染料木黃酮抑制前列腺癌進展和轉(zhuǎn)移的機制研究

劉文瞻，蔡啟亮，吳寶軍，楊思維，姚智力，侯澤楷，孫彬栩

前列腺癌已成為歐美國家男性最常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤［1-2］，在我國呈逐年快速升高趨勢［3］。雄激素在前列腺癌的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮重要作用，而雄激素剝奪治療被認為是前列腺癌的標準藥物療法［4］。盡管各種內(nèi)分泌治療藥物不斷更新，但經(jīng)過18～36個月內(nèi)分泌治療后，大多數(shù)患者仍將逐漸發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌［5］，且長期服藥造成了身體不良反應不斷加重［6］。中草藥中的單體物質(zhì)研究已成為抗癌藥物研究的熱點［7］。染料木黃酮是大豆提取物中的主要活性成分之一，已被證實具有雌激素樣活性，可調(diào)節(jié)細胞周期、誘導細胞凋亡、調(diào)節(jié)信號通路以及抗腫瘤作用［8-10］。目前，染料木黃酮在前列腺癌中的作用研究報道較少，染料木黃酮抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移的具體機制尚未完全闡明。本研究擬探討染料木黃酮對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 前列腺癌細胞株LNCaP 和CWR22RV1 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；染料木黃酮購于Sigma-Aldrich，純度≥98%；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購自美國GIBCO BRL 公司；兔抗人E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）、N-鈣黏蛋白（NCadherin）、波形蛋白（Vimentin）、CD44、Oct4、GAPDH 單克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；Transwell 小室購自美國Corning Incorporated 公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；MTT試劑盒購自美國Ameresco公司；酶標儀購自美國Bio-Tek公司，蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 LNCaP和CWR22RV1細胞接種于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2和37 ℃孵育箱中貼壁培養(yǎng)。細胞生長至融合度為85%時傳代，穩(wěn)定傳3代后，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞分為對照組（RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)）和實驗組（50 μmol/L染料木黃酮處理）。

1.3 噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖抑制情況 對數(shù)生長期的2 組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含10%FBS 的RPMI 1640重懸細胞，調(diào)整成單細胞懸液。以2×104個/孔的密度將上述細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入MTT 溶液20 μL，培養(yǎng)4 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育10 min后用酶標儀檢測各孔490 nm波長處光密度（OD）值。

1.4 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移 取對數(shù)生長期的LNCaP 和CWR22RV1 細胞接種至12 孔板內(nèi)，使細胞增殖至融合度為90%，使用無菌0.2 mL移液器套頭筆直在細胞上劃出一條痕，用PBS清洗3次去除細胞碎片。實驗組加入1 mL含50 μmol/L 染料木黃酮的RPMI 1640 培養(yǎng)基，對照孔中加入不含染料木黃酮的RPMI 1640 培養(yǎng)基。在劃痕后0 h 和72 h 拍照，在每條傷痕上隨機取3 個地方，用Image-Pro Plus軟件測量直徑后取平均值，計算創(chuàng)面閉合指數(shù)。創(chuàng)面閉合指數(shù)=（0 h直徑-72 h直徑）/0 h直徑×100%。

1.5 Transwell 實驗檢測各組細胞侵襲 將對數(shù)生長期的LNCaP 和CWR22RV1 細胞饑餓孵育24 h，加胰酶消化，用無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋使其細胞為5×105個/mL。實驗組Transwell上室以基質(zhì)膠包被后加入200 μL含50 μmol/L染料木黃酮的單細胞懸液，下室加入600 μL含20%FBS的完全培養(yǎng)基，對照組上室加入200 μL單細胞懸液。置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，棄去舊的培養(yǎng)基，PBS多次潤洗，4%多聚甲醛溶液固定30 min，結(jié)晶紫避光染15 min，PBS再次潤洗，用棉簽拭去小室內(nèi)未穿過膜的細胞。在顯微鏡下隨機讀取5個視野觀察并拍照，計數(shù)穿膜細胞，取平均值，實驗重復3次。

1.6 Western blot 檢測E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、CD44、Oct4 蛋白表達 2 組細胞分組處理72 h 后用PBS 清洗，加入裂解液和蛋白酶抑制劑的混合物，冰上裂解30 min，收集細胞于EP 管。4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清液。BCA 法測定蛋白定量，定量后分裝保存于-80 ℃待用。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠并以恒壓80 V，20 min后120 V 進行蛋白分離電泳1 h，100 V 恒壓濕轉(zhuǎn)1.5 h，PVDF 膜浸入5%脫脂奶粉中封閉，室溫緩慢振蕩1 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入一抗（兔抗人E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、CD44、Oct4、β-actin、GAPDH 單克隆抗體，均按1∶1 000 稀釋），4 ℃搖床孵育過夜；隔日，TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入二抗（1∶4 000）室溫孵育1.5 h；HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗（1∶3 000）孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；凝膠成像儀曝光成像，Image J 軟件進行灰度分析，以目的條帶灰度值和βactin、GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 染料木黃酮對前列腺癌細胞增殖的影響 MTT 檢測結(jié)果顯示，實驗組LNCaP 和CWR22RV1 細胞經(jīng)染料木黃酮處理24、48、72 h 后，細胞增殖活性低于對照組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effect of genistein on proliferative activity of LNCaP and CWR22RV1 cells表1 染料木黃酮對LNCaP和CWR22RV1細胞增殖活性的影響（n=3，OD490，±s）

Tab.1 Effect of genistein on proliferative activity of LNCaP and CWR22RV1 cells表1 染料木黃酮對LNCaP和CWR22RV1細胞增殖活性的影響（n=3，OD490，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組實驗組t LNCaP細胞24 h 0.33±0.02 0.29±0.01 3.789＊48 h 0.64±0.02 0.49±0.01 11.340＊＊72 h 1.08±0.042 0.62±0.052 12.130＊＊組別對照組實驗組t CWR22RV1細胞72 h 0.87±0.12 0.49±0.07 4.755＊24 h 0.28±0.01 0.26±0.01 2.824＊48 h 0.58±0.02 0.37±0.05 6.970＊

2.2 染料木黃酮對前列腺癌細胞遷移能力的影響 在LNCap 和CWR22RV1細胞中，實驗組的劃痕愈合指數(shù)（%）較對照組下調(diào)（LNCap：18.32±4.28vs.62.54±11.69，n=3，t=6.152，P＜0.01；CWR22RV1：21.38±6.74vs.67.39±15.41，n=3，t=4.738，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 Effect of genistein on migration of LNCaP and CWR22RV1 cells圖1 染料木黃酮對LNCaP 和CWR22RV1細胞的遷移的影響

2.3 染料木黃酮對前列腺癌細胞侵襲的影響 在LNCaP 細胞中，實驗組的穿膜細胞數(shù)較對照組減少（單位：個/視野，130.67±13.05vs.255.67±14.57，n=3，t=11.068，P＜0.01），在CWR22RV1 細胞中，實驗組的穿膜細胞數(shù)亦較對照組減少（177.33±13.05vs.336.67±10.26，n=3，t=16.622，P＜0.01），見圖2。

Fig.2 Effect of genistein on invasion of LNCaP and CWR22RV1 cells(crystal violet staining,×200)圖2 染料木黃酮對LNCaP和CWR22RV1細胞侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

2.4 染料木黃酮抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程及腫瘤干細胞的表達 Western blot 結(jié)果顯示，在LNCap 和CWR22RV1 細胞中，與對照組相比，實驗組間質(zhì)細胞的標志物N-Cadherin、Vimentin 水平下調(diào)，上皮細胞標志物E-Cadherin表達上調(diào)，腫瘤干細胞的標志物CD44 與Oct-4 的蛋白表達水平下調(diào)。見圖3、表2。

Fig.3 Changes of protein expression of E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44 and Oct-4 in LNCap and CWR22RV1 cells in each group圖3 各組LNCap、CWR22RV1細胞中E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44、Oct-4的蛋白表達變化

Tab.2 Comparison of protein expressions of E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44 and Oct-4 in LNCaP and CWR22RV1 cells between the four groups表2 各組LNCaP和CWR22RV1細胞E-Cadherin、NCadherin、Vimentin、CD44和Oct-4蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expressions of E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,CD44 and Oct-4 in LNCaP and CWR22RV1 cells between the four groups表2 各組LNCaP和CWR22RV1細胞E-Cadherin、NCadherin、Vimentin、CD44和Oct-4蛋白表達水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組實驗組t LNCap細胞CD44 0.99±0.10 0.52±0.02 7.742＊＊Oct-4 1.00±0.10 0.61±0.03 6.173＊＊E-Cadherin 1.00±0.04 2.10±0.31 5.931＊＊N-Cadherin 1.00±0.06 0.38±0.07 10.595＊＊Vimentin 1.00±0.11 0.42±0.09 6.646＊＊組別對照組實驗組t CWR22RV1細胞CD44 1.00±0.14 0.48±0.04 6.024＊＊Oct-4 0.99±0.09 0.38±0.03 10.879＊＊E-Cadherin 0.99±0.11 1.87±0.15 7.757＊＊N-Cadherin 0.99±0.04 0.46±0.04 14.541＊＊Vimentin 0.99±0.04 0.50±0.10 7.732＊＊

3 討論

染料木黃酮的抗腫瘤作用已在宮頸癌、卵巢癌、腎癌以及肝癌中得到證實［11-13］。本研究結(jié)果表明，染料木黃酮能夠抑制去勢抵抗性前列腺癌細胞LANCaP 及CWR22RV1 的增殖能力，這與李飛等［14-15］的研究結(jié)果一致。此外，本研究通過細胞劃痕和Transwell 侵襲實驗進一步證實，染料木黃酮能夠抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力。這與高曉康等［16］報道的染料木黃酮能夠抑制腫瘤細胞增殖能力的結(jié)果一致。綜合上述文獻報道及本研究結(jié)果表明，染料木黃酮能夠抑制前列腺癌的細胞增殖，從而抑制前列腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。

前列腺癌發(fā)生進展機制復雜，前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中伴隨EMT［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)染料木黃酮處理的前列腺癌LNCaP 和CWR22RV1 細胞中EMT重要相關蛋白發(fā)生了變化：間質(zhì)蛋白標志物NCadherin、Viminten 表達降低，上皮蛋白標志物ECadherin表達增加。由此提示染料木黃酮能夠抑制EMT 過程，從而抑制前列腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。曹玉霖等［19］報道染料木黃酮可以通過PI3K/AKT 途徑抑制雄激素非依賴性LNCaP 細胞的增殖。李飛等［15-16］研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮能夠通過抑制雄激素受體信號通路來抑制前列腺癌細胞增殖。由此可知，染料木黃酮對前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制是多途徑、多機制的。本研究著重探討了染料木黃酮對前列腺癌EMT的抑制作用，對于染料木黃酮在前列腺癌進展過程中發(fā)揮作用的詳細機制，待以后的研究深入探討。

前列腺癌干細胞具有自我更新和多分化潛能，被認為是導致內(nèi)分泌治療失敗的根源［20］。前列腺癌干細胞在功能和生物學特點與EMT細胞部分相似，并且這些功能和生物學特點在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［21］。本課題組前期研究證實，CD44+腫瘤細胞較CD44-細胞具有更高的克隆形成和成瘤能力，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 可通過上調(diào)CD44的表達來下調(diào)E-Cadherin，同時上調(diào)Vimentin，從而促進前列腺癌EMT［22］。Zhang 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮可通過調(diào)控Hedgehog-Gli1信號通路影響前列腺癌細胞的干性。本研究使用染料木黃酮處理LNCaP和CWR22RV1細胞后，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞的標志物CD44及Oct-4的表達均降低，說明染料木黃酮能夠減少前列腺癌腫瘤干細胞的形成，從而抑制前列腺癌的進展。

綜上，染料木黃酮能夠通過抑制EMT過程和降低腫瘤細胞干性來抑制前列腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。