厚胞湯治療宮腔粘連的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接研究

王涵芝 駱詩(shī)靈 瞿思穎 柯歡笑 蕭凡清 李心悅 王琳 趙宏利*

宮腔粘連（IUA）是由于子宮內(nèi)膜基底層受損導(dǎo)致纖維組織形成，間質(zhì)組織消失，組織間橋跨越子宮壁的各個(gè)方向，形成粘連［1-2］。IUA 患者常出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、子宮內(nèi)膜薄、反復(fù)流產(chǎn)，甚至可發(fā)生不孕［3-4］。IUA 的發(fā)病率1.7%～45.5%［5］，嚴(yán)重影響女性的生理心理健康。研究認(rèn)為腎虛血瘀是IUA 主要的病機(jī)，治法為補(bǔ)腎活血［6］。趙宏利主任醫(yī)師提出IUA“通補(bǔ)奇經(jīng)法”的治療，創(chuàng)立中藥復(fù)方“厚胞湯”。臨床上常用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探討［7-9］，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，對(duì)厚胞湯進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)、功能富集，篩選出與IUA 相關(guān)的活性成分、闡釋其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 厚胞湯成分靶點(diǎn)信息 使用Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)［10］（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）檢索出所有中藥化合物和靶點(diǎn)，從而了解其功能和作用機(jī)制，選取得分＞20 分納入。經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)［11］校正，去掉非人類靶點(diǎn)。

1.2 IUA 靶點(diǎn) 在GeneCards［12］（https：//www.genecards.org/）、NCBI［13］（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 以及DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)以“Intrauterine adhesion”為關(guān)鍵詞進(jìn)行人類基因檢索［14］。其中，GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)對(duì)得分的中位值篩選，選出更加相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 韋恩圖 通過(guò)venny2.1 軟件，將檢測(cè)出的藥物靶點(diǎn)和病變靶點(diǎn)加以結(jié)合，以獲得共有靶點(diǎn)，并利用這些靶點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)厚胞湯對(duì)IUA 的影響，從而實(shí)現(xiàn)作用通路的分析。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)將疾病及藥物的409 個(gè)共有靶點(diǎn)輸入到數(shù)據(jù)庫(kù)String［15］中，并且將“生物種類”選擇為“Homo sapiens”，達(dá)到0.9 以上的可信度，就可以構(gòu)造出一個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

1.5 拓?fù)浞治?將PPI 網(wǎng)絡(luò)插入到Cystoscape 3.8.0［16］中，應(yīng)用NetworkAnalyzer 開(kāi)展相關(guān)的拓?fù)浞治?，并且結(jié)合基因的degree 排序，從而確定出得分高于平均水平的基因成為重要靶點(diǎn)，構(gòu)建相關(guān)圖。

1.6 GO 富集分析 通過(guò)對(duì)藥物疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行的GO 生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分的富集分析。且利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)校正P＜0.05 的相關(guān)項(xiàng)目進(jìn)行篩選。采用R 4.0.3 軟件，設(shè)計(jì)并引入clusterProfiler、enrichplot和ggplot2 包，創(chuàng)建柱狀圖，從而實(shí)現(xiàn)圖像的精確呈現(xiàn)。

1.7 KEGG 通路富集 通過(guò)KEGG 通路的富集分析方法，把藥和疾病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，并應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選校正P＜0.05 的項(xiàng)目。采用R 4.0.3 軟件配置的clusterProfiler 包，并描繪柱狀圖來(lái)進(jìn)行深入研究。

1.8 成分、疾病、通路、靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)將Cytoscape3.8.0 中的成分、疾病、通路和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件輸入，可以更加直接揭示中醫(yī)藥活性成分在治療疾病流程中的多種作用機(jī)制，從而更好地了解其作用特征。

1.9 分子對(duì)接 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）中的AKT1（PDB ID：4GV1），TP53（PDB ID：1JSP），CREBBP（PDB ID：7XI0），SRC（PDB ID：4U5J），JUN（PDB ID：5AEP）靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，用Pymol 2.1 軟件，將蛋白分子加載到AutoDock Tools-1.5.6 軟件中，對(duì)蛋白添加Gasteiger 電荷，并添加氫原子，并將原子設(shè)置為AD4 類型，保存為pdbqt 文件?；衔锝Y(jié)構(gòu)（Linoleic-Acid，Lysine，Melanin，Sebiferic-acid，Trigonelline）均來(lái)自PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通過(guò)Chem3D 將化合物轉(zhuǎn)換為mol2 格式，并導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6 軟件，設(shè)置好旋轉(zhuǎn)鍵，保存為pdbqt 文件。受體為五個(gè)蛋白靶點(diǎn)，五個(gè)化合物作為小分子配體，Grid Box 設(shè)置為40 ?x40 ?x40 ?，對(duì)接中心分別設(shè)為（AKT1：x=-26.449，y=2.715，z=16.133；TP53：x=2.407，y=11.751，z=40.92；CREBBP：x=4.231，y=-0.035，z=-18.851；JUN：x=32.391，y=13.273，z=-4.235；SRC：x=1.902，y=-37.006，z=10.763），Grid Spacing 設(shè)為0.375，AutoDock vina 進(jìn)行批量分子對(duì)接，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。使用Pymol2.1 可視化物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合關(guān)系，2D 蛋白與小分子相互作用圖采用Discovery Studio 2019.01 軟件中的protein-ligand interction 模塊。對(duì)接算法采用Lamarckian 遺傳算法（最大值2,500 萬(wàn)次能量評(píng)估，最高次數(shù)為2,000，交叉率0.8，突變率0.02，獨(dú)立對(duì)接運(yùn)行100 次）的基礎(chǔ)研究，并通過(guò)結(jié)合自由能分析最終的對(duì)接分子。然后再根據(jù)化合物的對(duì)接分?jǐn)?shù)，來(lái)確定所篩選的化合物中是否存在活性成分。

2 結(jié)果

2.1 厚胞湯成分靶點(diǎn)信息篩選 經(jīng)匯總刪重后，化合物成分個(gè)數(shù)分別是阿膠3 個(gè)；柏子仁8 個(gè)；補(bǔ)骨脂14個(gè)；川牛膝3 個(gè)；當(dāng)歸83 個(gè)；枸杞子46 個(gè)；龜板6個(gè)；卷柏4 個(gè)；鹿角2 個(gè)；桑葚14 個(gè)；熟地黃4 個(gè)；菟絲子1 個(gè)；王不留行3 個(gè)；澤蘭4 個(gè)。去除重復(fù)及無(wú)效值后共得到1,868 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 IUA 靶點(diǎn)與韋恩圖的構(gòu)建 GeneCards 檢索到1,363 個(gè)靶點(diǎn)；NCBI 115 個(gè)靶點(diǎn)；DisGeNET 24 個(gè)靶點(diǎn)。把數(shù)據(jù)庫(kù)合并去重后，共得到1,842 個(gè)IUA 相關(guān)基因。通過(guò)將厚胞湯靶點(diǎn)與IUA 靶點(diǎn)輸入Venny 2.1 中，獲得409 個(gè)兩者共有的靶點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 厚胞湯-IUA交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?PPI 網(wǎng)絡(luò)由409 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1,466 條邊組成，其平均度值為7.17。（見(jiàn)圖2-3）。經(jīng)過(guò)把PPI 引入Cystoscape 3.8.0 中，采用NetworkAnalyzer相關(guān)的工具展開(kāi)拓?fù)浞治?，從而甄選出106 個(gè)關(guān)鍵的靶點(diǎn)，并且將排序前二十個(gè)靶點(diǎn)用R 4.0.3 進(jìn)行繪制（見(jiàn)圖4）。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖A

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖B

圖4 拓?fù)浞治鰣D（橫坐標(biāo)為每個(gè)靶點(diǎn)度值）

2.4 GO 富集分析 通過(guò)引入string 數(shù)據(jù)庫(kù)，將藥物疾病的共有靶點(diǎn)完成GO 富集，包括生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分，并且篩選出校正P＜0.05 的項(xiàng)目，共富集到3,785 條生物過(guò)程，128 項(xiàng)分子功能相關(guān)，241 項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān)。經(jīng)分析，厚胞湯改善IUA 的細(xì)胞成分為囊泡腔、膜筏、膜微域、膜區(qū)、分泌顆粒腔、細(xì)胞頂端部分、頂端質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、血小板α 顆粒、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔等；生物過(guò)程包含對(duì)藥物、上皮細(xì)胞增殖、脂多糖、氧水平、細(xì)菌來(lái)源分子、上皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、氧水平降低、活性氧代謝過(guò)程、營(yíng)養(yǎng)水平、腺體發(fā)育等的反應(yīng)；分子功能包括調(diào)節(jié)受體配體、信號(hào)受體激活、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等活性，并與DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素樣蛋白連接酶、細(xì)胞因子受體、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合（見(jiàn)圖5）。

圖5 GO富集分析圖

2.5 KEGG 通路富集 通過(guò)KEGG 通路富集分析共有靶點(diǎn)，過(guò)濾后，富集到總共184 條信號(hào)通路。主要包括PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信號(hào)通路等（見(jiàn)圖6）。

圖6 KEGG通路富集圖

2.6 成分—疾病—通路—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用Cytoscape3.8.0 導(dǎo)入成分、疾病、通路和靶點(diǎn)，繪制出一張完整的通路網(wǎng)絡(luò)圖，展示出厚胞湯的活性成分在治療IUA 過(guò)程中的特性（見(jiàn)圖7）。

圖7 成分—疾病—通路—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對(duì)接 在分子對(duì)接中，結(jié)合能越低，親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 表示兩個(gè)分子間有明顯的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，多數(shù)化合物與靶點(diǎn)蛋白匹配度良好且存在較好的結(jié)合作用，綜合表現(xiàn)最好的是Melanin 化合物。Melanin 除與TP53外，剩余對(duì)接均＜ -7.0，其中Melanin-JUN 結(jié)合能最小，為-10.8 kcal/mol，提示化合物與靶點(diǎn)間具有較強(qiáng)的親和力。將對(duì)接后化合物與蛋白形成的復(fù)合物應(yīng)用Pymol2.1 軟件進(jìn)行可視化，得到化合物與蛋白的結(jié)合模式，根據(jù)結(jié)合模式可以觀察到化合物與蛋白口袋相結(jié)合的氨基酸殘基（見(jiàn)圖8）。Melanin 與JUN 蛋白活性口袋的VAL-863、MET-929、VAL-911、ALA-880、LEU-983 氨基酸形成較強(qiáng)的疏水相互作用，與GLY-993、LEU-855、LEU-932 氨基酸形成氫鍵相互作用，對(duì)穩(wěn)定小分子有著重要貢獻(xiàn)。

圖8 JUN-Melanin分子對(duì)接

3 討論

IUA 的發(fā)病率逐年遞增，損害患者的生殖健康。此外，該病呈現(xiàn)高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，臨床上宮腔鏡下粘連分離術(shù)可恢復(fù)宮腔體積和形狀，但再粘連的復(fù)發(fā)率達(dá)3%～24%［17］。因此，放置宮內(nèi)節(jié)育器、導(dǎo)尿管球囊、透明質(zhì)酸凝膠等宮腔鏡術(shù)后輔助治療應(yīng)運(yùn)而生，但仍有14%～48%婦女在治療后粘連復(fù)發(fā)［18-19］。因此，探索宮腔鏡下IUA 分離術(shù)后有效的輔助治療方法有助于女性健康。

厚胞湯是趙宏利主任醫(yī)師在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合多年臨床實(shí)踐自擬的中藥復(fù)方［20］。該湯由當(dāng)歸、川牛膝、王不留行、龜板、鹿角片、阿膠珠等藥材組成，方中龜板填任脈以為靜攝，鹿角走督脈以為溫煦，當(dāng)歸入沖脈以為宣補(bǔ)，共同補(bǔ)養(yǎng)奇經(jīng)，補(bǔ)中有動(dòng)；當(dāng)歸補(bǔ)血和血，其氣最雄，川牛膝活血下行，其勢(shì)甚健，疏通奇經(jīng)瘀滯，通中有補(bǔ)［21］。IUA 病因多由手術(shù)損傷引起，即屬于中醫(yī)“不內(nèi)外因”之“金刃”直接損傷胞宮沖任，病機(jī)為“金刃傷胞，奇經(jīng)受損，瘀血內(nèi)阻”，治以補(bǔ)助通，以通為補(bǔ)，通補(bǔ)結(jié)合，共奏通補(bǔ)奇經(jīng)。經(jīng)過(guò)本課題組的前期研究，發(fā)現(xiàn)厚胞湯能夠顯著提升子宮內(nèi)膜厚度和容積，同時(shí)還能夠改善子宮動(dòng)脈血液供應(yīng)情況、提升黃體中期內(nèi)膜整合素αvβ3 同時(shí)下調(diào)增生期子宮內(nèi)膜相關(guān)因子的表達(dá)，臨床上常用該方提高子宮內(nèi)膜容受性從而有效防治IUA 松解術(shù)后的再粘連并改善相關(guān)癥狀［22-23］。為進(jìn)一步探究厚胞湯的作用機(jī)制，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，剖析厚胞湯防治IUA 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)與可能作用機(jī)制。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)厚胞湯治療IUA 的潛在機(jī)制。挖掘Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得藥物作用靶點(diǎn)1,868 個(gè)，挖掘3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得IUA 靶點(diǎn)1,842 個(gè)，獲得交集靶點(diǎn)409 個(gè)。應(yīng)用String 構(gòu)建PPI，對(duì)Cystoscape行拓?fù)浜Y出106 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，占總靶點(diǎn)數(shù)的25.9%，前20 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)為CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、PIK3R1、CTNNB1、HSP90AA1、MAPK14、RXRA、EGFR、ESR1、GRB2、MYC、NR3C1、TNF、SMAD3、CREB1、FOS、NCOA2。經(jīng)過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)的GO 和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)厚胞湯可通過(guò)DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素樣蛋白連接酶、RNA 聚合酶II、細(xì)胞因子受體、激素受體等，并調(diào)節(jié)受體配體、信號(hào)受體激活、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等活性改善IUA 相關(guān)癥狀，及其主要通路可能與PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信號(hào)通路等相關(guān)。

TGF-β1 被認(rèn)為是纖維化的中心介質(zhì)，IUA 患者和動(dòng)物模型中子宮內(nèi)膜纖維化面積增加，同時(shí)作為纖維化標(biāo)志物的TGF - β1 表達(dá)異常上調(diào)［24］，中藥可通過(guò)TGF- β1 / Smad 通路減輕IUA 大鼠子宮內(nèi)膜纖維化［25］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K / AKT）信號(hào)通路被報(bào)道可被TGF - β1 激活調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞反應(yīng)，且有研究表明KLB 蛋白可通過(guò)激活PI3K/Akt 通路增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞纖維化，從而促進(jìn)IUA 的發(fā)生發(fā)展［26］，F(xiàn)ENG 等也證明補(bǔ)腎活血湯可激活PI3K/Akt 通路［27］。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)與幾種氧化劑在衰老過(guò)程中發(fā)生非酶促反應(yīng)的結(jié)果，RAGE 與肺纖維化過(guò)程和肺泡穩(wěn)態(tài)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者的AGE-RAGE 比值增加［28］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種炎性細(xì)胞因子，持續(xù)的炎癥會(huì)導(dǎo)致纖維化［29］。

Melanin 可參與抗炎、清除自由基、增強(qiáng)免疫功能等生理、病理活動(dòng)［30］。研究發(fā)現(xiàn)，烏賊墨汁黑色素能通過(guò)改善腎組織的氧化應(yīng)激，減輕腎基質(zhì)間的纖維化通過(guò)介導(dǎo)PPAR-γ/TGF-β 代謝通路［31］。分子對(duì)接結(jié)果提示Melanin-JUN 對(duì)接良好，推測(cè)Melanin 在厚胞湯治療IUA 發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的研究表明厚胞湯中CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、TNF、SMAD3 等可能是治療IUA 的潛在生物標(biāo)志物，厚胞湯通過(guò)PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 等信號(hào)通路調(diào)節(jié)纖維化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，本研究對(duì)厚胞湯治療IUA 進(jìn)行了初步的理論探討。未來(lái)通過(guò)在細(xì)胞和動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來(lái)進(jìn)一步補(bǔ)充厚胞湯對(duì)IUA 的作用機(jī)制研究。