甲殼動物JAK/STAT信號通路在免疫應(yīng)答中的功能與調(diào)控機制

趙付榮, 王 蔚,張艷閣,鄭 秦,陳建明*

(1.閩江學(xué)院地理與海洋學(xué)院、福建省海洋生物多樣性保護與永續(xù)利用重點實驗室,福建 福州 350108;2.福州海洋研究院,福建 福州 350108)

甲殼動物屬于無脊椎動物,是重要的經(jīng)濟類養(yǎng)殖動物,目前在水產(chǎn)品中的比重逐漸加大。作為代表性養(yǎng)殖甲殼動物的蝦類和蟹類,其需求量隨著人們生活水平的不斷提高而持續(xù)增加,蝦蟹類養(yǎng)殖業(yè)也得到了快速發(fā)展。但是飼養(yǎng)技術(shù)的不足與相關(guān)疾病的發(fā)生仍是蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的重大威脅,目前已知能感染蝦蟹的病原有病毒、細菌、真菌、立克次氏體和寄生蟲等,如白斑綜合征(WSD)、急性肝胰腺壞死綜合征(AHPND)等是影響?zhàn)B蝦業(yè)的最具侵略性的疾病[1]。在充滿病原微生物的復(fù)雜環(huán)境里,脊椎動物依靠先天性免疫和獲得性免疫兩種形式抵御病原微生物的侵害,而甲殼動物僅具有先天性免疫,主要存在細胞免疫與體液免疫兩種形式,其中體液免疫中的免疫信號通路發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2]。在無脊椎動物中,主要存在著3條免疫功能調(diào)控的信號通路:Toll、IMD和JAK/STAT。Toll和IMD信號通路主要參與抗細菌和真菌的免疫反應(yīng),少部分具有抗病毒免疫效應(yīng)[3-4],而JAK/STAT信號通路主要參與抗細菌和抗病毒免疫反應(yīng),但相關(guān)的分子機制尚未完全清楚[5]。

JAK/STAT 信號通路,即Janus激酶(JAK)-信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activators of transcription,STAT),這一信號通路于1994年,被Darnell等在研究干擾素誘導(dǎo)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)[6]。JAK/STAT信號通路是一種多種細胞因子共用的主要信號傳導(dǎo)機制,參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等,已在多種模式生物中被廣泛研究。隨著研究的深入,現(xiàn)已確定與蝦蟹同為無脊椎動物的果蠅(Drosophilamelanogaster)的JAK/STAT信號通路的核心成分,分別是配體(UPD)、酪氨酸激酶(JAK)、膜受體(Dome)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)[7-8]。細胞因子與相應(yīng)的受體結(jié)合后引起受體分子的二聚化,這使得與受體偶聯(lián)的JAK激酶相互接近并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾。受體磷酸化為細胞質(zhì)STAT創(chuàng)建對接位點,STAT通過酪氨酸磷酸結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)域被招募到受體復(fù)合物中,并自身磷酸化。活化的磷酸化STAT(pSTAT)通過分子間SH2-磷酸酪氨酸相互作用形成同源或異源二聚化,易位到細胞核,結(jié)合DNA調(diào)控元件,改變?nèi)旧|(zhì)可及性,誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[9]。該信號通路為細胞因子信號傳導(dǎo)的重要途徑,在進化上相對保守,廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及腫瘤生成等重要的生物學(xué)過程[9-10]。目前JAK/STAT信號通路的研究在信號識別、信號調(diào)控以及基因的調(diào)控表達方面成果非常豐富。但在甲殼動物中,關(guān)于JAK/STAT信號通路的關(guān)鍵元件及功能的報道有限,至今還沒有形成一個完整的體系[11]。

在先天免疫系統(tǒng)的研究中,果蠅等經(jīng)典的無脊椎動物模式生物[12],為蝦蟹等甲殼動物的JAK/STAT信號通路的研究提供了有效參考。研究人員發(fā)現(xiàn)蝦免疫系統(tǒng)的基本框架與昆蟲高度相似[11, 13],在蝦中發(fā)現(xiàn)了JAK/STAT信號通路的相關(guān)元件,并通過系統(tǒng)發(fā)育分析證明對蝦STAT與昆蟲STAT具有較高的同源性。本文從Dome、JAK、STAT、信號調(diào)節(jié)因子這4個方面來討論養(yǎng)殖甲殼動物JAK/STAT信號通路的研究進展。該信號通路上各組分的作用見表1。

表1 甲殼動物各元件在JAK/STAT通路中的作用Tab. 1 Role of each element in the JAK/STAT pathway in crustaceans

1 細胞因子受體(Dome)的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達和作用

果蠅細胞因子受體Dome(DoDome)是首次在無脊椎動物中被發(fā)現(xiàn)的細胞因子受體,有研究表明Dome蛋白的缺失會導(dǎo)致胚胎死亡。目前已在多種甲殼動物中鑒定到類似Dome的存在,包括中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[14]、紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)[15]、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[16]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[17]和日本囊對蝦(Marspenaeusjaponicus)[18]。

Dome屬于跨膜蛋白,含有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個部分。胞外區(qū)含有與細胞因子專一性結(jié)合的位點,與特異性配體結(jié)合啟動細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)變化較小,具有與酪氨酸激酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,與酪氨酸激酶結(jié)合后從而具備信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,介導(dǎo)JAK/STAT通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo),參與上游JAK/STAT反應(yīng)。細胞因子受體因胞外區(qū)與配體結(jié)合的特異性位點的不同,被分為不同的類型。不同種類生物的Dome在結(jié)構(gòu)上也有所差異,但是功能基本相似。

MjDome(Dome inMarspenaeusjaponicus)是首個在甲殼動物 JAK/STAT 通路中被報道的細胞因子受體,被發(fā)現(xiàn)于日本囊對蝦。MjDome與脊椎動物Ⅰ型細胞因子受體家族中白細胞介素6(IL-6)受體的胞外區(qū)具有相似的結(jié)構(gòu):細胞因子結(jié)合(cytokine binding modules,CBM)結(jié)構(gòu)域與細胞外Ⅲ型纖連蛋白(fibronectin-type-Ⅲ,FNⅢ)結(jié)構(gòu)域。研究表明,CBM結(jié)構(gòu)域參與Dome受體的激活而使下游信號順利傳導(dǎo)[38]。IL-6受體的CBM結(jié)構(gòu)域由CBMⅠ和CBMⅡ2個結(jié)構(gòu)域組成,CBMⅠ包含4個保守的半胱氨酸殘基,CBMⅡ包含1個五氨基酸WSXWS(Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser)基序,該保守基序廣泛存在于脊椎動物 I 型細胞因子受體中,它作為一個分子開關(guān)控制受體的激活[39]。

研究者通過序列分析發(fā)現(xiàn)MjDome的結(jié)構(gòu)含有1個信號肽,1個CBM結(jié)構(gòu)域,5個FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個跨膜結(jié)構(gòu)域[19]。Yan等通過分析LvDome(Dome inLitopenaeusvannamei)的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)其具有1個信號肽、2個CBM結(jié)構(gòu)域、3個FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[17]。有研究報道了中華絨螯蟹的Dome包含1個信號肽、5個FNⅢ結(jié)構(gòu)域、1個跨膜區(qū)和1個低復(fù)雜性區(qū)。通過多序列比對,EsDome(Dome inEriocheirsinensis)的氨基酸序列與IL-6受體和昆蟲的Dome具有較大差異,但系統(tǒng)發(fā)育分析顯示EsDome屬于甲殼動物類[14]。研究人員在紅螯螯蝦的CqDome(Dome inCheraxquadricarinatus)鑒定出1個N端信號肽、2個CBM結(jié)構(gòu)域、3個FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個跨膜結(jié)構(gòu)域。CqDome的CBM結(jié)構(gòu)域中,CBMⅠ包含4個保守半胱氨酸殘基,但CBMⅡ有一個不完整的WSXWS基序[15]。Laohawutthichai等發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對蝦的Dome(PmDome)包含1個信號肽、1個CBM結(jié)構(gòu)域、4個FNⅢ結(jié)構(gòu)域和1個跨膜結(jié)構(gòu)域[16]。以上甲殼類動物Dome經(jīng)氨基酸序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析后,均被歸為同一組,它們的結(jié)構(gòu)與IL-6受體相比,均沒有完整的WSXWS基序,并且FNⅢ結(jié)構(gòu)域的數(shù)量也有差異,但共同包含4個保守的半胱氨酸殘基及FNⅢ結(jié)構(gòu)域,所以推測甲殼動物與哺乳動物的Dome具有相似的功能。值得注意的是,不同生物的Dome中FNⅢ的數(shù)量可能不一致,FNⅢ結(jié)構(gòu)域廣泛存在于細胞因子受體中,參與蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定與功能調(diào)控[40],但FNⅢ的數(shù)量對Dome功能的影響還暫未報道,需進一步研究。

在甲殼動物中,Dome廣泛分布于血細胞、心臟、肝胰腺、鰓、腸等通常與機體的免疫功能相關(guān)的組織或器官中,但不同物種的Dome在不同器官或組織內(nèi)的表達量具有差異。研究人員對Dome在蝦蟹不同組織中進行表達研究發(fā)現(xiàn),Dome在日本囊對蝦的心臟中表達水平較高,在血細胞和肝胰腺中表達水平較低[18]。相反的是,紅螯螯蝦的CqDome在血細胞中表達水平最高[15],血細胞在甲殼動物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,Dome在血細胞中的高表達量可能有利于紅螯螯蝦對抗病原的免疫反應(yīng)。凡納濱對蝦Dome在血細胞、心臟、肝胰腺、鰓、腸中均有表達外,在肌肉和眼柄中表達水平較高[17],據(jù)報道,IL-6受體也在人類的肌肉中廣泛表達。中華絨螯蟹的Dome在鰓、血細胞、肌肉、心臟、腸、肝胰腺和胃中均有表達,且表達量依次降低[14]。在斑節(jié)對蝦中,研究人員發(fā)現(xiàn)PmDome在淋巴組織中表達量最高,在肝胰腺中表達量最低,淋巴組織是病原入侵對蝦后免疫功能發(fā)揮作用的主要組織。了解甲殼動物體內(nèi)Dome的分布有助于我們更好的了解其在先天免疫中的作用,這些組織或器官都與甲殼動物的免疫功能相關(guān),并且Dome分布廣泛,可能在病原入侵時能更快地將細胞外信號傳入細胞核。

Dome已被證實參與JAK/STAT信號通路的激活,并且與病毒的復(fù)制有關(guān),但是抗菌機制還有待研究。研究者發(fā)現(xiàn)LvDome可以作為一種受體激活JAK/STAT通路,WSSV可能誘導(dǎo)LvDome的表達,增強對蝦 JAK/STAT 通路的激活。LvDome過表達會顯著增強WSSV啟動子的轉(zhuǎn)錄,而敲降LvDome后WSSV在蝦中的增殖得到了抑制,降低了蝦的累積死亡率,表明LvDome可能被WSSV影響以利于病毒復(fù)制[17]。前人研究也發(fā)現(xiàn)紅鰲鰲蝦的CqDome基因沉默顯著抑制了WSSV的復(fù)制,這意味著WSSV可以利用CqDome進行復(fù)制,并且CqDome參與了紅螯鰲蝦JAK/STAT通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[15],這一研究結(jié)果與凡納濱對蝦的LvDome研究結(jié)果一致。在斑節(jié)對蝦的血細胞中,WSSV感染使PmDome表達上調(diào),沉默PmDome會對對蝦體內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達有顯著影響,而且降低了WSSV的拷貝數(shù),延緩了由WSSV引起的累積死亡率。在對日本囊對蝦的研究中發(fā)現(xiàn)MjDome可以與C型凝集素(MjCC-CL)卷曲結(jié)構(gòu)域結(jié)合,直接激活日本囊對蝦JAK/STAT信號通路從而對細菌入侵做出免疫應(yīng)答[18]。研究還發(fā)現(xiàn)在細菌入侵時,敲低中華絨螯蟹血細胞中EsDome后會影響部分抗菌肽的表達,它提示EsDome激活了JAK/STAT信號通路以及參與了調(diào)控抗菌肽的表達。但是細菌是以直接方式還是間接方式激活EsDome還不清楚[14]。

雖然蝦蟹的種類遠遠不止這些,但是上述研究結(jié)果為Dome介導(dǎo)并激活JAK/STAT通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活提供了強有力的證據(jù),也為其他甲殼動物中Dome的研究提供了參考。

2 JAK酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達和作用

JAK是一種細胞內(nèi)的非受體酪氨酸激酶,是細胞因子受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)銜接的信號分子家族。JAK家族是不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵組成部分,在細胞的生存、增殖、分化、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和抵抗病原方面起著重要作用[41]。目前在哺乳動物中報道JAK有4個亞型,分別是JAK1、JAK2、JAK3和TYK2(tyrosine kinase 2)。此外JAK有7個同源結(jié)構(gòu)域,分別是JH1—JH7[42]。據(jù)報道在果蠅中也發(fā)現(xiàn)了一種類似JAK功能的酪氨酸激酶Hopscotch(Hop),與哺乳動物的JAK2亞型同源性最高[43]。

在甲殼動物中,已在鹵蟲(Artemiafranciscan)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)、凡納濱對蝦和中華絨螯蟹中鑒定到JAK激酶,但是不同甲殼動物的JAK都是獨特的。JAK激酶通常含有一個FERM結(jié)構(gòu)域、一個SH2結(jié)構(gòu)域、一個假激酶結(jié)構(gòu)域和一個TyrKc結(jié)構(gòu)域[44]。其中FERM結(jié)構(gòu)域與SH2結(jié)構(gòu)域參與JAK與細胞因子受體的結(jié)合[45];假激酶結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為對調(diào)節(jié)TyrKc結(jié)構(gòu)域的活性至關(guān)重要[46];TyrKc結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)細胞因子受體和下游分子上酪氨酸殘基的磷酸化[14]。結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明,鹵蟲的AfJAK (JAK inArtemiafranciscan)、擬穴青蟹的SpJAK(JAK inScyllaparamamosain)與凡納濱對蝦的LvJAK(JAK inLitopenaeusvannamei)結(jié)構(gòu)相似,從N端到C端都包含一個FERM結(jié)構(gòu)域、一個SH2結(jié)構(gòu)域和兩個TyrKc結(jié)構(gòu)域。SpJAK、LvJAK和果蠅JAK具有較高的相似性,提示JAK蛋白在進化過程中較為保守,可能具有動物間相似的功能[19-20]。而中華絨螯蟹的EsJAK(JAK inEriocheirsinensis)除了包含一個SH2結(jié)構(gòu)域和兩個TyrKc結(jié)構(gòu)域外,還包含了一個Band 4.1同源結(jié)構(gòu),已知這些特異性酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)信號傳導(dǎo)并起到重要作用[14, 47]。

不同甲殼類JAK在不同的組織中表達,并廣泛分布于免疫器官或組織中。其中,SpJAK在腦、神經(jīng)和腸道中均呈現(xiàn)高表達,在鰓、胃、眼柄、肝胰腺、心臟和血細胞等大部分檢測組織中中度表達;在肌肉中的表達水平最低[19]。EsJAK在多種組織中均有表達,包括在鰓、腸、肝胰腺和心臟中表達。其中在肝胰腺中表達水平最高,在血細胞中表達最低[14]。LvJAK在鰓、血細胞、肝胰腺和腸中也均有表達。這些組織均為免疫組織,推測可能與免疫有聯(lián)系[29]。

甲殼動物的JAK激酶參與了JAK/STAT信號通路的抗菌和抗病毒反應(yīng)。AfJAK能夠以劑量依賴的方式激活昆蟲Sf細胞中D-raf原癌基因的啟動子活性,這與果蠅 STAT 在免疫應(yīng)答過程中激活D-Raf 原癌基因的結(jié)論一致,推測AfJAK可能參與MAPK級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控[21]。SpJAK可以通過促進STAT作用于其 DNA結(jié)合基序,增強WSSV wsv069基因啟動子的活性。這些結(jié)果表明SpJAK可以激活JAK/STAT通路。此外,在體內(nèi)沉默SpJAK可導(dǎo)致呼腸孤病毒(MCRV)感染的擬穴青蟹死亡率增高,并且使其病毒載量增高,推測SpJAK可能在MCRV防御中發(fā)揮重要作用[19]。LvJAK是JAK/STAT通路的靶基因,可作為正調(diào)控因子形成正反饋回路。此外,沉默LvJAK可導(dǎo)致更高的死亡率和病毒載量,提示LvJAK可能在WSSV的防御中發(fā)揮重要作用。其結(jié)果為JAK蛋白介導(dǎo)的正反饋回路在無脊椎動物中存在提供了證據(jù)[20]。

3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達和作用

STAT家族是JAK/STAT信號通路的關(guān)鍵組成部分,具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的雙重功能,當(dāng)細胞外受到刺激時會被激活從而控制基因的表達[41]。在無脊椎動物中,STAT參與多種生物過程中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控,可能涉及廣泛的發(fā)育階段以及組織分布[22,32]。目前在哺乳動物中已確定STAT家族有STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A/5B和STAT6七個主要成員[48]。但在甲殼動物中STAT僅僅發(fā)現(xiàn)一種,與哺乳動物的STAT5具有較高的同源性。已有研究表明在節(jié)肢動物和昆蟲中JAK/STAT途徑在機體抗病毒免疫中具有一定的作用[49]。

STAT蛋白通常由STAT相互作用結(jié)構(gòu)域、STAT all-alpha/beta結(jié)構(gòu)域、STAT DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和SH2結(jié)構(gòu)域組成[14]。其中STAT相互作用結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為促進了STAT-STAT二聚體的形成;STAT all-alpha/beta結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為有助于STAT-STAT二聚體進入細胞核;STAT DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有類似于p53腫瘤抑制蛋白的免疫球蛋白樣折疊功能;SH2結(jié)構(gòu)域作為磷酸化依賴的開關(guān)從而控制受體識別和DNA結(jié)合[50-51]。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)EsSTAT包含一個STAT相互作用結(jié)構(gòu)域、一個STAT all-alpha結(jié)構(gòu)域、一個STAT DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個SH2結(jié)構(gòu)域[14]。斑節(jié)對蝦的PmSTAT具有DNA結(jié)合域、SH2域和C末端反式激活域[23]。

凡納濱對蝦的LvSTAT(STAT inLitopenaeusvannamei)基因含有N-末端結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域和SH2結(jié)構(gòu)域[24]。中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)的FcSTAT(STAT inFenneropenaeuschinensis),包含蛋白質(zhì)相互作用域、全α螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、SH2結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域[22]。克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)中克隆了3個STAT亞型cDNA,結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明PcSTATs的三個亞型都包含了一個STAT相互作用域、一個STAT全α域、一個DNA結(jié)合域和一個SH2結(jié)構(gòu)域[25]。日本囊對蝦的蛋白包含STAT相互作用域、STAT all-alpha結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域和SH2結(jié)構(gòu)域[26]。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明,擬穴青蟹的SpSTAT(STAT inScyllaparamamosain)、中華絨螯蟹的EsSTAT(STAT inEriocheirsinensis)、凡納濱對蝦的LvSTAT、中國明對蝦的FcSTAT蛋白聚在一支,并且與人的STAT5較為密切[14]。上述幾種甲殼類動物STAT有類似的結(jié)構(gòu),并且系統(tǒng)進化樹分析同源性較高,表明STAT蛋白在進化過程中具有保守性,可能具有相似的功能。LvSTAT 在血細胞、肝胰腺中高表達[24]。EsSTAT在鰓、肝胰腺和血細胞等組織中均高表達[14];MjSTAT(STAT inMarspenaeusjaponicus)在肌肉、胃、腦和鰓組織中表達[26]?？梢奡TAT在不同動物不同組織的表達水平并不一致。

有研究表明WSV181可以通過控制STAT92E表達來抑制JAK/STAT信號傳導(dǎo),對感染了果蠅C病毒的轉(zhuǎn)基因果蠅以及注射重組WSV181和WSSV的凡納濱對蝦進行了感染實驗,結(jié)果顯示病毒載量增加且JAK/STAT途經(jīng)的組分轉(zhuǎn)錄水平降低,表明WSV181可通過抑制JAK/STAT途徑促進病毒增殖[52]。前人研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)凡納濱對蝦被WSSV感染時,WSSV并不破壞JAK/STAT通路,相反可以激活STAT使其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中從而促進WSSVIe1基因的表達[23]。凡納濱對蝦在WSSV刺激下STAT能夠發(fā)生磷酸化,并且STAT 磷酸化后進入細胞,調(diào)控效應(yīng)分子的表達[53]。在WSSV感染晚期STAT蛋白會由細胞質(zhì)進入細胞核,為了合成更多的STAT蛋白,STAT轉(zhuǎn)錄增強以此來補充細胞質(zhì)中減少的STAT蛋白量[54]。EsSTAT蛋白的抑制僅影響JAK/STAT信號傳導(dǎo),因為EsSTAT處于JAK/STAT信號傳導(dǎo)下游即末端的位置,JAK/STAT信號傳導(dǎo)的激活可以導(dǎo)致EsSTAT磷酸化,進而使磷酸化后的EsSTAT從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核[14]。在對中國明對蝦的研究發(fā)現(xiàn),STAT被WSSV誘導(dǎo)上調(diào)表達[22]。MjSTAT的磷酸化過程能夠被SOCS2抑制。當(dāng)SOCS2被干擾后,對蝦對細菌的清除能力增強,對蝦的死亡率減少[8]。STAT在JAK-STAT信號傳導(dǎo)的下游發(fā)揮作用,多位研究者已經(jīng)證實STAT在WSSV感染時可以發(fā)生磷酸化并且形成二聚體進入細胞核進而調(diào)控相應(yīng)基因的表達。這些研究都為進一步了解甲殼動物的天然免疫應(yīng)答提供了基礎(chǔ),有助于對甲殼動物的JAK/STAT信號傳導(dǎo)全面而具體的認(rèn)識。

4 負(fù)調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)及其在蝦蟹中的表達和作用

先天免疫是抵御病原體入侵的第一道防線。細胞因子介導(dǎo)細胞間的交流,在適當(dāng)程度下調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)是非常重要作用的。然而,先天免疫的激活必須嚴(yán)格控制,以避免過度的免疫反應(yīng)而造成不良影響。因此細胞因子受體信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控就顯得尤為重要[55]。JAK/STAT正調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件共同參與信號通路的調(diào)控已被證實[8]。介導(dǎo)JAK/STAT 信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子分別是:細胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子(SOCS)蛋白家族,蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)和活化STAT蛋白抑制因子(PIAS)。除了這些調(diào)控蛋白之外,多功能支架蛋白β-arrestin1與細胞因子TC45也參JAK/STAT途徑的調(diào)控。

4.1 細胞因子信號通路抑制因子(SOCS)

細胞因子信號通路抑制因子(SOCS)是反式調(diào)控元件的一種,受JAK/STAT信號通路調(diào)控表達,且能抑制該信號通路,具有負(fù)調(diào)控作用,但已有部分研究證明了SOCS分子在細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的正向調(diào)控作用[56]。SOCS包含8個家族成員,分為2個亞家族,分別被命名為Ⅰ型 (SOCS4—SOCS7) 和Ⅱ型 (CIS和SOCS1—SOCS3)[57],有研究表明在魚類中已鑒定到SOCS家族的新成員[58]。SOCS主要通過兩種方式調(diào)控JAK/STAT信號通路,一是通過SH2結(jié)構(gòu)域競爭性結(jié)合JAK激酶上磷酸化的酪氨酸殘基來抑制激酶活性[59],二是通過募集泛素連接酶形成復(fù)合體,并通過泛素化途徑降解標(biāo)記的靶基因[60]。

SOCS家族通常具有相似的結(jié)構(gòu),氨基端的N區(qū),中間的SH2結(jié)構(gòu)域和羧基端的SOCS-box。氨基端的N區(qū)為一段長度和核苷酸序列高度可變的可變區(qū);SH2結(jié)構(gòu)域能識別JAK激酶上磷酸化的酪氨酸殘基,參與信號的轉(zhuǎn)導(dǎo);羧基端的SOCS-box具有較高的保守性,作為底物蛋白識別模塊,參與蛋白酶對底物蛋白的泛素化和后續(xù)的降解[61-62]。

目前已在中華絨螯蟹、日本囊對蝦、凡納濱對蝦和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[27]體內(nèi)鑒定出SOCS,屬于SOCS2或SOCS6家族,不同物種SOCS中SH2結(jié)構(gòu)域與SOCS-box的氨基酸序列是保守的。在中華絨螯蟹的EsSOCS2(SOCS2 inEriocheirsinensis)中預(yù)測了ESS結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS-box。氨基端延伸的N-ESS結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是SOCS的特異性元件,它在SOCS2和CIS中作為結(jié)構(gòu)子域連接著SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS-box[63],SH2結(jié)構(gòu)域中包含一個酪氨酸磷酸化(Tyrosine phosphorylation, pY)位點(Arg230, Asp231和Ser232)。日本囊對蝦的MjSOCS(SOCS inMarspenaeusjaponicus)、凡納濱對蝦的LvSOCS2(SOCS2 inLitopenaeusvannamei)和克氏原螯蝦的PcSOCS2(SOCS2 inProcambarusclarkii)蛋白結(jié)構(gòu)中均具有SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS-box這兩個典型結(jié)構(gòu)域,并且MjSOCS與EsSOCS2、LvSOCS2、PcSOCS2分別具有56.2%、90.0%和57.0%的同源性,均屬于SOCS2家族。在中華絨螯蟹的EsSOCS6(SOCS6 inEriocheirsinensis)也包含SH2結(jié)構(gòu)域和 SOCS-box結(jié)構(gòu)域,并在其氨基端結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了一個長的可變區(qū),經(jīng)鑒定后屬于SOCS6家族[28]。

SOCS在不同甲殼動物的組織分布情況和各組織中的表達量差異印證了SOCS具有多種功能。EsSOCS2在肝胰腺、鰓、肌肉、心臟和性腺中表達量較高,在血細胞中表達量較低[29];EsSOCS6在肝胰腺和鰓中高表達,在造血組織中表達量相對較低;MjSOCS在心臟、鰓、腸道和淋巴器官中高表達,在血細胞、胃和肝胰腺中表達量很低;Wang等發(fā)現(xiàn)LvSOCS2在凡納濱對蝦的鰓、腸和上皮組織中高表達,在心臟和神經(jīng)的表達量為中等,在肝胰腺、幽門盲腸和血細胞中表達量較低。但另一研究結(jié)果表明,LvSOCS2在對蝦的血細胞、腸道和肝胰腺中高表達,在鰓中表達量極低,心臟中幾乎不表達。LvSOCS2在神經(jīng)組織中的表達表明了它可能參與了神經(jīng)元組織的分化[30]。PcSOCS2在心臟和肌肉中表達水平最高,在肝胰腺中呈低表達水平。

SOCS家族在協(xié)調(diào)細胞對多種細胞因子和生長因子的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,通過針對受體復(fù)合物調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號級聯(lián)以防止過度信號傳遞并恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)[64-66]。但目前關(guān)于SOCS參與甲殼動物免疫防御反應(yīng)的報道較少。研究發(fā)現(xiàn)鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)和藤黃微球菌(Micrococcusluteus)刺激中華絨螯蟹后,血淋巴細胞內(nèi)的EsSOCS2表達量升高,表明EsSOCS2可能在抗細菌感染中起重要作用[29]。此外,EsSOCS2被報道中在中華絨螯蟹中具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的功能[67]。研究人員還發(fā)現(xiàn)EsSOCS6可能通過調(diào)節(jié) NF-κB 信號通路在對病毒和細菌的免疫應(yīng)答中發(fā)揮綜合作用。在日本囊對蝦中發(fā)現(xiàn)了MjSOCS2,其表達量可受脂多糖、肽聚糖和聚肌胞苷酸影響,表明MjSOCS與對蝦的先天免疫有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn),MjSOCS2能夠抑制磷酸化的MjSTAT[31]。在凡納濱對蝦中,LvSOCS2能夠呈濃度依賴性抑制由LvJAK誘導(dǎo)的DmVir-1啟動子表達量上調(diào),這些結(jié)果提示LvSOCS2是 JAK/STAT 通路的負(fù)調(diào)控因子。此外,敲除LvSOCS后,WSSV感染凡納濱對蝦的死亡率降低,說明敲除LvSOCS2能增強凡納濱蝦對WSSV的抗性[30]。研究人員發(fā)現(xiàn)在克氏原螯蝦中可能存在20-hydroxyecdysone/SOCS2/ERK通路,而PcSOCS2是該信號通路的負(fù)調(diào)控因子[27]。

4.2 活化STAT蛋白抑制劑(PIAS)

活化STAT蛋白抑制劑(PIAS)蛋白家族通常作為負(fù)調(diào)控因子參與JAK/STAT信號通路的調(diào)控,是該信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和轉(zhuǎn)錄激活劑[68-69]。哺乳動物的PIAS蛋白家族有4個成員PIAS1、PIAS3、PIASx(PIAS2)和PIASy(PIAS4)。PIAS家族具有廣泛的功能,參與細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、免疫應(yīng)答等重要生物學(xué)過程[70-71]。在JAK/STAT信號通路中,PIAS與二聚化的STAT結(jié)合阻止STAT核易位,阻斷活化的STAT的DNA結(jié)合活性來抑制STAT誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄的能力[72-73]。

PIAS蛋白家族高度保守,具有共同的結(jié)構(gòu)特征: 氨基端的SAP結(jié)構(gòu)域、PINIT結(jié)構(gòu)域、RLD結(jié)構(gòu)域,以及羧基端的一個富含酸性氨基酸的結(jié)構(gòu)域(AD)和富含絲氨酸跟蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域(S/T-rich結(jié)構(gòu)域)。SAP結(jié)構(gòu)域參與序列特異性DNA或結(jié)構(gòu)特異性 DNA結(jié)合[74];PINIT結(jié)構(gòu)域參與了PIAS的核定位[75];RLD結(jié)構(gòu)域參與PIAS蛋白的 SUMO-E3連接酶的激活,并且可能參與PIAS與其他蛋白的相互作用[76];在 AD中存在一個推測的 SUMO1相互作用基序(SIM)[77]。C末端的S/T-rich結(jié)構(gòu)域最不保守,其功能還有待研究。

目前在甲殼動物中僅有一種PIAS被發(fā)現(xiàn),已在擬穴青蟹、日本囊對蝦和凡納濱對蝦中被報道[32-34]。SpPIAS(PIAS inScyllaparamamosain)、MjPIAS(PIAS inMarspenaeusjaponicus)和LvPIAS(PIAS inLitopenaeusvannamei)均有相似的結(jié)構(gòu)域特征,均包含SAP結(jié)構(gòu)域,PINIT結(jié)構(gòu)域,RLD結(jié)構(gòu)域和S/T-rich結(jié)構(gòu)域。

日本囊對蝦的MjPIAS在血細胞和肝胰腺高表達。研究發(fā)現(xiàn),MjPIAS通過抑制STAT的磷酸化與核易位來負(fù)向調(diào)控JAK/STAT信號通路對抗菌肽基因的表達來抑制日本囊對蝦的抗菌能力[34]。凡納濱對蝦的PIAS(LvPIAS)在肌肉中表達量最豐富,其表達水平受細菌和病毒刺激后均有不同程度的顯著變化應(yīng)答。LvSTAT與LvPIAS之間存在負(fù)反饋環(huán),LvSTAT誘導(dǎo)LvPIAS,LvPIAS抑制LvSTAT對LvPIAS啟動子的轉(zhuǎn)錄活性[33]。

4.3 多功能支架蛋白(βarrs)

βarrs(β-arrestins)是多功能支架蛋白,參與調(diào)節(jié)多種細胞表面受體的脫敏和內(nèi)吞作用[78-79]。哺乳動物中,有研究表明在IFN-γ治療后,核βarr1直接與細胞核中的STAT1相互作用,招募TC45加速STAT1去磷酸化[80];另一項研究發(fā)現(xiàn)GdX(位于Xq28 G6PD簇中的X連鎖基因,也稱為Ubl4A,泛素樣蛋白4A)能夠介導(dǎo)TC45和STAT3之間相互作用,促進STAT3去磷酸化[81]。在對蝦中,有兩個βarr(βarr 1和2)[35]和1個TC45。

在細菌感染后,STAT磷酸化增加,隨后其易位到細胞核中以誘導(dǎo)蝦血細胞中AMP的表達。βarrs和TC45加速了鰻弧菌(Vibrioanguillarum)攻擊對蝦STAT的去磷酸化,這些結(jié)果表明βarr1作為支架蛋白在TC45和STAT之間起橋梁作用,它加速了STAT在細胞核中的去磷酸化抑制了鰻弧菌感染對蝦中AMP的表達[36]。

4.4 蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)

蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTPs)是JAK/STAT信號通路中的STAT負(fù)調(diào)控因子,目前已知有超過130種PTPs被發(fā)現(xiàn),PTPs能使細胞質(zhì)中JAK激酶上磷酸化的酪氨酸殘基去磷酸化或使細胞核中的STAT去磷酸化來調(diào)控STAT的活性[81]。目前在甲殼動物中,PTPs的研究較少,僅發(fā)現(xiàn)了日本囊對蝦的TC45 (45-kDa form of TC-PTP)和凡納濱對蝦的LvPTPN6。日本囊對蝦的TC45包含一個活化區(qū)和一個位于C-端非活化區(qū)的核定位信號[36];凡納濱對蝦的LvPTPN6包含兩個SH2結(jié)構(gòu)域和蛋白酪氨酸磷酸酶催化(PTPc)結(jié)構(gòu)域[37]。

PTPs在甲殼動物體內(nèi)呈組織性分布。TC45在凡納濱對蝦的血細胞、心臟、肝胰、鰓、胃和腸中均有表達[36];LvPTPN6在神經(jīng)、肌肉和腸道中表達量最高,在心臟、肝胰腺中表達量偏低[37]。

研究者干擾日本囊對蝦的TC45基因后,使用細菌刺激日本囊對蝦,發(fā)現(xiàn)對蝦體內(nèi)STAT磷酸化水平升高,說明TC45通過對STAT去磷酸化負(fù)調(diào)控了JAK/STAT信號通路的抗細菌免疫[36]。在凡納濱對蝦中,LvPTPN6的表達受到干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)的調(diào)控,IRF可以直接與LvPTPN6的啟動子結(jié)合。值得注意的是,與典型的PTPs功能相反,LvPTPN6可以促進 STAT 的二聚化及核定位,這進一步提高了 STAT 靶向的免疫效應(yīng)基因的表達,并增強了蝦的抗病毒免疫[37]。

5 總結(jié)與展望

甲殼動物JAK/STAT信號通路與先天免疫系統(tǒng)相關(guān),并在應(yīng)對病原感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。各種細胞因子通過JAK/STAT信號通路參與介導(dǎo)機體各種生理病理反應(yīng)。在正常情況下,各種細胞因子能通過JAK/STAT信號通路介導(dǎo)的抵抗病原感染。反之,則會導(dǎo)致病原,特別是病毒可以利用該通路感染宿主。

病毒性疾病是水產(chǎn)殖業(yè)發(fā)展的主要威脅,應(yīng)用抗生素的傳統(tǒng)治療方法可以緩解疾病的發(fā)展,但抗生素的過度使用會導(dǎo)致機體耐藥和新疾病的發(fā)生。因此,蝦蟹養(yǎng)殖疾病防控策略的提出、先天免疫方面的研究顯得尤為重要。這里提出幾個未來研究的方向以供參考:

(1)目前關(guān)于JAK/STAT信號通路的研究大都集中在組成元件的鑒定、組成元件參與白斑綜合征病毒感染的機制研究方面。對各組成元件具體的監(jiān)管機制以及各元件之間的相互作用仍需要進一步探索。

(2)通路上主要元件的報道主要集中在STAT上,而關(guān)于JAK和Dome的相關(guān)報道則有限;關(guān)于通路與病毒感染機制的研究主要集中在白斑綜合征病毒方面,關(guān)于其他病毒感染、病原菌侵染的研究鮮有報道。而對于養(yǎng)殖甲殼動物危害比較大的疾病比如十足虹彩病毒病, 傳染性皮下和造血組織壞死病、急性肝胰腺壞死病等,這幾種疾病尚無有效的治療方法,死亡率非常高。因此對這些疾病的感染機制的研究,尤其是對其在JAK/STAT通路上的各元件對通路的影響機制的研究顯得十分迫切。以期做好疾病的防控工作,把生產(chǎn)實際的損失降至最低。

總而言之,JAK/STAT通路之間的分子機制尚未被完全闡明,在通路特征及功能的研究方面還需更進一步深入研究。深入研究JAK/STAT通路上已經(jīng)鑒定出來的對病原感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)基因和蛋白的功能,為蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)提供必要的疾病防控理論依據(jù)的同時,也為蝦蟹疾病防控提出有效的解決方法。