福建閩南地區(qū)與廣西北海地區(qū)波紋巴非蛤的形態(tài)差異與遺傳多樣性分析

周治東,張麗艷,霍云龍,李海平,何雪蒨,張躍平*

(1.福建海洋研究所,福建 廈門(mén) 361013; 2.福建省海島與海岸帶管理技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門(mén) 361013;3.福建省海陸界面生態(tài)環(huán)境聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門(mén) 361005;4.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門(mén) 361005)

波紋巴非蛤(Paratapesundulatas,舊稱:Paphiaundulatas)是我國(guó)東南沿海地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi),多棲息于低潮區(qū)至水深10 m左右的泥砂底質(zhì)中,俗稱“花甲”、“油蛤”等[1]。在我國(guó),波紋巴非蛤自然分布于浙江南部、福建、廣東、海南和廣西沿岸海域[2-3],其滋味鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,紋理清晰,色澤明艷,深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[4-6]。近年來(lái),隨著市場(chǎng)需求量的增加,波紋巴非蛤的采捕壓力過(guò)大,波紋巴非蛤自然資源遭受了毀滅性的破壞[7]。因此,我國(guó)已在福建、廣西等東南沿海地區(qū)大力發(fā)展波紋巴非蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[8-9]。然而,近年來(lái)福建閩南沿海波紋巴非蛤的淺海增養(yǎng)殖大量采用廣西外來(lái)苗種,種群結(jié)構(gòu)受人為活動(dòng)的干擾嚴(yán)重,這種非自然的交流導(dǎo)致不同種群間進(jìn)行基因交流,致使本地波紋巴非蛤的種質(zhì)資源遭受破壞,遺傳多樣性保護(hù)迫在眉睫[10]。

迄今為止,國(guó)內(nèi)有關(guān)波紋巴非蛤形態(tài)學(xué)[7,10]、分子遺傳學(xué)[10]的研究較少,而有關(guān)微衛(wèi)星分子標(biāo)記的研究多集中在微衛(wèi)星引物開(kāi)發(fā)方面[11]。本研究對(duì)采集于福建閩南地區(qū)及廣西北海地區(qū)的波紋巴非蛤種群樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)研究,探討不同群體間的形態(tài)差異和遺傳分化程度,以期為波紋巴非蛤遺傳特性研究、種質(zhì)資源的保護(hù)及養(yǎng)殖繁育提供理論和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

波紋巴非蛤樣品于2020年12月至2021年12月采自福建閩南地區(qū)(廈門(mén)同安灣海域、云霄東山灣海域、惠安大港灣海域)及廣西北海(北部灣海域),以下簡(jiǎn)稱廈門(mén)群體、云霄群體、惠安群體、北海群體,每個(gè)群體樣品數(shù)量不少于30枚(圖1)。隨機(jī)選取外殼完好的波紋巴非蛤個(gè)體進(jìn)行形態(tài)測(cè)量,測(cè)量完畢后每個(gè)群體隨機(jī)挑選24枚取其斧足及閉殼肌用95%的酒精固定,以備后續(xù)分子遺傳學(xué)研究。

圖1 4個(gè)群體波紋巴非蛤樣品外殼形態(tài)Fig. 1 Shell shape of four Paratapes undulatas populations

1.2 形態(tài)學(xué)測(cè)量方法

采用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺對(duì)波紋巴非蛤的形態(tài)特征參數(shù)進(jìn)行測(cè)量:分別獲得殼長(zhǎng)(Ls)、殼高(Hs)、殼寬(Ws)、韌帶長(zhǎng)(Lh)、前腹緣距(Af)、后腹緣距 (Ab)6個(gè)形態(tài)學(xué)參數(shù)(圖2);用精確至0.001 g的電子天平稱取殼質(zhì)量(Ms),共計(jì)847個(gè)測(cè)量數(shù)據(jù)。

圖2 波紋巴非蛤形態(tài)學(xué)測(cè)量參數(shù)示意圖Fig. 2 Diagram of morphological measurement parameters of Paratapes undulatas

1.3 分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

采用天根海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA,基因組DNA于4 ℃保存。本研究從已發(fā)表的波紋巴非蛤微衛(wèi)星引物中篩選出10對(duì)擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定且多態(tài)性較好的引物[10-12](表1),用于后續(xù)分析。

PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括17.15 μL雙蒸水、2.5 μL 10×PCR Buffer、1 μL模板DNA(50 ng/μL)、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1 μL反向引物、1 μL熒光標(biāo)記的M13-R、0.1 μL含有M13-R的正向引物、0.25 μL Taq酶。PCR反應(yīng)程序:95 ℃變性5 min;95 ℃ 45 s;退火(54～64 ℃)45 s;72 ℃ 45 s;循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,將PCR產(chǎn)物送青島派森諾基因科技有限公司進(jìn)行基因分型[13-16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)計(jì)算分析

將各性狀測(cè)量值處理成5個(gè)比例數(shù)據(jù)(Hs/Ls、Ws/Ls、Lh/Ls、Ms/Ls、Af/Ab)作為校正值對(duì)各群體的形態(tài)學(xué)差異進(jìn)行計(jì)算分析。采用SPSS 13.0軟件計(jì)算和分析,利用聚類(lèi)分析、主成分分析和判別分析等方法對(duì)4個(gè)群體的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行比較。其中聚類(lèi)分析采用歐式距離的最長(zhǎng)距離系統(tǒng)聚類(lèi)法;主成分分析將5個(gè)比例性狀計(jì)算得到兩個(gè)綜合性指標(biāo),即兩個(gè)互不關(guān)聯(lián)的主成分;判別分析對(duì)所有樣本進(jìn)行逐個(gè)判別,計(jì)算判別準(zhǔn)確率及綜合判別率[17-20]。

1.4.2 分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用GeneMarker 2.2.0對(duì)熒光PCR基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取,并輔以人工矯正。使用PopGene軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量指數(shù)、觀測(cè)雜合度以及期望雜合度[21]。使用F-stat 2.9.3軟件計(jì)算每對(duì)群體間遺傳分化指數(shù),同時(shí)進(jìn)行1 000次置換檢驗(yàn)分析其顯著性[22]。使用Population 1.2軟件計(jì)算群體之間的遺傳距離,并使用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)基于遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[23]。使用LEA包對(duì)進(jìn)行Structure分析[24]。通過(guò)BOTTLENECK 1.2.02軟件采用無(wú)限等位基因模型(IAM)、逐步突變模型(SMM)和雙相模型(TPM)3種模型檢測(cè)各群體是否經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)[25]。若等位基因頻率分布為L(zhǎng)型,說(shuō)明所檢測(cè)的群體近期沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)事件。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 形態(tài)參數(shù)測(cè)量比較

4個(gè)波紋巴非蛤群體的表觀形態(tài)特征參數(shù)測(cè)量結(jié)果如表2所示。對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)表明:各群體除殼長(zhǎng)外的6個(gè)度量形態(tài)特征均與殼長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)(P<0.01);且群體間各個(gè)度量形態(tài)特征數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.01)。

表2 4個(gè)波紋巴非蛤群體各參數(shù)測(cè)量結(jié)果Tab. 2 Summary of measurements of various parameters of four Paratapes undulatas populations

2.1.2 聚類(lèi)分析

對(duì)4個(gè)群體樣本的5個(gè)形態(tài)特征校正值進(jìn)行聚類(lèi)分析結(jié)果表明,北海與惠安群體形態(tài)特征最為接近,二者首先聚類(lèi),后與云霄群體聚類(lèi),而廈門(mén)群體則自成一支(圖3)。

圖3 波紋巴非蛤4個(gè)群體形態(tài)特征的聚類(lèi)分析Fig. 3 Cluster analysis of four Paratapes undulatas populations

2.1.3 主成分分析

對(duì)4個(gè)群體樣本的5個(gè)比例性狀進(jìn)行主成分分析,得到兩個(gè)主成分PCI和PC2,由表3可知,:PC1的貢獻(xiàn)率為36.134%,PC2的為21.443%,二者累積貢獻(xiàn)率僅為57.577%。在PC1中,Ms/Ls的貢獻(xiàn)最大,第二為Ws/Ls;在PC2中 ,Hs/Ls和Af/Ab貢獻(xiàn)最大。這兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率未達(dá)到85.0%,說(shuō)明波紋巴非蛤不同群體間的形態(tài)差異難以用幾個(gè)相互獨(dú)立的因子來(lái)解釋。

表3 波紋巴非蛤形態(tài)特征的主成分的負(fù)荷值和貢獻(xiàn)率Tab. 3 Contribution and load of principal components on morphological characteristics of Paratapes undulatas

PC1與PC2的散點(diǎn)圖如圖4所示。由圖4可見(jiàn)4個(gè)群體中北海與惠安群體有較多的重疊區(qū)域,說(shuō)明二者在形態(tài)參數(shù)上較為接近,云霄群體與廈門(mén)群體均獨(dú)立分布,較少與其余樣品重疊,區(qū)分明顯。該結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。

圖4 4個(gè)波紋巴非蛤群體的第一、二主成分的散布圖Fig. 4 Scatter diagram for PC1 and PC2 of four Paratapes undulatas populations

2.1.4 判別分析

利用逐步判別分析法篩選出5個(gè)性狀比例的特征值,建立4個(gè)群體的判別函數(shù),5個(gè)變量X1、X2、X3、X4、X5分別代表Hs/Ls、Ws/Ls、Lh/Ls、Ms/Ls與Af/Ab。表3為判別函數(shù)的各項(xiàng)系數(shù)及常數(shù)項(xiàng)。4個(gè)群體的判別公式如下:

Y廈門(mén)=1 134.881X1+899.281X2+373.775X3

-207.158X4+185.212X5-587.362

(1)

Y云霄=1 141.218X1+871.409X2+389.677X3

-27.383X4+165.181X5-585.651

(2)

Y惠安=1 119.267X1+880.459X2+393.719X3

+144.492X4+167.024X5-597.905

(3)

Y北海=1 148.237X1+882.468X2+393.311X3

-42.030X4+165.234X5-592.944

(4)

判別分析結(jié)果如表4所示:判別準(zhǔn)確率P1為43.3%～93.5%;判別準(zhǔn)確率P2為44.8%～88.0%;4個(gè)群體的綜合判別率為 66.1%。

表4 波紋巴非蛤4個(gè)群體的判別分析結(jié)果Tab. 4 Discriminant results of four populations of Paratapes undulatas

2.2 分子遺傳學(xué)研究結(jié)果

2.2.1 遺傳多樣性

本研究采用10對(duì)微衛(wèi)星分子引物對(duì)4個(gè)波紋巴非蛤群體96個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析。由表5可以看出,4個(gè)群體的遺傳差異較小,平均等位基因數(shù)范圍為6.40～6.60對(duì),平均有效等位基因數(shù)范圍為3.18～3.51對(duì),平均多態(tài)信息含量范圍為1.29～1.40,平均觀測(cè)雜合度范圍為0.39～0.50,平均期望雜合度范圍為0.62～0.70。

表5 波紋巴非蛤4個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 5 Genetic diversity parameters of four Paratapes undulatas populations

綜合各遺傳多樣性指數(shù)來(lái)看,4個(gè)群體中惠安群體的遺傳多樣性最高(平均期望雜合度為0.68,平均多態(tài)信息含量指數(shù)為1.40),云霄群體的遺傳多樣性最低(平均期望雜合度為0.62,平均多態(tài)信息含量指數(shù)為1.29)。

2.2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

4個(gè)波紋巴非蛤群體間的遺傳分化指數(shù)范圍為0.00～0.03,均呈現(xiàn)較低的狀態(tài),表明各群體的遺傳分化水平較弱。群體間遺傳距離范圍為0.08～0.11,云霄群體與其余3個(gè)群體間的遺傳距離均為最低(0.08),廈門(mén)群體與北海群體間的遺傳距離最大,為0.11,廈門(mén)群體與惠安群體間的遺傳距離為0.09(表6)。

表6 波紋巴非蛤4個(gè)群體間遺傳分化指數(shù)與遺傳距離Tab. 6 Genetic differentiation index and genetic distance among four populations of Paratapes undulatas

基于4個(gè)波紋巴非蛤群體之間的遺傳距離構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5),可知北海群體首先與惠安群體聚類(lèi),再與廈門(mén)和云霄群體聚類(lèi),未檢測(cè)到與地理位置相對(duì)應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu)。

圖5 基于遺傳距離構(gòu)建的四個(gè)波紋巴非蛤群體NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 NJ phylogenetic tree of four Paratapes undulatas populations based on genetic distance

2.2.3 自由交配估計(jì)

運(yùn)用Structure軟件,根據(jù)等位基因頻率不相關(guān)假設(shè)(allele frequencies independent assumption)[26],進(jìn)一步確認(rèn)波紋巴非蛤群體遺傳結(jié)構(gòu)。首先假設(shè)自由交配組群(K)可能為1～9,對(duì)每個(gè)假設(shè)自由交配組群進(jìn)行50次獨(dú)立重復(fù)運(yùn)算,最后使用最小二乘法估算出最佳自由交配組群(最小交叉熵值)為K= 1(圖6)。

圖6 波紋巴非蛤四個(gè)群體的交叉熵值Fig. 6 Cross entropy of four Paratapes undulatas population

2.2.4 瓶頸效應(yīng)檢測(cè)分析

利用BOTTLENECK軟件檢測(cè)波紋巴非蛤4個(gè)群體近期是否經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)事件(表7)。首先基于IAM、TPM和SMM 3種不同模型進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)。結(jié)果顯示在TPM模型下,所有波紋巴非蛤群體均未出現(xiàn)偏離突變-漂變平衡的現(xiàn)象,而在IAM模型下北海群體存在偏離現(xiàn)象,在SMM模型下廈門(mén)與云霄群體出現(xiàn)偏離現(xiàn)象。其次,Mode shift檢驗(yàn)結(jié)果顯示,4個(gè)群體的等位基因分布頻率均呈正常的L型分布。TPM是介于IAM和SAM之間的模型,其突變大多為逐步突變,TPM和SMM模型描述的位點(diǎn)突變模式更接近微衛(wèi)星的突變機(jī)理,因此TPM模型更適合微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的分析[27]。綜上所述,4個(gè)波紋巴非蛤群體近期未經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)事件。

表7 基于3種模型的波紋巴非蛤4個(gè)群體的瓶頸效應(yīng)檢測(cè)Tab. 7 Bottleneck effect detection of four Paratapes undulates populations based on three models

3 討論

3.1 4個(gè)自然種群波紋巴非蛤形態(tài)差異比較分析

貝類(lèi)養(yǎng)殖已成為海洋經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)中重要的一環(huán),其遺傳學(xué)相關(guān)研究也越來(lái)越受到生物學(xué)家的重視[28]。研究表明,在基因交流阻隔的情況下,同一種類(lèi)生物的不同地理群體也會(huì)出現(xiàn)較明顯的遺傳差異[29]。我們分析了福建閩南地區(qū)及廣西北海地區(qū)的波紋巴非蛤地理群體的多種形態(tài)學(xué)參數(shù),可知惠安與北海群體的形態(tài)差異最小,且與云霄、廈門(mén)群體之間均存在著一定的形態(tài)差異。這種差異一方面可能是由地理因素、環(huán)境條件決定的,但聚類(lèi)分析與主成分分析結(jié)果均表明惠安地區(qū)與北海地區(qū)的差異遠(yuǎn)比云霄和廈門(mén)小。造成這一結(jié)果的原因可能是惠安大港灣近岸海域近年來(lái)大量引進(jìn)北海地區(qū)波紋巴非蛤種苗,從事水產(chǎn)增養(yǎng)增殖活動(dòng)。這些人為商業(yè)活動(dòng)可能使群體間種質(zhì)交叉增多,向當(dāng)?shù)刈匀缓^(qū)釋放,從而大大增加了群體間基因雜交的概率[30]。另外,形態(tài)差異除了種質(zhì)本身的特性外,與餌料種類(lèi)、水文水質(zhì)、底質(zhì)類(lèi)型等因素也有較大關(guān)系[31-32]。

3.2 4個(gè)自然種群波紋巴非蛤分子遺傳學(xué)比較分析

傳統(tǒng)的貝類(lèi)遺傳學(xué)研究集中在其形態(tài)指標(biāo)上,但形態(tài)參數(shù)可能存在誤差,并不能完全準(zhǔn)確地反映物種的群體特性,因此需要結(jié)合分子生物學(xué)方法,獲得更加真實(shí)穩(wěn)定的遺傳學(xué)研究結(jié)果[33]。我們用分子生物學(xué)手段調(diào)查了福建閩南地區(qū)及廣西北海的波紋巴非蛤群體樣本,其遺傳多樣性均呈現(xiàn)較高的水平(多態(tài)信息含量指數(shù)>0.5),與駱軒等的研究結(jié)果[10]基本持平,說(shuō)明波紋巴非蛤群體仍具有較高的環(huán)境適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力。波紋巴非蛤能維持如此高的遺傳多樣性,除了與其有大量的有效補(bǔ)充群體外,還與其未經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)有關(guān)。3種突變模式對(duì)波紋巴非蛤的瓶頸效應(yīng)檢驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)雜合過(guò)剩現(xiàn)象,等位基因頻率均呈正常的L型分布,在群體擴(kuò)張的過(guò)程中等位基因丟失的概率較小,較多的遺傳突變得以保存[34]。隨著波紋巴非蛤資源的不斷破壞和國(guó)內(nèi)外需求的不斷增加,養(yǎng)殖無(wú)法僅依靠海區(qū)捕撈的天然苗種得到滿足,人工繁育大量興起[35]。在后期養(yǎng)殖過(guò)程中,波紋巴非蛤作為主要的海水養(yǎng)殖貝類(lèi)在不同養(yǎng)殖區(qū)間被頻繁的人為引種、貿(mào)易及增殖放流。而在形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)聚類(lèi)分析時(shí),發(fā)現(xiàn)廈門(mén)群體均獨(dú)立形成一支,遺傳分化指數(shù)和遺傳距離廈門(mén)群體也略高于其他群體,這可能與廈門(mén)海域有不少國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),禁止捕撈和灘涂養(yǎng)殖,該群體可能保留了更多的原始遺傳信息有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究中4個(gè)波紋巴非蛤群體間遺傳分化微弱,自由交配估計(jì)檢驗(yàn)也顯示所有群體為1個(gè)自由交配組群;NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類(lèi)結(jié)果未檢測(cè)到與地理位置相對(duì)應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu)。相較于沿岸流輸送波紋巴非蛤浮游期幼蟲(chóng)進(jìn)行群體間的基因交流,不同地區(qū)間的人為引種、貿(mào)易及增殖放流等活動(dòng)可能是造成波紋巴非蛤不同種群間基因頻繁交流的主要原因,其中廈門(mén)群體則保留了更多的原始遺傳信息。綜合形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)結(jié)果來(lái)看,在滿足養(yǎng)殖需求的前提下,仍需要保護(hù)本地波紋巴非蛤的種質(zhì)資源,防止外來(lái)群體的“生態(tài)入侵”。