腸道菌群改變影響CG-IUGR大鼠糖代謝的初步研究

袁冰舒，李麗娟

糖尿病（DM）發(fā)病的關(guān)鍵為胰島素（insulin，INS）分泌減少和胰島素抵抗（insulin resistance，IR），主要臨床表現(xiàn)為糖原合成功能降低引起的血糖增高。糖原合成酶（glycogen synthetase，GYS）是調(diào)控糖原合成及維持血糖水平穩(wěn)定的重要因素。目前DM 的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。有學(xué)者指出宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）個(gè)體，尤其是具有生長(zhǎng)追趕的宮內(nèi)發(fā)育遲緩（catch-up growth intrauterine growth retardation，CG-IUGR）個(gè)體，對(duì)DM等代謝性疾病的易感性明顯增加［1-2］。已有研究表明腸道菌群異常與DM 的發(fā)生明顯相關(guān)［3］。腸道菌群的組成及豐度變化受宿主遺傳、生活方式和藥物等多種因素影響，參與機(jī)體的多種生理和病理活動(dòng)［4］。Nuli 等［5-6］研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病（T2DM）患者腸道菌群多樣性顯著低于健康人群；DM或T2DM個(gè)體腸道菌群的豐度均與正常個(gè)體有明顯不同，表明腸道菌群變化與DM 的發(fā)生緊密相關(guān)，但腸道菌群改變是否介導(dǎo)CG-IUGR大鼠糖代謝異常尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)糖代謝相關(guān)指標(biāo)和腸道菌群的變化，分析CG-IUGR大鼠糖代謝功能降低與腸道菌群改變之間的關(guān)聯(lián)，為CG-IUGR 個(gè)體DM 高易感提供潛在的防治靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量180～200 g 的8 周齡SD 大鼠雌性15只和雄性3只購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，125I 胰島素放射免疫試劑購(gòu)自北方生物技術(shù)研究所有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司，GYS 酶活性試劑盒和BCA 試劑盒購(gòu)自Solarbio 公司，兔抗鼠糖原合成酶（GYS）1 及GYS2 多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，兔抗β-actin 單克隆抗體購(gòu)自Absin 公司，羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自Sigma 公司，E.Z.N.ATMDNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司，Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life 公司，Illumina MiSeq/HiSeq 測(cè)序平臺(tái)由上海生物工程有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照雌∶雄=5∶1比例交配，通過(guò)陰道涂片法確定受孕后，將孕鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常飼養(yǎng)組（3只）和營(yíng)養(yǎng)不良組（12只）。正常飼養(yǎng)組孕期采用常規(guī)飼料飼養(yǎng)（飼料質(zhì)量為30 g/d，熱量為1 031.9 kJ/d），所產(chǎn)子代大鼠常規(guī)喂養(yǎng)至8 周齡后為Control組（8 只）。營(yíng)養(yǎng)不良組孕期采用低熱量飼料飼養(yǎng)（40%常規(guī)飼養(yǎng)量，飼料質(zhì)量為12 g/d，熱量為412.8 kJ/d），產(chǎn)下子代大鼠后，選取出生體質(zhì)量低于Control 組新生大鼠平均體質(zhì)量2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的大鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，把3周齡時(shí)具有生長(zhǎng)追趕的IUGR 大鼠（在早期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中體質(zhì)量追趕上或者超過(guò)Control組的大鼠）采用隨機(jī)數(shù)字表法分為CG-IUGR組（8只）和CG-IUGR+腸菌組（8 只）。CG-IUGR+腸菌組用Control 組大鼠的糞便菌液進(jìn)行灌胃，每周1 次，共6 次。Control 組和CG-IUGR組用同量生理鹽水灌胃，同時(shí)3組大鼠均繼續(xù)采用常規(guī)飼養(yǎng)至8 周齡。在0～8 周齡期間，每周測(cè)量3 組大鼠的體質(zhì)量和身長(zhǎng)（從鼻尖到尾根部），計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI），評(píng)估大鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況。所有動(dòng)物生長(zhǎng)至8周齡時(shí)進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)的檢測(cè)。菌液制備：在無(wú)菌超凈臺(tái)中，采用提尾反射法收集Control組大鼠新鮮排出的糞便，稱質(zhì)量后用生理鹽水將糞便10倍稀釋，細(xì)致研磨后過(guò)濾糞便殘?jiān)玫叫迈r菌液。

1.4 葡萄糖代謝功能檢測(cè)

1.4.1 空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）和空腹胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）水平檢測(cè) 每組取6 只大鼠，空腹12 h后，通過(guò)斷尾法取尾靜脈血，用強(qiáng)生血糖儀檢測(cè)3組大鼠的FBG水平；腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉大鼠后，分離頸動(dòng)脈取血并提取血清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清FINS水平。

1.4.2 葡萄糖耐量試驗(yàn)（glucose tolerance test，GTT）和胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT） 每組取6 只大鼠。GTT：大鼠空腹12 h 后，經(jīng)腹腔緩慢注射20%葡萄糖注射液（2 g/kg），并在注射后的0、15、30、60、90 及120 min 采集尾靜脈血，用強(qiáng)生血糖儀檢測(cè)血糖水平；ITT：大鼠空腹12 h后，經(jīng)腹腔緩慢注射INS 注射液（0.1 U/kg），檢測(cè)血糖，檢測(cè)方法同GTT。

1.4.3 放射免疫法檢測(cè)葡萄糖負(fù)荷后15 min 血清INS 水平 每組取6 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉大鼠后，經(jīng)腹腔注射20%葡萄糖注射液（2 g/kg）15 min后，取頸動(dòng)脈血后分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)大鼠血清INS水平。

1.5 大鼠糞便16S rDNA 測(cè)序及分析 每組取5 只大鼠，收集大鼠糞便，按照試劑盒說(shuō)明書提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及DNA 純化回收，然后用Qubit3.0 DNA試劑盒進(jìn)行定量，上機(jī)終濃度為20 pmol/L。對(duì)樣本序列進(jìn)行聚類分析，在97%相似水平下的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析；基于OTU 計(jì)算出Alpha 多樣性指數(shù)，包括反應(yīng)物種豐富度的ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)，以及反應(yīng)物種多樣性的Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)；將序列進(jìn)行物種分類，最后整理得到屬水平物種差異性比較結(jié)果。

1.6 骨骼肌及肝臟GYS 的表達(dá)及活性檢測(cè) 每組取6 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉后，取其骨骼肌和肝臟組織，檢測(cè)GYS 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平及其酶活性。

1.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的mRNA 表達(dá)水平 提取骨骼肌和肝臟組織總RNA，并按照PrimeScriptTMRT reagent Kit 說(shuō)明書將其逆轉(zhuǎn)成為cDNA。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，55～65 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex Taq TMⅡ10 μL，PCR上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6 μL。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。采用2-ΔΔCt法分析骨骼肌GYS1和肝臟GYS2mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.6.2 Western blot 檢測(cè)骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的蛋白表達(dá)水平 提取骨骼肌和肝臟組織總蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗兔抗GYS1 多抗（1∶10 000）/兔抗GYS2 多抗（1∶500）/兔抗β-actin 單抗（1∶5 000），4 ℃搖動(dòng)孵育過(guò)夜，加二抗羊抗兔IgG抗體（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，ECL顯影拍照。通過(guò)Image J軟件分析各個(gè)蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/β-actin 灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6.3 骨骼肌和肝臟GYS 酶活性檢測(cè) 提取骨骼肌和肝臟組織總蛋白，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，按照GYS 酶活性試劑盒說(shuō)明書測(cè)定GYS的酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；多個(gè)時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析；采用STAMP 軟件對(duì)菌群豐度進(jìn)行差異性分析并結(jié)合SPSS進(jìn)行Welch'st-test分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況 CG-IUGR 組出生時(shí)的身長(zhǎng)、體質(zhì)量均明顯低于Control 組大鼠，隨著周齡增加，與CG-IUGR 組大鼠相比較，CG-IUGR+腸菌組大鼠的體質(zhì)量和BMI 增長(zhǎng)速度均有減緩（P＜0.05），見圖1—3。

Fig.1 Changes of body length from birth to 8 weeks in three groups of rats圖1 3組大鼠0—8周齡的身長(zhǎng)變化

Fig.2 Changes of body weight from birth to 8 weeks in three groups of rats圖2 3組大鼠0—8周齡的體質(zhì)量變化

Fig.3 Changes of body mass index from birth to 8 weeks in three groups rats圖3 3組大鼠0—8周齡的BMI變化

2.2 大鼠葡萄糖代謝功能的變化

2.2.1 FBG 和FINS 水平 與Control 組比較，CGIUGR組FINS水平降低（P＜0.05），與CG-IUGR組比較，CG-IUGR+腸菌組FINS水平升高（P＜0.05）；3組大鼠的FBG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of FBG and FINS levels between three groups表2 各組大鼠FBG及FINS水平比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of FBG and FINS levels between three groups表2 各組大鼠FBG及FINS水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F FBG/（mmol/L）5.22±0.52 5.62±0.44 5.35±0.29 1.367 FINS/（mIU/L）55.45±5.76 45.54±2.81a 55.61±4.50b 9.755＊＊

2.2.2 葡萄糖耐量及INS 耐量情況 GTT 結(jié)果顯示，3 組大鼠在葡萄糖負(fù)荷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖均升高，且均在15 min 時(shí)達(dá)最大值。與Control 組比較，CG-IUGR組糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平均升高（P＜0.05）；ITT結(jié)果顯示，CG-IUGR組INS負(fù)荷后血糖水平明顯高于Control 組（P＜0.05）；與CGIUGR 組比較，CG-IUGR+腸菌組大鼠糖負(fù)荷和INS負(fù)荷后的血糖均有所下降（P＜0.05）。見圖4—5。

Fig.4 Changes of GTT blood glucose in 3 groups of rats圖4 3組大鼠GTT血糖的變化

Fig.5 Changes of ITT blood glucose in 3 groups of rats圖5 3組大鼠ITT血糖的變化

2.2.3 葡萄糖負(fù)荷后15 min血清INS水平比較 葡萄糖負(fù)荷后15 min，Control 組、CG-IUGR 組和CGIUGR+腸菌組血清INS 水平（mIU/L）分別為67.23±13.44、169.43±37.19 和119.24±31.81，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=18.247，P＜0.05）；CG-IUGR 組和CG-IUGR+腸菌組血清INS 水平均高于Control 組（P＜0.05），CG-IUGR+腸菌組血清INS 水平低于CG-IUGR組（P＜0.05）。

2.2.4 骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的mRNA 表達(dá)水平 與Control 組相比，CG-IUGR 組骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 mRNA 表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；與CG-IUGR組相比，CG-IUGR+腸菌組骨骼肌GYS1和肝臟GYS2 mRNA 表達(dá)水平均升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of GYS1 in skeletal muscle and GYS2 in liver between three groups表3 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2 mRNA表達(dá)水平比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of GYS1 in skeletal muscle and GYS2 in liver between three groups表3 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2 mRNA表達(dá)水平比較（n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與Control 組比較，b 與CG-IUGR 組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F GYS1 1.00±0.00 0.70±0.19a 0.97±0.25b 4.822＊GYS2 1.00±0.00 0.56±0.17a 0.88±0.20b 13.126＊＊

2.2.5 骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的蛋白表達(dá)水平 與Control 組相比，CG-IUGR 組骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）；與CGIUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2的蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），見圖6、表4。

Fig.6 Protein expression of GYS1 in skeletal muscle and GYS2 in liver of rats in each group圖6 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2的蛋白表達(dá)水平

Tab.4 Comparison of skeletal muscle GYS1 and liver GYS2 protein expression between three groups表4 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2蛋白表達(dá)水平比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of skeletal muscle GYS1 and liver GYS2 protein expression between three groups表4 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2蛋白表達(dá)水平比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F GYS1 1.04±0.15 0.66±0.06a 0.92±0.12b 16.105＊＊GYS2 0.83±0.13 0.53±0.08a 0.68±0.08b 13.605＊＊

2.2.6 骨骼肌和肝臟GYS 酶活性 與Control 組相比，CG-IUGR組骨骼肌和肝臟GYS的酶活性均降低（P＜0.05）；與CG-IUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組骨骼肌和肝臟GYS酶活性均升高（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of skeletal muscle and liver GYS enzyme activity between three groups表5 3組大鼠骨骼肌和肝臟GYS酶活性比較（n=6，U/mg，±s）

Tab.5 Comparison of skeletal muscle and liver GYS enzyme activity between three groups表5 3組大鼠骨骼肌和肝臟GYS酶活性比較（n=6，U/mg，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F骨骼肌30.49±4.67 15.98±2.22a 22.47±2.23ab 30.005＊＊肝臟24.29±3.54 11.37±4.05a 17.92±2.82ab 20.337＊＊

2.3 3 組大鼠腸道菌群多樣性和結(jié)構(gòu)分析 3 組大鼠腸道菌群OTU 以及Shannon、Simpson 指數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CG-IUGR組的ACE、Chao1指數(shù)低于Control 組（P＜0.05）；與CG-IUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組的ACE、Chao1 指數(shù)升高（P＜0.05）。見表6。3 組腸道雙歧桿菌相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=5，F(xiàn)=4.202，P＜0.05），與CG-IUGR組（0.06±0.04）相比，CG-IUGR+腸菌組（1.12±1.00）腸道雙歧桿菌相對(duì)豐度增加（P＜0.05），但Control組大鼠（0.40±0.25）和CG-IUGR 組大鼠的雙歧桿菌相對(duì)豐度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.6 Diversity analysis of intestinal flora in each group表6 各組大鼠腸道菌群的多樣性分析（n=5，±s）

Tab.6 Diversity analysis of intestinal flora in each group表6 各組大鼠腸道菌群的多樣性分析（n=5，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F OTU 834.60±119.19 740.40±64.72 844.40±71.11 2.109 ACE指數(shù)1 295.55±184.59 1 052.62±116.26a 1 324.59±189.60b 4.005＊Chao1指數(shù)1 177.70±138.77 1 003.46±104.74a 1 182.60±88.66b 4.101＊Shannon指數(shù)3.85±0.43 3.80±0.34 3.86±0.30 0.046 Simpson指數(shù)0.07±0.02 0.08±0.02 0.08±0.05 0.176

3 討論

DM是常見的代謝紊亂性疾病，主要與遺傳及環(huán)境因素改變等有關(guān)。DM 的發(fā)病可追溯至胚胎發(fā)育的時(shí)期。大量研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期營(yíng)養(yǎng)不良個(gè)體成年后易患肥胖及DM等代謝性疾?。?-2］。Long等［7］采用孕期攝入33%正常飲食量的方法建立IUGR 大鼠模型，IUGR 大鼠出生體質(zhì)量及BMI 均顯著低于對(duì)照組，之后出現(xiàn)生長(zhǎng)追趕并在3 周時(shí)體質(zhì)量超過(guò)對(duì)照組，該大鼠在9 周齡時(shí)的BMI 超過(guò)對(duì)照組。鄭銳丹等［8］采用孕期30%正常飲食量的方法建立IUGR 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)剛出生的IUGR大鼠體質(zhì)量及身長(zhǎng)明顯低于對(duì)照組，在12周齡時(shí)該大鼠的體質(zhì)量及BMI均顯著高于對(duì)照組。Wu 等［9］發(fā)現(xiàn)低蛋白飲食法建立IUGR 大鼠亦得到相同的結(jié)果?？梢姴煌椒◤?fù)制的IUGR 動(dòng)物模型可有不同程度的生長(zhǎng)追趕及肥胖傾向。本研究通過(guò)低熱量飲食法建立的IUGR大鼠，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的身長(zhǎng)、體質(zhì)量及BMI 也顯著高于對(duì)照組大鼠，提示低熱量飲食法建立的IUGR大鼠也有生長(zhǎng)追趕現(xiàn)象及肥胖傾向。

糖尿病的發(fā)病機(jī)制主要表現(xiàn)為INS分泌減少和IR 效應(yīng)。Wang 等［10］通過(guò)對(duì)比正常出生的胎兒與長(zhǎng)期處于饑餓環(huán)境中的妊娠期母體所產(chǎn)的胎兒在成年后T2DM的患病率，發(fā)現(xiàn)后者成年后患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。Long等［7-8］發(fā)現(xiàn)IUGR大鼠在成年后存在葡萄糖耐受不良及INS敏感性受損現(xiàn)象。Chen等［11］采用缺氧干預(yù)妊娠期母體建立IUGR小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該小鼠成年后出現(xiàn)糖代謝異?，F(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)8周齡CG-IUGR 大鼠對(duì)葡萄糖和INS 的耐受性均降低，糖負(fù)荷15 min的血清INS水平均增高，提示低熱量飲食法建立的CG-IUGR 大鼠亦具有葡萄糖耐受不良及IR效應(yīng)。

GYS 是糖原合成的關(guān)鍵限速酶，對(duì)維持血糖的動(dòng)態(tài)平衡起重要作用。哺乳動(dòng)物的GYS主要包括兩個(gè)亞型，GYS1主要表達(dá)于骨骼肌，GYS2主要表達(dá)于肝臟。研究顯示，GYS 的表達(dá)及活性降低是DM，特別是T2DM 發(fā)病的重要機(jī)制［12-14］。Ren 等［12］研究表明T2DM 大鼠肝糖原含量顯著降低，GYS 酶活性同步下調(diào)；Oyenihi等［13］采用高糖飲食和腹膜內(nèi)注射低劑量鏈脲佐菌素的方法復(fù)制T2DM 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)其骨骼肌糖原含量顯著降低，GYS酶活性同步降低；Luo 等［14］的研究證實(shí)T2DM 小鼠肝糖原和肌糖原含量顯著降低。這些研究提示T2DM大鼠存在糖原合成功能受損現(xiàn)象，且其機(jī)制可能與GYS 的表達(dá)水平及活性降低有關(guān)。Xirouchaki 等［15］發(fā)現(xiàn)GYS1 基因敲除小鼠餐后血糖明顯升高，同時(shí)骨骼肌糖原含量明顯下降，表現(xiàn)出明顯的葡萄糖耐受不良和IR 效應(yīng)。Deng 等［16］采用添加高糖和高胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)IR-HepG2 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞糖原含量顯著降低，同時(shí)GYS2的表達(dá)水平及活性顯著下調(diào)。本研究也發(fā)現(xiàn)成年CG-IUGR 大鼠骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)其相應(yīng)組織GYS 的酶活性也同步降低，提示低熱量飲食法建立的CG-IUGR大鼠存在糖代謝異常，其機(jī)制可能與GYS的表達(dá)下調(diào)和酶活性降低有關(guān)。

腸道菌群與機(jī)體的多種生理和病理活動(dòng)密切相關(guān)。Fassatoui等［17］發(fā)現(xiàn)，T2DM患者腸道疣微菌門嗜黏蛋白-艾克曼菌的相對(duì)豐度降低，且與其血糖水平及糖化血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。Zhang 等［18］通過(guò)高脂飲食和腹腔注射鏈脲佐菌素建立T2DM 大鼠，發(fā)現(xiàn)其腸道菌群的多樣性降低且組成發(fā)生改變，表現(xiàn)為厚壁菌門乳桿菌屬的相對(duì)豐度增加。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)T2DM 大鼠腸道嗜黏蛋白-艾克曼菌的相對(duì)豐度降低，硬壁菌門/擬桿菌門的比例升高［19］。Yu 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，與移植正常小鼠腸菌的無(wú)菌小鼠相比，移植了T2DM 小鼠腸菌的無(wú)菌小鼠FBG 水平顯著升高，同時(shí)腸道擬桿菌門的相對(duì)豐度明顯增加。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，移植了正常成人腸道菌群的T2DM 小鼠以及給予雙歧桿菌灌胃的T2DM 小鼠，二者的血糖水平均有所降低［21-22］。這些研究提示T2DM 大鼠和小鼠均表現(xiàn)出不同程度的腸菌組成和豐度改變。本研究中CG-IUGR組大鼠與Control組相比較，腸道菌群ACE、Chao1 指數(shù)降低，表明其物種豐富度下降；與CG-IUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組大鼠腸道菌群ACE、Chao1 指數(shù)增高，表明其物種豐富度有所增加；與CG-IUGR 組大鼠相比，CG-IUGR+腸菌組大鼠相應(yīng)組織GYS 的表達(dá)及活性均有所提升，其肥胖傾向及對(duì)葡萄糖和INS 的耐受性均有所改善。結(jié)合既往研究提示，本研究認(rèn)為IUGR 可降低CGIUGR大鼠的糖代謝能力，其機(jī)制可能與腸道菌群豐富度降低下調(diào)了GYS 的表達(dá)及酶活性有關(guān)，但二者之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。另外，本研究觀察到CG-IUGR+腸菌組腸道雙歧桿菌的相對(duì)豐度與CG-IUGR組相比有所增高，但該變化在Control組和CG-IUGR組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見雙歧桿菌的改變與CG-IUGR 大鼠糖代謝異常之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Li 等［23］采用8%蛋白飲食法建立IUGR 小鼠，發(fā)現(xiàn)IUGR小鼠出生后胰島面積減少及INS表達(dá)降低，提示胰腺發(fā)育受損。相萌等［24］采用低蛋白飲食法復(fù)制IUGR 小鼠模型，亦發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果，證實(shí)IUGR 個(gè)體存在胰島發(fā)育不良的問(wèn)題。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CG-IUGR 組大鼠FINS 水平相比Control 組大鼠下調(diào)，提示CG-IUGR 大鼠血清FINS 水平的降低可能與其胰腺發(fā)育受損有關(guān)，也可能是由于模型復(fù)制方法及糖代謝受損程度不同等導(dǎo)致IR 效應(yīng)的進(jìn)展不同有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明，IUGR 可通過(guò)下調(diào)骨骼肌和肝臟GYS 的表達(dá)及活性降低CG-IUGR 大鼠的糖代謝功能，其機(jī)制可能與腸道菌群改變有關(guān)。