鐵死亡發(fā)生機(jī)制及其在三陰性乳腺癌治療中的研究進(jìn)展

裴秀君 姚航宇 王繼榮 馬波*

近些年，越來(lái)越多的研究在乳腺領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，但乳腺癌（breast cancer，BC）全球發(fā)病率仍在上升，已成為導(dǎo)致女性疾病負(fù)擔(dān)的主要癌癥。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是目前乳腺癌分子分型中最具侵襲力的類型，其異質(zhì)性高、預(yù)后差，在我國(guó)乳腺癌綜合治療及預(yù)后因素分析中尚具挑戰(zhàn)。因此，為三陰性乳腺癌患者開(kāi)發(fā)出更新型的治療藥物，提供更精準(zhǔn)的干預(yù)措施尤為迫切。鐵死亡（ferroptosis）是2012 年提出的細(xì)胞新型死亡方式，隨著這一概念的提出，人們發(fā)現(xiàn)鐵死亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及多重耐藥方面發(fā)揮著重要作用。近些年越來(lái)越多靶向鐵死亡的活性藥物被開(kāi)發(fā)應(yīng)用。通過(guò)藥物影響使細(xì)胞以這種獨(dú)特高效的方式死亡，已成為一種頗有前景的癌癥藥物研究策略。本文將對(duì)鐵死亡發(fā)生機(jī)制及其在三陰性乳腺癌治療中的作用進(jìn)行綜述。

1 鐵死亡概述

1.1 鐵死亡的發(fā)現(xiàn) 2003 年DOLMA 等［1］發(fā)現(xiàn)了一種新型化合物Erastin，由這種化合物所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡都是非凋亡性的。隨后YANG 等［2］發(fā)現(xiàn)了另一種可有效引起細(xì)胞發(fā)生此種死亡形式的化合物（Ras-selective-lethal compound 3，RSL3）。之后越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞以這種未知的方式死亡，這些現(xiàn)象象征著一種新型細(xì)胞死亡形式的出現(xiàn)，且該過(guò)程擁有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)變化，但尚不清楚其機(jī)制。直至2012 年DIXON等［3］根據(jù)其生物學(xué)特點(diǎn)將其正式命名為鐵死亡：一種鐵依賴性的，以細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積為特征的細(xì)胞死亡。

1.2 鐵死亡的特征 鐵死亡區(qū)別于傳統(tǒng)細(xì)胞死亡，頗有自己的獨(dú)到之處。其形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為：線粒體體積變小、膜密度增加、嵴顯著減少甚至消失，而細(xì)胞核大小又接近正常，無(wú)核濃縮或鮮有核染色質(zhì)邊緣化，這正是鐵死亡區(qū)別于凋亡、壞死、自噬等過(guò)程的主要形態(tài)學(xué)特征［3］；其生化特征主要表現(xiàn)為：細(xì)胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)活性氧（lipid reactive oxygen species，Lip-ROS）積累，胱氨酸谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（system Xc-）抑制以及NADPH 氧化增加等；其次，該過(guò)程不能在短期內(nèi)被細(xì)胞傳統(tǒng)死亡過(guò)程的抑制劑所抑制，卻可以通過(guò)鐵螯合劑、抗氧化劑等加以逆轉(zhuǎn)［1］。

2 三陰性乳腺癌細(xì)胞鐵死亡機(jī)制

鐵死亡過(guò)程的發(fā)生規(guī)律及其演變過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，目前認(rèn)為不同信號(hào)通路最終都會(huì)通過(guò)直接或間接影響谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的抗氧化活性，降低細(xì)胞整體抗氧化能力，致使脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加，Lip-ROS 堆積，最終引起細(xì)胞鐵死亡。

2.1 通過(guò)選擇性抑制System Xc- 誘導(dǎo)TNBC 細(xì)胞鐵死亡 1980 年System Xc-在人類胎兒成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)［4］，其是由跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11 和調(diào)節(jié)蛋白SLC3A2L 經(jīng)磷酸二硫鍵連接而成的異二聚體，介導(dǎo)胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞并將谷氨排出。腫瘤細(xì)胞胞外半胱氨酸含量不足時(shí)，可由轉(zhuǎn)硫途徑提供半胱氨酸（Cys），調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡［5］。抑制System Xc-對(duì)胞外胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，胞內(nèi)Cys 含量迅速減少，致使谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成進(jìn)一步受阻，而GSH 又是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPXs）發(fā)揮作用的必要輔助因子，因此導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞GPXs 活性進(jìn)一步降低，細(xì)胞抗過(guò)氧化能力相應(yīng)下降，細(xì)胞ROS 過(guò)度積累，從而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞鐵死亡。經(jīng)典高效的鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 通過(guò)選擇性抑制System Xc-活性誘導(dǎo)鐵死亡［3］。有研究表明System Xc-的兩個(gè)亞基表達(dá)水平?jīng)Q定了GPX4 在BC 中的表達(dá)，因此根據(jù)System Xc-狀態(tài)靶向BC 細(xì)胞鐵死亡為抗BC 治療帶來(lái)了新希望［6］。在低雌激素受體表達(dá)的BC 中，YU 等［7］發(fā)現(xiàn)柳氮磺胺吡啶可作為System Xc-抑制劑，引起B(yǎng)C 細(xì)胞鐵死亡。HASEGAWA等［8］認(rèn)為，下調(diào)MUCI-C/System Xc-信號(hào)通路同樣可以抑制TNBC 細(xì)胞活性甚至殺滅TNBC 細(xì)胞，從而使致瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移得到控制。因此，選擇性抑制TNBC 細(xì)System Xc-從而誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生或許是攻克TNBC 的新方向。

2.2 直接作用于TNBC 細(xì)胞GPX4 GPXs 家族包括GPX1-GPX8，DOLL 等［9］認(rèn)為，GPX4 在鐵死亡中扮演著重要角色。GPX4 在GSH 輔助下，將游離H2O2和Lip-ROS 分別降解為H2O 和相應(yīng)的醇，從而有效降低胞內(nèi)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物及有機(jī)氫過(guò)氧化物水平，避免由Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)量活性氧所致的鐵死亡［10］。與Erastin 作用機(jī)制不同，RSL3 能夠選擇性作用于靶細(xì)胞的GPX4 受體部位［11］，誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡。TNBC是一類富有鐵及脂質(zhì)的腫瘤，誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生對(duì)TNBC 治療極其重要。有研究表明PTL 的衍生物DMOCPTL，可通過(guò)泛素化GPX4 顯著抑制TNBC 細(xì)胞的增殖從而誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡和凋亡［12］。YANG 等［13］通過(guò)多組學(xué)測(cè)序發(fā)現(xiàn)TNBC 亞型LAR 腫瘤與鐵死亡存在明顯相關(guān)性，其主要鐵死亡抑制途徑與GSH 有關(guān)，且該過(guò)程由GPX4 所介導(dǎo)。除此之外，有研究表明在無(wú)家族史的BC 患者中ACSL4/GPX4 聯(lián)合水平可作為接受新輔助化療患者病理完全緩解的新型預(yù)測(cè)和預(yù)后生物標(biāo)志物［14］。因此，直接靶向GPX4 同樣可以高效誘發(fā)TNBC 細(xì)胞鐵死亡。

2.3 促進(jìn)TNBC 細(xì)胞Lip-ROS 堆積 在正常細(xì)胞生理周期中，脂質(zhì)氧化與還原處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但隨著腫瘤細(xì)胞癌變，這種平衡狀態(tài)將會(huì)被打破。過(guò)量的活性氧自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞成分產(chǎn)生不利修飾，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 損傷［15-16］等。ROS 可產(chǎn)生大量損傷細(xì)胞脂質(zhì)膜層結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）從而形成大量Lip-ROS，當(dāng)胞內(nèi)存在大量Lip-ROS 時(shí)就會(huì)引起鐵死亡，這就是“脂質(zhì)過(guò)氧化”。MA 等［17］報(bào)道，西拉明和拉帕替尼可使ROS 增多誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡，同時(shí)CDO1 過(guò)表達(dá)時(shí)BC 細(xì)胞GSH 水平降低，導(dǎo)致ROS 進(jìn)一步積累，從而加劇BC 細(xì)胞鐵死亡。此外，有研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤周圍脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)的TNBC 細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)鐵死亡抵抗現(xiàn)象，且該過(guò)程依賴脂肪細(xì)胞分泌的脂肪酸合成酶ACSL3［18］。雖然Lip-ROS 的過(guò)量積累在鐵死亡研究中發(fā)揮著重要的作用，但過(guò)多的Lip-ROS 到底來(lái)源于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、還是其他細(xì)胞組織的膜性結(jié)構(gòu)目前尚不明確。高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)小分子抗氧化劑如Ferropstatin-1 可以直接降低體內(nèi)Lip-ROS 的堆積，從而成功阻斷由Erastin 及RSL3等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)而發(fā)生的鐵死亡［3］。此外，PUFAs 還可以通過(guò)酶促或非酶促的氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)氫過(guò)氧化物。此時(shí)細(xì)胞的胞質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中如果存在著大量的鐵離子，脂質(zhì)氫過(guò)氧化物就會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生有毒性的脂質(zhì)自由基，從而造成細(xì)胞損傷。且這些自由基能轉(zhuǎn)移鄰近PUFAs 的質(zhì)子，啟動(dòng)細(xì)胞新一輪的脂質(zhì)氧化反應(yīng)最終造成一個(gè)更嚴(yán)重的細(xì)胞氧化性損傷。因此通過(guò)各種途徑加劇TNBC 細(xì)胞Lip-ROS 堆積，是TNBC綜合治療的一部分。

2.4 增加TNBC 細(xì)胞鐵含量 維持機(jī)體鐵離子平衡是正常生理功能所必需的。血液中游離的Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFRC）形成內(nèi)涵體進(jìn)入胞內(nèi)。隨后Fe3+在鐵還原酶前列腺六次跨膜蛋白3（STEAP3）的作用下被還原為Fe2+，從內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)溶膠中，然后通過(guò)細(xì)胞膜上的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin）泵出，或儲(chǔ)存于胞質(zhì)內(nèi)的鐵蛋白（ferritin）中。當(dāng)胞內(nèi)Fe2+過(guò)多時(shí)這種平衡將被打破，進(jìn)一步通過(guò)Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生高活性羥自由基，直接與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的PUFA 進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生大量的Lip-ROS，從而進(jìn)一步引發(fā)鐵死亡。有研究表明，在TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 細(xì)胞中高飽和度乳鐵蛋白可以通過(guò)增加細(xì)胞鐵含量，促進(jìn)ROS 的生成，導(dǎo)致了細(xì)胞鐵死亡等現(xiàn)象的發(fā)生。然而低飽和度乳鐵蛋白又可以通過(guò)上調(diào)SLC7a11的表達(dá)，增加GSH 的生成，從而抑制細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象的發(fā)生［19］。除此之外，Yu 等證實(shí)了抗HER2 治療后的關(guān)鍵基因成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4（FGFR4）可通過(guò)β-catenin/TCF4-SLC7A11/FPN1 軸加速胱氨酸攝取和Fe2+外排。抑制FGFR4可導(dǎo)致不穩(wěn)定鐵池積累，從而觸發(fā)細(xì)胞鐵死亡［20］。因此，增加細(xì)胞鐵含量，誘發(fā)鐵死亡發(fā)生或許可以有效阻止BC 患者的惡性進(jìn)展。

2.5 p53 介導(dǎo)的TNBC 細(xì)胞鐵死亡 已有研究表明，多種腫瘤抑制因子可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。因此，腫瘤抑制可能是鐵死亡先天性生理功能［21］。研究發(fā)現(xiàn)p53 除了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡。JIANG 等［22］認(rèn)為，p53可選擇性抑制System Xc-亞基SLC7A11 的異常表達(dá)，顯著抑制GPX4 活性，從而引起細(xì)胞鐵死亡。然而近期研究發(fā)現(xiàn)，p53 熱點(diǎn)突變蛋白p53R175H 可與轉(zhuǎn)錄因子BACH1 特異性結(jié)合。該過(guò)程既可以解除BACH1 對(duì)SLC7A11 的下調(diào)作用，抑制鐵死亡，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；又可以上調(diào)促轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［23］。因此，針對(duì)不同類型的p53 突變，個(gè)性化的治療方案尤為重要。在目前BC 鐵死亡研究中，p53 主要發(fā)揮促進(jìn)鐵死亡作用，但實(shí)際上該過(guò)程是否也存在雙重調(diào)控作用呢？更深入的研究或許可以為BC 患者提供更精準(zhǔn)的個(gè)性化治療方案。

3 鐵死亡在三陰性乳腺癌治療中的作用

3.1 在放化療中增強(qiáng)抗癌作用 TNBC 患者目前仍不能從傳統(tǒng)靶向治療中明顯獲益，化療仍是其積極選擇。但腫瘤細(xì)胞大量的凋亡逃逸使得多數(shù)腫瘤細(xì)胞逐漸對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。如何克服此類化療耐藥現(xiàn)象，使藥物發(fā)揮最大治療作用將成為新型抗腫瘤藥物亟待解決的問(wèn)題。使腫瘤細(xì)胞以鐵死亡的形式抑制其增殖，是否同樣可以增強(qiáng)抗癌作用呢？CHEN等［24］將經(jīng)典的鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 與他莫昔芬聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)Erastin 可以與他莫昔芬協(xié)同對(duì)抗癌細(xì)胞。因此，鐵死亡誘導(dǎo)劑與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，或許是解決BC 細(xì)胞化療耐藥的一種方法。在放療增敏中鐵死亡過(guò)程同樣發(fā)揮重要作用，其中乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）是一種多效性蛋白質(zhì)，鐵飽和型乳鐵蛋白（holo-lactoferrin，Holo-Lf）則是Lf 的飽和結(jié)構(gòu)形式，ZHANG 等［19］在多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，Holo-Lf 在TNBC 的聯(lián)合治療中發(fā)揮重要作用，可以有效增強(qiáng)TNBC 細(xì)胞內(nèi)的總鐵含量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ROS 和脂質(zhì)代謝中的過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛酶（MDA）的生成，致使腫瘤細(xì)胞鐵死亡。此外用Holo-Lf 聯(lián)合放療劑量4Gy 處理MDA-MB-231 細(xì)胞，可使Lip-ROS生成水平顯著升高，表明Holo-L 聯(lián)合放療確實(shí)能通過(guò)促進(jìn)鐵死亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

3.2 在免疫治療中增強(qiáng)抗癌作用 2019 年邵志敏教授團(tuán)隊(duì)將TNBC 分為4 個(gè)不同分型，包括間質(zhì)樣亞型、管腔雄激素受體亞型、免疫調(diào)節(jié)亞型、基底樣免疫抑制亞型。這使TNBC的分型變得更加科學(xué)與精細(xì)，治療方式變得更加全面而精準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上，此團(tuán)隊(duì)在TNBC 不同亞型鐵死亡領(lǐng)域的研究中取得了突破性進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)管腔雄激素受體亞型，以雄激素受體活性上調(diào)和管腔樣基因表達(dá)異常為共同特征，可通過(guò)有效激活氧化磷脂酰乙醇胺和調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝酶活性（特別是GPX4）來(lái)激活或誘導(dǎo)BC 細(xì)胞鐵死亡，同時(shí)也可以通過(guò)GPX4 抑制直接誘導(dǎo)鐵死亡。此期研究最富有臨床意義的發(fā)現(xiàn)是抑制GPX4 可以通過(guò)與抗PD1 免疫治療聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療效果，這將為難治性TNBC 開(kāi)展臨床藥物治療探索出新的研究策略［13］。免疫治療近些年在癌癥治療中發(fā)揮了一定作用，如何促進(jìn)癌癥免疫治療的應(yīng)用是目前需要攻克的難點(diǎn)。有學(xué)者提出一種較為獨(dú)特的PDTAC 策略，該策略由三個(gè)可替換模塊組成，以協(xié)助誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的光降解?；赑DTAC 策略的GPX4 靶向降解為誘導(dǎo)鐵死亡提供一種新的方法［25］。

3.3 在中藥材中增強(qiáng)抗癌作用 隨著中華傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的傳承與發(fā)展，中藥材在臨床治療中發(fā)揮的作用越來(lái)越大。枸杞多糖是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，有研究表明，其提取物中包含一種抗腫瘤多糖成分，可選擇性通過(guò)蛋白溶質(zhì)載體家族7 成員11（SLC7A11）和谷胱甘肽的過(guò)氧化酶4（x CT/GPX4）途徑間接介導(dǎo)TNBC細(xì)胞鐵死亡［26］。這將轉(zhuǎn)化為TNBC患者的現(xiàn)代中藥靶向治療，為抗癌研究提供了新思路。舒肝寧注射液（SGNI）是臨床治療肝臟疾病的中成藥，由于肝臟保護(hù)和免疫改善，也被廣泛用于癌癥輔助治療。有研究表明與非TNBC 細(xì)胞和正常細(xì)胞相比，SGNI 能以HO-1 依賴的方式誘導(dǎo)TNBC 細(xì)胞氧化應(yīng)激并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池積累，從而導(dǎo)致TNBC 細(xì)胞鐵死亡［27］。此外，重樓皂苷［28］、人參皂苷CK［29］、隱丹參酮［30］等均被證實(shí)可直接誘導(dǎo)或通過(guò)干擾不同信號(hào)通路間的傳導(dǎo)對(duì)TNBC 細(xì)胞鐵死亡產(chǎn)生一定影響，抑制并阻礙腫瘤細(xì)胞增殖。

3.4 在新型藥物傳遞系統(tǒng)中增強(qiáng)抗癌作用 近些年，外泌體成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，研究表明外泌體在阻止腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用。與此同時(shí)Erastin 作為鐵死亡誘導(dǎo)劑，存在水溶性差、生物利用率低等缺點(diǎn)。因此，需要一種有效的藥物遞送方法來(lái)克服Erastin 的障礙。YU 等［31］使用載有Erastin 的外泌體（Erastin@FA-exo），將Erastin 高效傳送至MDA-MB-231 細(xì)胞相應(yīng)靶點(diǎn)，從而精準(zhǔn)高效誘導(dǎo)MDAMB-231 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。RSL3 同樣存在水溶性低、生物相容性差等缺點(diǎn)，使得GPX4 抑制劑在體內(nèi)應(yīng)用受限。為使TNBC 細(xì)胞克服傳統(tǒng)化療抗性，有學(xué)者開(kāi)發(fā)了一種主動(dòng)靶向的小分子自組裝納米藥物。該藥物可同時(shí)傳遞化療藥物喜樹(shù)堿（CPT）、鐵催化劑（Fc）和GPX4 抑制劑（RSL3），形成三組分的納米藥物RSL3@CPT-SS-Fc，在腫瘤環(huán)境中較多的GSH 可以分解納米藥物，使細(xì)胞同時(shí)發(fā)生鐵死亡與凋亡［32］。因此，聯(lián)合新型藥物傳遞系統(tǒng)更精準(zhǔn)地將藥物傳送至相應(yīng)靶點(diǎn)協(xié)助增強(qiáng)抗癌效果，將成為腫瘤領(lǐng)域新型治療策略。

4 小結(jié)

近些年鐵死亡被定義為細(xì)胞新型死亡方式，成為醫(yī)學(xué)研究與生物學(xué)研究熱點(diǎn)。TNBC 缺乏特異性靶點(diǎn)，對(duì)化療藥物存在一定耐藥性，成為乳腺癌領(lǐng)域的難治性類型。隨著藥物應(yīng)用研究的不斷發(fā)展，鐵死亡在傳統(tǒng)中藥材中可以增強(qiáng)抗癌敏感性；使用新型藥物遞送方法可以更加安全精準(zhǔn)地傳送藥物至最理想作用位點(diǎn)。這些研究與發(fā)現(xiàn)都為腫瘤領(lǐng)域臨床治療及藥物應(yīng)用帶來(lái)了新希望。