釋曲線,紅色為抑郁癥組,藍(lán)色為健康組;B: Beta多樣性主坐標(biāo)分析(PCoA);C: OUT聚類維恩圖;D～E: 門/屬水平微生物堆積柱狀圖;F: LEfSe差異微生物群的LDA柱狀圖。

表2 腸道微生物Alpha多樣性

2.2.2 腸道菌群物種組成分析聚類分析顯示,健康對(duì)照組和患者組樣本中檢測(cè)到68個(gè)共有OUTs(見(jiàn)圖1C)。健康組與抑郁癥組在門水平結(jié)構(gòu)組成相似,主要為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(見(jiàn)圖1D)。與抑郁癥組相比,健康組厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度更高,而變形菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度較低。兩組樣本在屬水平的物種組成上也體現(xiàn)出明顯差異。樣本豐度均值比較顯示,抑郁癥組布勞特氏菌屬(Blautia)、芽殖菌屬(Gemmiger)、巨單胞菌屬(Megamonas)和埃希菌屬(Pseudescherichia)明顯高于健康組(見(jiàn)圖1E)。LEfSe分析展示了兩組樣本中具有顯著差異的標(biāo)志性物種,以LDA>2為閾值在健康組中共篩選到15個(gè)差異微生物類別,分別為糞球菌屬(Coprococcus),醋弧菌屬(Acetivibrio),Int～estinimonas,瘤胃球菌科(Ruminpcoccaceae),Harryflintia,芽孢桿菌目(Bacillales),毛螺菌屬(Lachnospira),Peptacetobacter,羅賓遜貝屬(Robinsonella),Acetanaerobacterium,韋氏非滲透桿菌屬(Dysosmobacter),伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia),Cloacibacillus,Vallitalea和Paoillibacter。在抑郁癥組中共篩選到6個(gè)標(biāo)志性物種,分別為大芬戈?duì)柕戮鷮?Finegoldia), 干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei), 腸桿菌目(Enter～obacterales),腸桿菌科(Enterobacteriaceae), 紡錘鏈桿菌屬(Fusicatenilbacter),和梭狀芽孢桿菌(Clostridia)(見(jiàn)圖1F)。

2.3 抑郁量表與微生物組相關(guān)分析

在PHQ-9和GAD-7總分的比較中,抑郁癥組和健康組得分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見(jiàn)圖2A)。為調(diào)查腸道微生物與心理健康狀況的相關(guān)性,結(jié)合兩組具有顯著差異的18種微生物類別與心理評(píng)估量表總分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析,可知健康組富集到的類球菌屬(Coprococcus)與GAD-7總分呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),Peptacetobacter與PHQ-9總分存在顯著正相關(guān)(P<0.05,見(jiàn)圖2B),其余差異微生物與兩種量表分別呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A: 抑郁癥組與健康組的PHQ-9和GAD-7量表總分直方圖,***P<0.001;B: PHQ-9和GAD-7總分與LEfSe差異微生物的Pearson相關(guān)性分析,*P<0.05。

3 討論

為盡可能減少影響菌群的變量因素的干擾,本研究以菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的青年人(20～45歲)為研究對(duì)象,限于嘉定地區(qū),并排除了軀體疾病和抗生素、益生菌等對(duì)菌群的干擾進(jìn)行研究。本研究共收集到19例抑郁癥患者和20例健康人的糞便樣本,經(jīng)16S rRNA高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析顯示,與健康人相比,抑郁癥患者存在腸道菌群失衡。抑郁癥組與健康組的微生物α多樣性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而β多樣性體現(xiàn)出了明顯的分群(PC1解釋度為22.96%,PC2解釋度為20.49%)。菌群物種組成分析表明,兩組樣本在門和屬分類水平的構(gòu)成和相對(duì)豐度均存在差異,抑郁癥組的腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成均出現(xiàn)了顯著的變化。進(jìn)一步的標(biāo)志性物種分析顯示,抑郁癥組的糞便樣本中富集了腸桿菌科(Enterobacteriaceae)[6]和大芬戈?duì)柕戮鷮?Finegoldia)[7]等炎癥相關(guān)的微生物。炎癥激活被認(rèn)為是抑郁癥和焦慮癥發(fā)病機(jī)制中重要的一環(huán),重性抑郁障礙患者在急性期促炎因子水平較高[8],而腸道微生物群的特異性變化以及由此產(chǎn)生的促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能誘發(fā)了抑郁癥的免疫失調(diào)[9],在疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。此外,全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)或外周炎癥信號(hào)可以通過(guò)血腦屏障傳遞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10],細(xì)菌代謝物的浸潤(rùn)也會(huì)直接或間接誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥激活,進(jìn)而造成腸腦軸的功能失調(diào)[11],可成為精神疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。因此,腸道微生物群的失衡可能參與了抑郁癥的發(fā)病機(jī)制,針對(duì)特異微生物靶點(diǎn)的干預(yù)或許可以有效控制抑郁癥患者體內(nèi)的炎性狀態(tài)。

本研究在對(duì)心理健康狀況與標(biāo)志性微生物的相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn),健康組富集的糞球菌屬(Coprococcus)與焦慮狀況呈顯著負(fù)相關(guān),抑郁癥患者樣本組中并未富集到糞球菌,這與近期研究的結(jié)論相似[12]。有研究報(bào)道,抑郁癥患者在接受治療后,其糞便中糞球菌的比例顯著增高[13],而糞球菌的豐度與良好的臨床治療表現(xiàn)明顯正相關(guān)[14],因此糞球菌的相對(duì)豐度或可作為抑郁癥臨床轉(zhuǎn)歸的微生物預(yù)測(cè)指標(biāo)。其他類似研究多以自然隊(duì)列為研究對(duì)象,然而影響菌群的變量較多,導(dǎo)致難以發(fā)現(xiàn)與抑郁癥本身相關(guān)的菌群特征。本研究盡可能排除影響菌群的潛在混雜因素,從而更容易獲得與抑郁癥本身相關(guān)的菌群結(jié)構(gòu)特征。此外,由于研究樣本量有限,且抑郁癥樣本組存在便秘的患者比例較高,因此這種基線差異可能對(duì)健康人與抑郁癥患者腸道微生物狀態(tài)的比較產(chǎn)生潛在影響。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了腸道微生物結(jié)構(gòu)失調(diào)與抑郁癥的相關(guān)性,并提出了治療抑郁癥的潛在微生物靶點(diǎn),為抑郁癥的治療和干預(yù)提供了相應(yīng)的依據(jù)。