• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞微流控芯片檢測(cè)研究進(jìn)展

    2023-12-22 11:12:30尉卓凡寧智文胡波袁時(shí)芳
    中國(guó)普通外科雜志 2023年11期
    關(guān)鍵詞:微流芯片抗體

    尉卓凡,寧智文,胡波,袁時(shí)芳

    (1.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 甲乳血管外科,陜西 西安710032;2. 西安電子科技大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,陜西 西安710126)

    在世界范圍內(nèi),乳腺癌已成為最常見(jiàn)的腫瘤,是女性癌癥患者死亡的主要原因[1],通過(guò)生物標(biāo)志物早期識(shí)別其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況至關(guān)重要。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTC) 最早由Ashworth 發(fā)現(xiàn),其數(shù)量和生物學(xué)特征等包含著癌癥進(jìn)展和治療反應(yīng)的關(guān)鍵信息,被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)的獨(dú)立預(yù)后因素之一[2]。CTC 的檢測(cè)為研究癌癥轉(zhuǎn)移提供了一種無(wú)創(chuàng)方法。作為CTC 臨床應(yīng)用研究最廣泛的腫瘤之一,已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種針對(duì)乳腺癌CTC 的檢測(cè)方法。然而,傳統(tǒng)檢測(cè)方法大多無(wú)法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)過(guò)程[3],不完整不準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果限制了CTC在臨床中的應(yīng)用。與之相比,微流控芯片為CTC的全面研究帶來(lái)了可能[4],憑借在特異度、敏感度、通量、效率上的優(yōu)勢(shì),微流控芯片具有將CTC實(shí)時(shí)檢測(cè)應(yīng)用于臨床的巨大潛力。其中三維(3D)打印技術(shù)可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的微流控芯片制造,從而獲取更多關(guān)于腫瘤有價(jià)值的信息,推動(dòng)CTC 從指導(dǎo)腫瘤預(yù)后到預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展,為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供前所未有的機(jī)會(huì)。本文對(duì)基于不同原理的CTC 檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié),著重分析了乳腺癌CTC 的微流控檢測(cè)研究現(xiàn)狀及進(jìn)展,對(duì)3D 打印微流控芯片的廣闊應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

    1 常見(jiàn)的CTC檢測(cè)方法與存在問(wèn)題

    外周血中的CTC 濃度非常低,大多數(shù)癌癥患者每毫升血液中僅1~10 個(gè)CTC[5],因此需要高敏感度和高特異度的技術(shù)來(lái)檢測(cè)。根據(jù)CTC 區(qū)別于血細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì),常見(jiàn)的檢測(cè)方法大致可分為兩類(lèi),即基于生物特性和基于物理特性的方法。

    1.1 基于生物特性的方法

    基于CTC 的生物學(xué)特征,通常利用附著在磁性物質(zhì)表面的細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體等來(lái)篩選CTC。

    陽(yáng)性富集通過(guò)靶向CTC 表面的特異性抗原來(lái)實(shí)現(xiàn),通??蓪?shí)現(xiàn)高純度富集。CellSearch 系統(tǒng)使用涂有上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抗體的鐵磁顆粒,對(duì)CTC 進(jìn)行免疫磁分離并計(jì)數(shù)[6],Cristofanilli 等[7]檢測(cè)了177 例MBC 患者的血液樣本后得到結(jié)論:每7.5 mL 血液中CTC≥5 個(gè)的患者,其無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)和總體生存期(overall survival,OS)更短。然而該方法易造成假陰性率高,現(xiàn)已停止生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。另外,CTC 經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 過(guò)程后會(huì)導(dǎo)致EpCAM 的下調(diào)或丟失[8],從而逃避陽(yáng)性富集系統(tǒng),即使是使用多種抗體組合的AdnaTest,也無(wú)法完全解決CTC 抗原異質(zhì)性導(dǎo)致的假陰性問(wèn)題[9]。陰性富集策略往往通過(guò)抗體靶向、消耗外周血細(xì)胞,最常用的是抗CD45 抗體[10],以高敏感度反向捕獲缺乏充分表達(dá)EpCAM 的CTC。但單獨(dú)使用此方法時(shí)往往降低了細(xì)胞純度,故通常與其他方法結(jié)合使用,例如Wu 等[11]開(kāi)發(fā)的CanPatrol 技術(shù)先裂解紅細(xì)胞(RBC),再用磁珠消耗CD45+的白細(xì)胞(WBC),在乳腺癌患者血液樣本中檢測(cè)到CTC 及腫瘤微栓子。但是這種方法可能導(dǎo)致CK+/CD45+或“雙陽(yáng)性”細(xì)胞的CTC 被去除以致低估其數(shù)量[5]。常見(jiàn)的基于生物特性CTC 檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用特點(diǎn)見(jiàn)表1。

    表1 常見(jiàn)的基于生物特性CTC檢測(cè)方法總結(jié)Table1 Summary of common CTC detection methods based on biological characteristics

    1.2 基于物理特性的方法

    CTC 以尺寸、密度、可變形性及介電性與血細(xì)胞相區(qū)別,一些技術(shù)據(jù)此可以快速分離富集CTC而無(wú)需標(biāo)記。

    Drucker 等[14]測(cè)試了幾種方法,其中RosetteSep?使用抗體將血樣中的PBMC 與RBC 交聯(lián)形成免疫玫瑰花結(jié),然后密度梯度離心將其去除,在MDA-MB-231 細(xì)胞加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中CTC 的捕獲效率約為40%,在15/28 例MBC 患者的血樣中檢測(cè)到CTC,ScreenCell ?使用微濾器基于細(xì)胞大小差異分離CTC,在加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為55%的回收率,并在8 例MBC 患者中的6 例檢測(cè)到CTC,這兩種設(shè)備在低至2 個(gè)CTC/mL 的水平下保證足夠的敏感度。但此類(lèi)方法容易忽略較小的CTC 和與WBC 具有相似變形能力的CTC,導(dǎo)致假陰性結(jié)果。密度梯度離心法利用了CTC 和WBC 的比重差異, 如Ficoll 法和OncoQuick 法,后者因結(jié)合了離心和過(guò)濾而具有更高的捕獲率[15]。另外,基于CTC 與血細(xì)胞之間介電性差異, ApoStream?通過(guò)介電泳(dielectrophoresis,DEP)進(jìn)行CTC 的富集[9],Le Du等[16]在47 例乳腺癌患者的血樣中檢測(cè)CTC,并聯(lián)合其他細(xì)胞標(biāo)志物對(duì)CTC 進(jìn)行染色區(qū)分3 種CTC 表型(上皮型、間質(zhì)型、癌癥干細(xì)胞樣CTC)。此方法雖然可以分離出單個(gè)CTC,但處理效率較慢,且細(xì)胞純度較低,電場(chǎng)亦會(huì)影響細(xì)胞表面活性和表面特征,影響后續(xù)分析[17]。

    基于免疫親和力的捕獲方法雖然特異度很高,但受限于CTC 表面標(biāo)志物的表達(dá),迄今為止,CTC的異質(zhì)性使其無(wú)法使用通用的特異性抗體來(lái)富集。而物理方法擺脫了靶向特定抗原的限制,未經(jīng)抗體標(biāo)記的CTC 也更利于后續(xù)表征分析,但離心、稀釋等預(yù)處理步驟會(huì)損失部分CTC,捕獲的CTC 純度并不令人滿意[18]。以上大多數(shù)CTC 檢測(cè)技術(shù)非常耗時(shí),需要熟練的操作人員和昂貴儀器。因此,需要開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)技術(shù),使CTC 的檢測(cè)更加方便、準(zhǔn)確和高效。常見(jiàn)的基于物理特性CTC 檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用特點(diǎn)見(jiàn)表2。

    表2 常見(jiàn)的基于物理特性CTC檢測(cè)方法總結(jié)Table 2 Summary of common CTC detection methods based on physical characteristics

    2 乳腺癌CTC的微流控芯片檢測(cè)

    微流控技術(shù)在CTC 檢測(cè)中的應(yīng)用出現(xiàn)于最近十幾年,微流控技術(shù)以高通量和敏感度精確控制微米級(jí)的流體和細(xì)胞,旨在將所有實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和功能集成到數(shù)十毫米尺寸的設(shè)備中,并以較低的成本和較短的分析時(shí)間對(duì)化合物進(jìn)行微處理和微量分析。與傳統(tǒng)方法相比,微流控芯片具有操作自動(dòng)化、消耗樣品少、敏感度高、通量大等優(yōu)勢(shì),并可將過(guò)濾、離心、磁選等集成到微尺度中[20]。小型、集成化的微流控芯片實(shí)現(xiàn)了CTC 富集、分離和分析的一站式過(guò)程,顯著減少了處理時(shí)間并提高捕獲效率,為開(kāi)發(fā)真正的即時(shí)診斷設(shè)備創(chuàng)造了可能。該技術(shù)對(duì)CTC 的檢測(cè)方法大致可分為兩類(lèi):基于標(biāo)記的檢測(cè)和無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)。

    2.1 基于標(biāo)記的檢測(cè)

    基于標(biāo)記的方法依賴免疫親和原理,微流控芯片精確控制流體的流動(dòng)速度和方向,通過(guò)影響CTC 表面抗原與抗體的相互作用從而直接影響捕獲效率。針對(duì)不同的細(xì)胞表面抗原,此類(lèi)方法可以進(jìn)一步分為正向富集或負(fù)向富集。

    2.1.1 正向富集 基于CTC 的抗原表達(dá),正向富集法最常用的是EpCAM。Nagrath 等[21]制作的CTCChip 利用具有EpCAM 抗體涂層的微柱,使用不同類(lèi)型腫瘤患者的全血樣本中進(jìn)行測(cè)試,在115/116 個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)了CTC,其中乳腺癌患者(n=10)全血樣本分離的CTC 數(shù)量為5~176 個(gè)/mL,捕獲的平均純度為60%。隨后又進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了人字形芯片(HB-Chip),通過(guò)產(chǎn)生微渦流使血細(xì)胞被動(dòng)混合,增強(qiáng)了CTC 與抗體包被芯片表面之間的相互作用,其捕獲效率比CTC-Chip 提升了26.3%。類(lèi)似地,微柱陣列、混沌混合、幾何增強(qiáng)混合和波浪人字形結(jié)構(gòu)等微流控平臺(tái),憑借幾何功能化微結(jié)構(gòu)可優(yōu)化免疫捕獲效率[22-24]。例如借助混沌混合[23]和波浪形HB 芯片[24]的優(yōu)點(diǎn)制作了T-μFS 微流體系統(tǒng),將10~103個(gè)MCF-7 細(xì)胞加標(biāo)于200 μL 全血中后捕獲,效率為83.3%~94.2%,且細(xì)胞存活率為94.6%,這為完整、自動(dòng)地捕獲和釋放高活性CTC 帶來(lái)可能[25]。免疫磁泳法多用EpCAM 抗體偶聯(lián)磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNP),隨后在磁場(chǎng)中富集與之結(jié)合的CTC。Wang 等[26]制備了含有抗EpCAM 抗體的水凝膠包被的MNP,將MCF-7 細(xì)胞加標(biāo)入血液中模擬CTC 的捕獲,效率約96%,同時(shí)檢測(cè)了5 例癌癥患者和5 名健康志愿者提供的血樣,結(jié)果在患者血液樣本中發(fā)現(xiàn)1~12 個(gè)CTC,而在健康血液樣本中未檢測(cè)到CTC,初步證明了其在臨床實(shí)踐中的實(shí)用性。同樣,Wu 等[27]用中性粒細(xì)胞膜對(duì)免疫磁性納米顆粒進(jìn)行表面功能化得到Neu-IMNs,可以同時(shí)減少非特異性蛋白質(zhì)的吸附和WBC 的干擾,并增強(qiáng)與CTC 的相互作用,成功從19/20 個(gè)乳腺癌患者血液樣本中分離出具有高純度和高活力的CTC,將其培養(yǎng)并進(jìn)行了基因突變分析。正向富集依賴特定的標(biāo)記物保證了高敏感度和純度,然而一些低表達(dá)或不表達(dá)EpCAM 的“正常樣”CTC[28]會(huì)減弱檢測(cè)的敏感度,從而影響對(duì)腫瘤的監(jiān)測(cè)和治療效果的評(píng)估。

    2.1.2 負(fù)向富集 負(fù)向富集靶向并去除背景細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)CTC 的分離。Mishra 等[29]提出了LPCTC-iChip,以慣性分離陣列設(shè)備去除RBC 和血小板,結(jié)合高梯度磁性細(xì)胞分選儀去除WBC 并富集CTC,該團(tuán)隊(duì)將熒光標(biāo)記的乳腺癌CTC 摻入健康供體的血樣中,回收率為(89.2±5.7)%,并對(duì)其進(jìn)行了分子分析。然而,此方法雖然降低了血細(xì)胞被誤識(shí)別為CTC 的可能性,但分離純度通常較低,因此通常需要多次分離過(guò)程[30],而且磁場(chǎng)中背景細(xì)胞的移動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致部分CTC 丟失[31]。此外,Szczerba等[32]發(fā)現(xiàn)CTC-WBC 簇的存在將增大乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛能,負(fù)向富集法可能會(huì)意外去除與WBC 相關(guān)的CTC?;跇?biāo)記的技術(shù)常利用特異性抗體靶向捕獲CTC,但這種方法受限于細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)。另外,由于抗體不可逆結(jié)合且不易降解,抗體標(biāo)記也會(huì)影響CTC 的完整性和活力[33],因此會(huì)影響后續(xù)分析。

    2.2 基于無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)

    無(wú)標(biāo)記法旨在減少使用特異性抗體而導(dǎo)致的誤差,既不影響細(xì)胞活力和基因表達(dá)譜,更有利于CTC 的下游分析,并有望實(shí)現(xiàn)更高的捕獲率[34]。其中主動(dòng)分選需要借助外力,通常利用電場(chǎng)、磁場(chǎng)、聲波或者光學(xué)驅(qū)動(dòng),而被動(dòng)分選使用特定的通道結(jié)構(gòu)、流體動(dòng)力或空間位阻來(lái)檢測(cè)CTC,常基于尺寸或慣性力進(jìn)行分選。

    2.2.1 主動(dòng)分選 主動(dòng)分選主要通過(guò)施加外力操縱細(xì)胞來(lái)分離CTC?;诩?xì)胞的電生理特性,DEP 利用介電粒子與電場(chǎng)之間的相互作用將CTC 分離、捕獲[9,35]。Jahangiri 等[36]在AC-CSC 芯片上施加低頻交流電場(chǎng)后,讓不同表型的乳腺癌細(xì)胞系(MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468)分別通過(guò)AC-CSC 芯片,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的極化程度相對(duì)更低,且不同表型的乳腺癌細(xì)胞有其特定的極化頻率,同時(shí),將MDA-MB-231 細(xì)胞與WBC 混合來(lái)模擬患者血液樣本,捕獲了約90% 的腫瘤細(xì)胞。Varmazyari 等[37]利用基于DEP 的微流控裝置,在保證細(xì)胞活力的情況下將乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞與WBC 分離,回收率和純度分別接近95%和100%。類(lèi)似地,不同細(xì)胞在聲場(chǎng)下受到不同的力,據(jù)此也可將CTC 分選、富集[33]。例如,Zhang 等[38]將交變頻率聲場(chǎng)應(yīng)用于微流控芯片,實(shí)現(xiàn)了從外周血單核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中無(wú)損分離三種不同的腫瘤細(xì)胞(MCF-7、A549、HCT116),即使在CTC 與PBMC 大小相近情況下也能實(shí)現(xiàn)有效分離,有效率高達(dá)95%,而PBMC 的污染率僅1%,為驗(yàn)證該方法的臨床應(yīng)用可能性,在4 例不同類(lèi)型和階段的癌癥患者中進(jìn)行測(cè)試,平均收集到75.5 個(gè)CTC/mL。光學(xué)微流體系統(tǒng)也可以用來(lái)分離CTC[39]。Hu 等[40]使用葉酸將同源RBC 與CTC 偶聯(lián),得到的CC-RBC 具有更大的體積和折射率,因此在光流體系統(tǒng)中的激光照明下可被精確分離,將人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞添加到2 mL血樣中測(cè)試,保持CTC 膜和功能的完整性的同時(shí),達(dá)到92%的純度和90%的回收率。

    2.2.2 被動(dòng)分選 在一項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)[41]中,Parsortix?系統(tǒng)基于細(xì)胞大小差異富集CTC,對(duì)216 例MBC 患者和205 名健康志愿者的外周血進(jìn)行測(cè)試,證明了該系統(tǒng)能夠富集CTC 并進(jìn)行后續(xù)下游分析,該系統(tǒng)已獲得FDA 批準(zhǔn)用于MBC 的CTC 富集。依賴物理屏障微結(jié)構(gòu)的建模往往很困難,而利用流體動(dòng)力學(xué)慣性效應(yīng),即可實(shí)現(xiàn)連續(xù)和精確控制流體而無(wú)需調(diào)節(jié)任何微觀物理結(jié)構(gòu)。Akbarnataj 等[42]使用具有梯形橫截面的不同曲率半徑的螺旋微通道,利用慣性升力結(jié)合迪恩渦流產(chǎn)生的拖拽力將CTC 聚焦于內(nèi)部出口,在2.5 mL/min 的流速下實(shí)現(xiàn)90% 的效率,捕獲的MCF-7 細(xì)胞高度存活。Zhu等[43]制造了PJMJ 微流體分選儀,將腫瘤細(xì)胞(A549、H460、MCF-7、H226 細(xì)胞)加標(biāo)入WBC 中模擬臨床樣本,實(shí)現(xiàn)了90.57%~94.14%的高回收率和48.67%~79.05%的純度,并且成功從MBC 和肺癌患者的血液樣本中分離CTC,捕獲率為每5 mL 樣本7~226 個(gè)CTC,驗(yàn)證了其臨床實(shí)用性。

    無(wú)標(biāo)記策略不會(huì)影響細(xì)胞活力及基因表達(dá)譜,更快的樣品處理確保了較大通量,然而CTC 的異質(zhì)性以及與背景細(xì)胞的重疊,導(dǎo)致其回收率和純度并不令人滿意。

    3 新興的集成技術(shù)及3D打印微流控芯片

    目前,對(duì)CTC 的研究已經(jīng)不限于單純枚舉數(shù)量,已有研究將基于各種原理的檢測(cè)手段集成在微流控芯片中,結(jié)合各自的優(yōu)勢(shì)并實(shí)現(xiàn)互補(bǔ),在有效分離和富集CTC 后對(duì)其進(jìn)行分子表征,據(jù)此可以幫助闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制、尋找治療靶點(diǎn)及監(jiān)測(cè)藥物效應(yīng)等[44]。

    Wang 等[45]設(shè)計(jì)了一種楔形微流控芯片,用免疫微粒標(biāo)記WBC 后在明場(chǎng)顯微鏡下區(qū)分CTC 并進(jìn)行全自動(dòng)化的計(jì)數(shù)、鑒定,將MCF-7、SK-BR-3 等細(xì)胞系摻入血液中,通過(guò)該芯片的形態(tài)識(shí)別可快速區(qū)分腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行捕獲。Lee 等[46]基于免疫磁泳和熒光標(biāo)記設(shè)計(jì)了Mag-Gradient 芯片,將MNP 與HER-2 結(jié)合,利用3 種生物標(biāo)志物(HER-2、ER 和PR)的差異性表達(dá),對(duì)4 種不同亞型乳腺癌細(xì)胞系(BT-474、SK-BR-3、MCF-7 和MDA-MB-231) 的混合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),借助磁場(chǎng)和免疫熒光信號(hào)完成乳腺癌CTC 捕獲和分型。Green 等[47]使用一種雙模塊微流控設(shè)備PillarX,其中Pillar 裝置基于細(xì)胞大小和可變形性,而X-磁裝置使用偶聯(lián)EpCAM 抗體的MNP,二者串聯(lián)來(lái)捕獲CTC 簇和單個(gè)CTC,除使用MDA-MB-231 荷瘤小鼠進(jìn)行測(cè)試外,在6 例MBC患者的血樣(500 μL)中成功檢測(cè)出CTC(12~79 個(gè))和CTC 簇(5~16 個(gè))。Schwab 等[48]制造的MyCTC 芯片,能夠在同一集成化設(shè)備中對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲、培養(yǎng)擴(kuò)增和藥物敏感性測(cè)試,在加標(biāo)癌細(xì)胞系樣本中的回收率分別為95%~98%和97%~99%,并且成功在1 例MBC 患者血液樣本中捕獲了單個(gè)CTC 和CTC 簇。Lv 等[49]設(shè)計(jì)了一種近紅外(near infrared,NIR)光響應(yīng)微流控芯片,并通過(guò)側(cè)流微陣列(lateral flow microarray,LFM) 芯片和光熱響應(yīng)系統(tǒng)的組合,在保證高活性的前提下實(shí)現(xiàn)單個(gè)CTC 的捕獲和無(wú)損釋放,將MCF-7 細(xì)胞加標(biāo)到全血中以模擬患者血液樣本, 捕獲的純度為(90±2)%。

    傳統(tǒng)的微流控設(shè)備基于光刻的制造工藝,復(fù)雜的制造步驟、昂貴的材料成本、耗時(shí)的制作過(guò)程均限制了微流控設(shè)備從實(shí)驗(yàn)室到實(shí)際臨床實(shí)施的轉(zhuǎn)化[50]。與之相比,3D 打印技術(shù)具有相對(duì)靈活性、直接性和快速原型制作的能力,能夠逐層打印出多種復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu),增加了微流控芯片的功能表面積,為精確和小型的微流控芯片制造提供便利[51],此外,各種適宜的原材料的出現(xiàn)將不斷豐富微流控設(shè)備的應(yīng)用范圍,促進(jìn)其在研究和臨床環(huán)境中被廣泛接受。

    Chen[52]等提出了一種3D 類(lèi)河灣截面微流控芯片,主要利用剪切梯度升力與迪恩曳力實(shí)現(xiàn)CTC的慣性聚焦及富集,將熒光標(biāo)記的人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞摻入兔全血進(jìn)行實(shí)驗(yàn),其最佳回收率和富集比分別可達(dá)到95.0%和1.90。本課題組[53]使用4 臺(tái)商用3D 打印機(jī)設(shè)計(jì)并打印了矩形截面蛇形微流控芯片模型,模擬確定了最佳通道曲率和流速并成功聚焦MCF-7 細(xì)胞。最近,Chu 等[54]借助3D打印技術(shù)將WBC 捕獲通道和微濾裝置結(jié)合在同一微流體設(shè)備中,利用抗CD45 抗體捕獲WBC,同時(shí)用過(guò)濾器耗竭RBC、血小板等,由此分離富集CTC,將人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞摻入健康志愿者提供的全血中測(cè)試設(shè)備性能,腫瘤細(xì)胞的平均恢復(fù)率為91.4%,并且保持了完整性及活力,也在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者(前列腺癌、胰腺癌)的外周血樣本分離出CTC,表明該裝置適用于不同的臨床情境。

    3D 打印微流控芯片可以為CTC 檢測(cè)和早期監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移開(kāi)辟新機(jī)會(huì),可以預(yù)測(cè),3D 打印技術(shù)在未來(lái)將會(huì)成為微流控芯片制造領(lǐng)域最為重要方法之一,為CTC 檢測(cè)廣泛應(yīng)用于臨床提供有益的見(jiàn)解。

    4 總結(jié)與展望

    CTC 的檢測(cè)可以為乳腺癌的進(jìn)展提供有價(jià)值的臨床見(jiàn)解,監(jiān)測(cè)患者在治療期間的反應(yīng)并為治療方案的制定提供參考。微流控技術(shù)以其成本低廉、操作簡(jiǎn)單、試劑消耗少、小型化、快速等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),越來(lái)越多地應(yīng)用于CTC 分離、鑒定和表征的各項(xiàng)研究中。3D 打印技術(shù)憑借設(shè)計(jì)靈活性,克服了微流控設(shè)備功能表面積有限的不足,為微流控芯片制造提出了一種更優(yōu)方案。在未來(lái),期望微流控芯片將常規(guī)用于CTC 的即時(shí)檢測(cè),這對(duì)研究乳腺癌及其轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究具有重要意義,將在癌癥的早期診斷、預(yù)后的觀察,以及患者的個(gè)性化治療方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:尉卓凡負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn),設(shè)計(jì)論文框架,論文撰寫(xiě),根據(jù)修改意見(jiàn)進(jìn)行論文修訂;寧智文負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn),對(duì)論文中微流控等專業(yè)領(lǐng)域部分做出修改解釋;胡波負(fù)責(zé)協(xié)助確定研究選題,提供相關(guān)研究材料支持,論文修訂,對(duì)微流控領(lǐng)域相關(guān)知識(shí)提供見(jiàn)解與指導(dǎo);袁時(shí)芳提出并確定研究選題,確定論文結(jié)構(gòu)框架,明確論文撰寫(xiě)內(nèi)容,論文修訂,給予指導(dǎo)性意見(jiàn)。

    猜你喜歡
    微流芯片抗體
    微流控法制備P(NIPA-co-MAA)水凝膠微球及其性能表征
    芯片測(cè)試
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    多通道采樣芯片ADS8556在光伏并網(wǎng)中的應(yīng)用
    微流控芯片在食品安全分析中的應(yīng)用進(jìn)展
    微流控SERS芯片的設(shè)計(jì)制備及其在細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用
    紙芯片微流控技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用
    乙肝抗體從哪兒來(lái)
    肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:44
    Galectin-7多克隆抗體的制備與鑒定
    74HC164芯片的應(yīng)用
    河南科技(2014年10期)2014-02-27 14:09:18
    琪琪午夜伦伦电影理论片6080| av在线天堂中文字幕| 校园春色视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 制服诱惑二区| 超碰成人久久| 一二三四社区在线视频社区8| 日本一本二区三区精品| 免费电影在线观看免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 妹子高潮喷水视频| 午夜福利视频1000在线观看| 搞女人的毛片| 国产精品av久久久久免费| 国产成人精品久久二区二区91| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品 国内视频| 99热只有精品国产| 在线观看www视频免费| 国产激情偷乱视频一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲专区字幕在线| cao死你这个sao货| 久久国产精品影院| 国产色视频综合| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲,欧美精品.| 人人澡人人妻人| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲无线在线观看| 国产精品九九99| 精品人妻1区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩欧美在线二视频| 成人手机av| cao死你这个sao货| 高清毛片免费观看视频网站| 制服丝袜大香蕉在线| 99国产精品一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 国产午夜福利久久久久久| 国产国语露脸激情在线看| 午夜影院日韩av| 老司机午夜福利在线观看视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 丝袜美腿诱惑在线| 日日夜夜操网爽| 久久中文字幕一级| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久久九九精品影院| 麻豆久久精品国产亚洲av| 热99re8久久精品国产| 久久人人精品亚洲av| 国产精品久久电影中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲在线自拍视频| 久久久久久久午夜电影| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲黑人精品在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产真实乱freesex| 欧美日本亚洲视频在线播放| 老司机福利观看| 免费在线观看完整版高清| 国产精品野战在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩高清综合在线| 18禁观看日本| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美三级亚洲精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一级a爱片免费观看的视频| 女同久久另类99精品国产91| 久久精品人妻少妇| 亚洲av电影不卡..在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 9191精品国产免费久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 999久久久精品免费观看国产| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜免费鲁丝| 搡老妇女老女人老熟妇| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲免费av在线视频| 欧美午夜高清在线| 看黄色毛片网站| 麻豆av在线久日| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日韩欧美在线二视频| 90打野战视频偷拍视频| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 国产主播在线观看一区二区| 一级毛片女人18水好多| 亚洲av第一区精品v没综合| 999精品在线视频| 91麻豆av在线| 亚洲精品美女久久av网站| 又黄又粗又硬又大视频| tocl精华| 男人舔女人下体高潮全视频| 丁香六月欧美| 中国美女看黄片| av中文乱码字幕在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 香蕉丝袜av| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲熟女毛片儿| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲av成人av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| xxxwww97欧美| 波多野结衣高清作品| 香蕉av资源在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品爽爽va在线观看网站 | av在线天堂中文字幕| 岛国视频午夜一区免费看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲激情在线av| 欧美激情久久久久久爽电影| 成人国语在线视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产99白浆流出| svipshipincom国产片| 精品国产乱码久久久久久男人| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品免费一区二区三区在线| aaaaa片日本免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 黄片播放在线免费| 麻豆av在线久日| 午夜福利欧美成人| 欧美日本视频| 久99久视频精品免费| 国产精品,欧美在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 天堂√8在线中文| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 脱女人内裤的视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品av久久久久免费| 可以在线观看的亚洲视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久香蕉精品热| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲国产精品成人综合色| 大型av网站在线播放| 亚洲精品在线观看二区| aaaaa片日本免费| 国产成人系列免费观看| 久久 成人 亚洲| av超薄肉色丝袜交足视频| 制服人妻中文乱码| 精品久久久久久久末码| av在线播放免费不卡| 亚洲自偷自拍图片 自拍| aaaaa片日本免费| av在线天堂中文字幕| 最好的美女福利视频网| 精品国产国语对白av| 免费在线观看成人毛片| 国产一区二区在线av高清观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产成人av激情在线播放| 国产色视频综合| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 丝袜在线中文字幕| 成人欧美大片| 国产成人av教育| 嫩草影院精品99| 久久久国产欧美日韩av| 欧美性长视频在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产成人欧美在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 美国免费a级毛片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美中文综合在线视频| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 悠悠久久av| av电影中文网址| 亚洲男人的天堂狠狠| 免费看十八禁软件| 1024香蕉在线观看| 亚洲成人久久性| 一本综合久久免费| 亚洲国产精品久久男人天堂| 窝窝影院91人妻| 欧美日本视频| 757午夜福利合集在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜激情av网站| 日本黄色视频三级网站网址| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜两性在线视频| 99精品在免费线老司机午夜| 老司机午夜十八禁免费视频| or卡值多少钱| 美女免费视频网站| 国语自产精品视频在线第100页| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲成人久久爱视频| 欧美日韩乱码在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 男人舔女人的私密视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 中文亚洲av片在线观看爽| 一区二区日韩欧美中文字幕| av电影中文网址| 精品一区二区三区四区五区乱码| 1024香蕉在线观看| 91在线观看av| 午夜成年电影在线免费观看| 1024手机看黄色片| 91av网站免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲精华国产精华精| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久香蕉精品热| 国产激情欧美一区二区| 婷婷丁香在线五月| 久99久视频精品免费| 亚洲国产精品成人综合色| 黄片小视频在线播放| 国产三级在线视频| 在线观看免费视频日本深夜| 一区二区三区国产精品乱码| 校园春色视频在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 欧美zozozo另类| 女性生殖器流出的白浆| 久热这里只有精品99| 国产精品影院久久| 一二三四在线观看免费中文在| 色综合婷婷激情| 最新美女视频免费是黄的| 国产97色在线日韩免费| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产91精品成人一区二区三区| 国产三级在线视频| 999精品在线视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品 欧美亚洲| 美女 人体艺术 gogo| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| АⅤ资源中文在线天堂| 一区福利在线观看| 免费看a级黄色片| 不卡一级毛片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线观看舔阴道视频| 我的亚洲天堂| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精华一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日本 av在线| av中文乱码字幕在线| 成人av一区二区三区在线看| 女同久久另类99精品国产91| 欧美性长视频在线观看| 色综合婷婷激情| 中文字幕久久专区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲一区中文字幕在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 男女那种视频在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲人成伊人成综合网2020| 麻豆成人午夜福利视频| 大香蕉久久成人网| 色播亚洲综合网| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 午夜免费观看网址| 美女免费视频网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99精品久久久久人妻精品| 国产人伦9x9x在线观看| 波多野结衣高清无吗| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲av熟女| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 91字幕亚洲| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 黄色视频不卡| 久久香蕉国产精品| 国产一区二区激情短视频| 日韩三级视频一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 亚洲av美国av| 亚洲精品一区av在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 一级毛片女人18水好多| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99热6这里只有精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产麻豆成人av免费视频| svipshipincom国产片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 天堂√8在线中文| 最近在线观看免费完整版| 欧美中文综合在线视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线观看免费视频日本深夜| 搡老岳熟女国产| 国产精品精品国产色婷婷| 性欧美人与动物交配| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 91麻豆av在线| 午夜久久久在线观看| 欧美中文综合在线视频| 国产av一区在线观看免费| 91老司机精品| 看免费av毛片| 色播在线永久视频| netflix在线观看网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美成人午夜精品| 日韩精品中文字幕看吧| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日本视频| 女性被躁到高潮视频| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲成人免费电影在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲真实伦在线观看| 美女免费视频网站| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av成人av| av在线天堂中文字幕| 日韩av在线大香蕉| 啪啪无遮挡十八禁网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产日本99.免费观看| 特大巨黑吊av在线直播 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产av在哪里看| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 俄罗斯特黄特色一大片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久久久久久免费视频了| 成人精品一区二区免费| 天天一区二区日本电影三级| 午夜两性在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 日本 av在线| 国产午夜精品久久久久久| 日本免费a在线| 在线观看午夜福利视频| 一进一出抽搐动态| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日本一本二区三区精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 午夜福利高清视频| av欧美777| 久久久久久国产a免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美色视频一区免费| 91麻豆av在线| 脱女人内裤的视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 不卡一级毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 88av欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频| 后天国语完整版免费观看| 国产成人欧美在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产伦在线观看视频一区| 久久精品91蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产主播在线观看一区二区| 色综合站精品国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲免费av在线视频| 午夜免费鲁丝| 国产精品99久久99久久久不卡| www.自偷自拍.com| 在线永久观看黄色视频| 99国产综合亚洲精品| tocl精华| 欧美国产日韩亚洲一区| 香蕉久久夜色| 老司机靠b影院| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一本大道久久a久久精品| 午夜视频精品福利| 久久天堂一区二区三区四区| 国产亚洲精品久久久久5区| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品 欧美亚洲| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利高清视频| 在线免费观看的www视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产亚洲欧美98| 麻豆一二三区av精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 啦啦啦免费观看视频1| 嫩草影院精品99| 日韩有码中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产亚洲精品av在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 淫秽高清视频在线观看| 午夜精品在线福利| 级片在线观看| 男人舔女人的私密视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲专区国产一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 免费看日本二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品乱码久久久久久99久播| 1024视频免费在线观看| 亚洲专区国产一区二区| www日本黄色视频网| 十八禁人妻一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久人人精品亚洲av| www.www免费av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 91成年电影在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 无限看片的www在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲中文日韩欧美视频| 韩国精品一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| bbb黄色大片| 亚洲av成人一区二区三| 男人舔女人的私密视频| 国产三级黄色录像| 一进一出抽搐动态| 人人妻人人看人人澡| av中文乱码字幕在线| 香蕉丝袜av| 人妻久久中文字幕网| 亚洲色图av天堂| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 最新美女视频免费是黄的| 动漫黄色视频在线观看| 天堂√8在线中文| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日日夜夜操网爽| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产又爽黄色视频| 精品久久久久久久末码| 91老司机精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| av在线天堂中文字幕| 精品欧美一区二区三区在线| 成年版毛片免费区| 香蕉av资源在线| 成年人黄色毛片网站| 麻豆一二三区av精品| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲国产精品成人综合色| 中文在线观看免费www的网站 | 色综合婷婷激情| 搡老岳熟女国产| 中国美女看黄片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲全国av大片| 成人免费观看视频高清| 亚洲成a人片在线一区二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 1024香蕉在线观看| 久99久视频精品免费| 一本大道久久a久久精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 制服诱惑二区| 9191精品国产免费久久| avwww免费| 久久香蕉激情| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 美女大奶头视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产成人系列免费观看| 国产国语露脸激情在线看| 香蕉久久夜色| ponron亚洲| 免费看美女性在线毛片视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲在线自拍视频| 国产野战对白在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 中文字幕av电影在线播放| 成人三级黄色视频| 91国产中文字幕| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜免费观看网址| 99久久精品国产亚洲精品| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 18禁美女被吸乳视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产成人系列免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 99国产精品一区二区三区| 天堂动漫精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 99久久久亚洲精品蜜臀av| av视频在线观看入口| 一级毛片精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 又紧又爽又黄一区二区| 极品教师在线免费播放| 国产精品一区二区免费欧美| 搡老岳熟女国产| av福利片在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久精品欧美日韩精品| 级片在线观看| 国产又爽黄色视频| 日本一区二区免费在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久中文字幕一级| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久狼人影院| 免费在线观看成人毛片| 在线观看www视频免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品乱码久久久久久99久播| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品在线观看二区| 最近在线观看免费完整版| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲九九香蕉| 国产1区2区3区精品| 国产一卡二卡三卡精品| 精品久久蜜臀av无| 波多野结衣高清无吗| 好男人在线观看高清免费视频 | 日韩三级视频一区二区三区| 天堂影院成人在线观看| 99re在线观看精品视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品综合久久久久久久免费| www.www免费av| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产高清视频在线播放一区| www国产在线视频色| 黄色女人牲交| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 女警被强在线播放| 日本 av在线| 国内精品久久久久精免费| 制服丝袜大香蕉在线|