臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部炎癥的作用機制探討

聶進，劉代順，張建勇，劉楚，周亮△

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以持續(xù)氣道癥狀和氣流受限為特征的異質(zhì)性疾病，具有高發(fā)病率、高病死率和高疾病負擔(dān)的特點，嚴(yán)重影響患者的生存生活質(zhì)量［1-2］。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，我國COPD 的發(fā)病形勢仍然嚴(yán)峻［3］。間充質(zhì)干細胞具有促進損傷組織修復(fù)和再生、免疫調(diào)節(jié)抑制炎癥反應(yīng)、維持組織穩(wěn)態(tài)的功能［4］。大量研究表明，間充質(zhì)干細胞的治療潛力主要取決于其通過旁分泌產(chǎn)生的細胞外囊泡，而外泌體（Exosomes）是囊泡中主要的效應(yīng)活性物質(zhì)［5］。外泌體通過其攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 和miRNA等生物活性因子轉(zhuǎn)移至免疫細胞、內(nèi)皮細胞等受體細胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)修復(fù)作用［6］，可應(yīng)用于炎癥性疾?。?］、自身免疫性疾?。?］、癌癥［9］等多種疾病的治療。間充質(zhì)干細胞來源的外泌體是一種基于無細胞的新的治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞外泌體是COPD、哮喘等肺部疾病的潛在治療藥物［10-11］，但其具體機制尚未完全明確。本研究通過香煙煙熏聯(lián)合脂多糖（LPS）霧化吸入的方法構(gòu)建COPD大鼠模型，探究人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體對COPD氣道炎癥的作用及其機制，為外泌體治療COPD 提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8 周齡雄性SPF 級SD 大鼠18 只，體質(zhì)量190～210 g，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014。本研究經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會審批后實施（批準(zhǔn)號：KLL-2019-019）。

1.2 實驗試劑與儀器 遵義牌香煙（焦油量13 mg，煙堿量1.3 mg，一氧化碳量14 mg）購自貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司遵義卷煙廠；LPS購自美國Sigma公司；人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體購自天九再生醫(yī)學(xué)（天津）科技有限公司；白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自湖南艾方生物科技有限公司；磷酸化核因子κB（p-NF-κB p65）兔單克隆抗體、核因子抑制蛋白（IκBα）兔單克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）兔多克隆抗體購自英國Abcam 公司；Toll 樣受體4（TLR4）兔多克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；核纖層蛋白B1（Lamin B1）兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；放射免疫沉淀法緩沖液（RIPA）裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RNAeasyTM動物RNA 抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；StarScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×RealStar Fast染料法qPCR預(yù)混液購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；全波長酶標(biāo)儀（1510）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高速冷凍離心機（TGL-16）購自湖南湘儀有限公司；熒光定量PCR 儀（Mx3005P）購自美國Agilent公司；高速低溫組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司，全自動輪轉(zhuǎn)式切片機（RM2255）購自德國Leica 公司；希森美康全自動血細胞分析儀（XE2100）購自日本Sysmex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD 大鼠模型建立與分組 18 只SD 大鼠采用隨機數(shù)字表法分成Control 組、COPD 組、COPD+Exosome（Exo）組，每組6 只。COPD 組和COPD+Exo 組大鼠采用香煙煙熏聯(lián)合LPS 霧化吸入的方法建立COPD 模型，COPD 模型在Shu等［12-13］研究的基礎(chǔ)上進行適當(dāng)調(diào)整，方法如下：將大鼠置于自制煙熏玻璃箱（50 cm×40 cm×40 cm）中，每周連續(xù)煙熏5 d，2 次/d（每次8 支煙，兩次間隔8 h），然后第6—7 天予10 mL LPS溶液（0.1 g/L）加入振動超聲霧化器中霧化吸入1 h，共持續(xù)24周。參考Shi等［14］研究，建模后第2天，COPD+Exo 組尾靜脈注射100 μL人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體稀釋液（含外泌體2×107個），Control 組、COPD 組注射等量磷酸鹽緩沖液（PBS），各組注射1次，觀察1周。觀察大鼠的一般情況，記錄其行為學(xué)及呼吸系統(tǒng)癥狀的變化。本實驗研究的流程圖見圖1。

Fig.1 Flow chart of experimental study on inhibition of lung inflammation by human umbilical mesenchymal stem cell exosomes in COPD rats圖1 人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體抑制COPD大鼠肺部炎癥的實驗流程圖

1.3.2 標(biāo)本收集 各組大鼠經(jīng)上述分組處理后1 周，經(jīng)3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，充分暴露腹腔，經(jīng)腹主動脈采集外周血1 mL，室溫靜置2 h后，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；另外?jīng)真空抗凝管采血0.5 mL，于2 h 內(nèi)在全自動血細胞分析儀上計數(shù)白細胞（WBC）、中性粒細胞（NEU）、單核細胞（MON）、淋巴細胞（LYM）等炎性細胞。放血處死大鼠，暴露胸腔及氣管，在氣管環(huán)狀軟骨上方作一小切口，結(jié)扎右肺門，用注射器及留置針經(jīng)氣管切口向左肺緩慢注入2 mL PBS，反復(fù)沖洗3次后進行回收（回收率＞80%），獲得肺泡灌洗液（BALF），重復(fù)3次，4 ℃、1 500 r/min離心15 min，收集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 肺組織HE染色 取各組右下肺組織，4%多聚甲醛室溫固定24 h，然后50%～100%梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋并制作4 μm 厚的切片，行HE 染色，通過顯微鏡觀察肺組織的病理學(xué)變化。

1.3.4 BALF、血清及肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的檢測 （1）ELISA 檢測BALF 和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。取1.3.2中各組收集的BALF及血清90 μL，嚴(yán)格參照IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒說明書檢測BALF 及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。（2）qRT-PCR 檢測肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達。取各組右上肺組織20 mg，根據(jù)動物組織RNA 提取試劑盒說明書進行操作提取組織RNA 并進行濃度測定，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR 檢測。反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達水平。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5 Western blot 檢測肺組織中TLR4、p-NF-κB p65 和IκBα 蛋白的表達 取各組右中肺組織100 mg，剪切成細小碎片，加入1 mL含蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，在低溫研磨儀中充分研磨。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA 法測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，封閉、TLR4（1∶600）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶5 000）、Lamin B1（1∶1 000）及β-actin（1∶3 000）一抗4 ℃孵育過夜，山羊抗兔IgG（1∶1 000）室溫孵育90 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色成像，采用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況變化 制備COPD模型過程中，Control 組大鼠毛發(fā)干凈有光澤，活動劇烈，飲食規(guī)律，無咳嗽、喘息的表現(xiàn)；COPD 組大鼠出現(xiàn)咳嗽、氣促喘息的表現(xiàn)，并且毛發(fā)發(fā)黃無光澤，神情倦怠，活動緩慢，飲食減少；COPD+Exo 組經(jīng)外泌體干預(yù)后，大鼠間斷咳嗽，無明顯喘息氣促，毛發(fā)較黃，精神良好，食欲較好，整體狀態(tài)較COPD組良好。

2.2 大鼠肺組織病理特征 HE 染色結(jié)果顯示，Control組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，無明顯炎性細胞浸潤；COPD 組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡不規(guī)則擴張、融合成肺大皰甚至破裂，肺泡間隔增寬且可見較多炎性細胞浸潤，結(jié)合大鼠的一般情況提示香煙煙霧及LPS 吸入可成功建立COPD 大鼠模型；而COPD+Exo組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較COPD組完整，肺泡擴張減輕，肺泡間隔炎性細胞浸潤減弱，見圖2。

Fig.2 Representative images of HE staining of lung tissue in each group of rats(×200)圖2 各組大鼠肺組織HE染色情況（×200）

2.3 大鼠外周血中炎性細胞計數(shù) 與Control 組相比，COPD組大鼠外周血WBC、NEU、MON、LYM計數(shù)均升高，而COPD+Exo組僅有WBC和LYM升高（P＜0.05）；與COPD 組相比，COPD+Exo 組大鼠外周血WBC、NEU、MON、LYM 計數(shù)均降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Number of inflammatory cells in peripheral blood of rats in each group表2 各組大鼠外周血炎性細胞計數(shù)（n=3，×109/L，±s）

Tab.2 Number of inflammatory cells in peripheral blood of rats in each group表2 各組大鼠外周血炎性細胞計數(shù)（n=3，×109/L，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F LYM 0.25±0.00 2.63±0.19a 1.20±0.47ab 33.116＊WBC 0.48±0.07 3.10±0.27a 1.59±0.55ab 27.197＊NEU 0.77±0.24 2.01±0.20a 0.35±0.15b 39.738＊MON 0.03±0.00 0.15±0.01a 0.06±0.02b 51.100＊

2.4 大鼠BALF 和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 炎性因子的表達 ELISA 結(jié)果顯示，與Control 組相比，COPD 組大鼠BALF 及外周血血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05），COPD+Exo 組中除BALF 中的TNF-α 水平升高外（P＜0.05），其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與COPD 組相比，COPD+Exo 組大鼠BALF 及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in BALF and serum of rats in each group表3 各組大鼠BALF及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平（n=6，ng/L，±s）

Tab.3 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in BALF and serum of rats in each group表3 各組大鼠BALF及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平（n=6，ng/L，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F BALF IL-1β 55.05±11.49 85.23±13.44a 61.02±6.42b 10.827＊IL-6 71.58±8.77 104.16±7.92a 84.66±12.84b 13.234＊TNF-α 290.51±28.28 513.71±59.00a 406.74±52.32ab 26.634＊組別Control組COPD組COPD+Exo組F血清IL-1β 64.02±6.84 88.54±8.44a 73.22±4.92b 9.708＊IL-6 72.00±4.45 90.99±0.97a 73.41±7.93b 8.036＊TNF-α 309.18±5.25 483.74±9.74a 364.64±2.40b 11.869＊

2.5 大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達 qRT-PCR 結(jié)果顯示，COPD 組和COPD+Exo 組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平均高于Control 組（P＜0.05）；COPD+Exo 組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平低于COPD組（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in lung tissue of rats in each group表4 各組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達水平（n=6，±s）

Tab.4 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in lung tissue of rats in each group表4 各組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達水平（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F TNF-α 1.02±0.18 5.17±0.35a 2.52±0.31ab 104.294＊IL-1β 1.00±0.02 3.10±0.31a 1.56±0.12ab 62.411＊IL-6 1.00±0.10 6.58±1.03a 1.65±0.02ab 51.588＊

2.6 大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的表達水平 Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組相比，COPD 組大鼠肺組織中TLR4、IκBα 表達水平降低，p-NF-κB p65 表達水平升高（P＜0.05）；COPD+Exo組大鼠肺組織中TLR4表達水平降低，p-NF-κB p65表達水平升高（P＜0.05），IκBα 表達水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與COPD 組相比，COPD+Exo組大鼠肺組織TLR4、IκBα表達水平升高，p-NFκB p65表達水平降低（P＜0.05），見圖3、表5。

Tab.5 Comparison of TLR4,IκBα and p-NF-κB p65 protein levels in lung tissue between the three groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TLR4、IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達水平的比較（n=4，±s）

Tab.5 Comparison of TLR4,IκBα and p-NF-κB p65 protein levels in lung tissue between the three groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TLR4、IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達水平的比較（n=4，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F p-NF-κB p65 0.31±0.02 0.92±0.10a 0.58±0.06ab 59.341＊TLR4 0.73±0.01 0.30±0.00a 0.56±0.02ab 824.637＊IκBα 0.50±0.03 0.23±0.01a 0.46±0.02b 130.246＊

Fig.3 Expression levels of TLR4,IκBα and p-NF-κB p65 protein in lung tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組大鼠肺組織中TLR4、IκBα、p-NF-κB p65蛋白的表達

3 討論

COPD 是以慢性氣道炎癥、不可逆氣流受限、肺功能損害為特征的復(fù)雜的異質(zhì)性慢性呼吸系疾病，已成為全球負擔(dān)最重的疾病之一。COPD 的發(fā)病機制及最佳的治療方案仍未明確。80%～90%的COPD是由接觸香煙煙霧等有害氣體顆粒引起的［15］。吸煙會增加小氣道和肺組織中中性粒細胞、B細胞、巨噬細胞的數(shù)量，這些細胞釋放炎性因子、蛋白酶、趨化因子等導(dǎo)致氣道上皮及肺實質(zhì)的損傷退化，最終導(dǎo)致COPD的發(fā)生［16］。

本研究在充分文獻復(fù)習(xí)的基礎(chǔ)上采用香煙煙霧煙熏聯(lián)合LPS 霧化吸入構(gòu)建COPD 大鼠模型。既往研究顯示，COPD 動物模型可以由被動吸煙、氣管滴入或直接暴露于化學(xué)物質(zhì)（LPS、NO2等）、氣管滴入彈性蛋白酶、腹腔注射香煙煙霧提取物、嚴(yán)重饑餓等誘發(fā)建立［17-18］。其中，被動吸煙能更好地模擬人患上COPD 的發(fā)病過程，是最經(jīng)濟、操作簡單、成功率高的建模方法；LPS主要通過刺激中性粒細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞釋放TNF-α、IL-1 等一系列炎性介質(zhì)，引發(fā)蛋白酶-抗蛋白酶失衡，引起氣道和肺組織炎癥，最終發(fā)生肺氣腫［17］。雖然有許多實驗是通過滴鼻、靜脈注射或氣管插管滴入LPS 誘導(dǎo)肺部炎癥［19］，但環(huán)境中最常見的暴露途徑是吸入，吸入LPS或煙霧等有害顆粒更符合臨床疾病的發(fā)病過程。另外，低劑量LPS 霧化吸入可導(dǎo)致明顯且均勻分布的肺部炎癥［20-21］。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，COPD 組大鼠毛發(fā)發(fā)黃、暗淡，活動緩慢，飲食攝入減少，精神萎靡，出現(xiàn)咳嗽、喘息氣促的表現(xiàn)，肺組織HE 染色顯示肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡擴張融合成肺大皰、甚至破裂，肺泡間隔有大量炎性細胞浸潤，與文獻報道［22-24］一致，提示香煙煙熏聯(lián)合LPS 霧化吸入可成功建立COPD 動物模型。目前使用LPS 霧化吸入制備COPD 動物模型較少，這種造模方式值得在實驗研究中進行推廣應(yīng)用。

針對現(xiàn)階段COPD的防治，尋找一種安全可靠、有效的治療策略，以減輕COPD肺部的炎癥性損傷，是一個亟需解決的重大課題。許多COPD的臨床前研究結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細胞通過抑制COPD 的炎癥反應(yīng)［25］、細胞凋亡［26］，改善肺功能［27］及免疫調(diào)節(jié)［28］等達到治療的效果，提示間充質(zhì)干細胞療法可能是一種有前景的COPD治療策略。然而有研究表明，干細胞療法存在臨床應(yīng)用的安全問題，主要為干細胞移植伴隨的不良分化或惡性轉(zhuǎn)化，另外，其不易儲存、難以達到靶器官及體外擴增過程中易發(fā)生衰老等問題嚴(yán)重限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用［29-30］。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞通過旁分泌產(chǎn)生的外泌體具有與干細胞相同的作用，參與免疫調(diào)節(jié)與再生，已在許多動物模型中得到驗證［30-31］。外泌體是由多種細胞釋放的直徑為40～100 nm的多泡體小膜泡，具有靶向遞送、低免疫原性和高修復(fù)性的優(yōu)點，其攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 和miRNA 等生物活性物質(zhì)在細胞間通訊中充當(dāng)信使分子，并在組織損傷部位發(fā)揮修復(fù)作用［31］。有研究顯示，尾靜脈注射間充質(zhì)干細胞外泌體可有效抑制小鼠急性肺損傷的肺部炎癥［32］，抑制成纖維細胞的增殖分化從而抑制肺纖維化的進程［33］，減輕肺氣腫［34］等。

本研究對COPD+Exo 組大鼠尾靜脈注射人臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體，與COPD組大鼠相比，肺泡擴張減輕，炎性細胞浸潤減少，BALF、肺組織、血清中炎性細胞因子明顯降低，表明人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體抗炎效果顯著，可減輕COPD 大鼠的肺部炎癥。

慢性炎癥是COPD 發(fā)病的關(guān)鍵機制。研究報道，香煙煙霧或LPS 可與氣道上皮細胞表面的Toll樣受體（如TLR4）結(jié)合誘導(dǎo)炎性細胞激活，并誘發(fā)促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等）的釋放，從而啟動機體免疫反應(yīng)［35］。TLR4 介導(dǎo)的信號通路涉及多種轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-κB、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子1（STAT1）、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）和激活蛋白1（AP1）等，均是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子［36］。多項研究報道，TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)COPD動物或患者的肺部炎癥［35，37］。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠TLR4、IκBα 蛋白表達水平降低、p-NF-κB p65 蛋白表達水平升高，促使炎性因子釋放，從而導(dǎo)致COPD 的發(fā)生發(fā)展，這與既往研究一致，而間充質(zhì)干細胞外泌體干預(yù)后可抑制炎癥反應(yīng)，促使肺康復(fù)。

綜上，人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB 信號通路減輕COPD 大鼠肺部炎癥，促進肺康復(fù)，為外泌體治療COPD提供了實驗依據(jù)，有望作為COPD的無細胞治療的候選藥物。