LncRNA TUG1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-181b-5p/PDCD4軸對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

呂朝陽(yáng)，黃婷，徐在革，劉惠雙，楊營(yíng)軍，李真真，敖文

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，以心臟肥大、心室結(jié)構(gòu)改變以及舒張和收縮功能障礙為特征，也是心力衰竭的主要原因［1-2］。目前DCM 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明，DCM的關(guān)鍵病理改變是心肌細(xì)胞凋亡［3］。因此，探索與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子機(jī)制對(duì)了解DCM 的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，招募遺傳修飾因子，分離轉(zhuǎn)錄因子，并控制mRNA的衰減［4］。?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine up-regulated gene 1，TUG1）是首次在牛磺酸處理的小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中檢測(cè)到的LncRNA，位于22q12 染色體上，被認(rèn)為是光受體和視網(wǎng)膜發(fā)育的一部分［5］。有報(bào)道稱，TUG1參與了糖尿病腎病的發(fā)展［6］。此外，TUG1 在DCM小鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲低其表達(dá)可減輕DCM誘導(dǎo)的心肌肥厚［7］。然而，TUG1 在DCM 發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)分子機(jī)制尚未完全闡明。生物信息學(xué)（https://rnasysu.com/encori/agoClipRNA.php?source=mRNA）分析發(fā)現(xiàn)miR-181b-5p可能是TUG1的靶基因。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-181b 通過(guò)調(diào)節(jié)心肌肥厚和心肌重構(gòu)影響DCM 的進(jìn)展，而miR-181b-5p 是miR-181b的亞型之一，推測(cè)其可能與DCM有關(guān)［8］。程序性細(xì)胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）作為多種miRNAs 的靶基因，在肺癌、乳腺癌等癌癥中都具有抑制腫瘤發(fā)生和誘導(dǎo)凋亡的作用［9］。相關(guān)研究表明，miR-181a-5p 通過(guò)抑制PDCD4 提高小鼠對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DCM 的抵抗力，并抑制高糖處理的人心肌細(xì)胞的凋亡和炎性因子表達(dá)［10］，而其與miR-181b-5p 同屬于miR-181 的亞型，故筆者猜測(cè)miR-181b-5p可能通過(guò)PDCD4影響DCM 發(fā)病機(jī)制?；诖耍狙芯恐荚谔接慣UG1和miR-181b-5p在DCM發(fā)病機(jī)制中的作用及關(guān)系，為了解DCM的發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 針對(duì)TUG1 的短發(fā)夾RNA（sh-TUG1）和陰性對(duì)照（sh-NC）、miR-181b-5p mimic 和inhibitor（miR-181b-5p 和anti-miR-181b-5p）及其陰性對(duì)照（miRNC 和anti-miR-NC）均購(gòu)自GenePharma；Dulbecco 公司改良的Eagle's 培養(yǎng)基（DMEM）、葡萄糖、Annexin V-熒光素異硫氰酸鹽（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 3000 試劑、TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購(gòu)自北京利維寧生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Dimer Eraser Kit購(gòu)自大連寶生物公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗B 細(xì)胞淋巴瘤2-相關(guān)X（Bax）、活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase 3）、PDCD4、GAPDH 及山羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate 購(gòu)自Millipore；caspase-Glo3 檢測(cè)試劑盒、螢光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 AC16細(xì)胞（成人心室心肌細(xì)胞系）購(gòu)自中國(guó)江蘇蘇州BeNa培養(yǎng)庫(kù)。用含胎牛血清（10%）、鏈霉素（100 g/mL）、青霉素（100 U/mL）、葡萄糖（5 mmol/L）的DMEM培養(yǎng)AC16 細(xì)胞。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)AC16 細(xì)胞。以高糖（25 mmol/L）處理48 h 構(gòu)建DCM 的細(xì)胞模型［11］，正常糖（5.5 mmol/L）作為對(duì)照組。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AC16 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到6 孔板中，使用Lipofectamine 3000試劑將寡核苷酸轉(zhuǎn)染至AC16細(xì)胞，并設(shè)NG組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG 組（25 mmol/L 葡萄糖）、HG+sh-NC 組（轉(zhuǎn)染sh-NC）、HG+sh-TUG1組（轉(zhuǎn)染sh-TUG1）、HG+miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、HG+miR-181b-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-181b-5p）、HG+sh-TUG1+anti-miR-NC 組（共轉(zhuǎn)染sh-TUG1 和anti-miRNC）、HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p 組（共轉(zhuǎn)染sh-TUG1和anti-miR-181b-5p）、HG+miR-181b-5p+pcDNA組（共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p 和pcDNA）、HG+miR-181b-5p+pc-PDCD4 組（共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p 和pc-PDCD4），除NG 組外，其余各組細(xì)胞均使用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 采用不同濃度的葡萄糖（5.5、25 mmol/L）處理AC16細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）12、24、48 h，并以5×103個(gè)/孔接種到96 孔板中，培養(yǎng)48 h，然后每孔加入CCK-8試劑（10 μL）。孵育2 h后，通過(guò)酶標(biāo)儀分析450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，并計(jì)算其細(xì)胞活力（OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%）。

1.5 LDH 釋放測(cè)定 采用LDH 測(cè)定試劑盒檢測(cè)LDH 活性。不同濃度的葡萄糖（5.5、25 mmol/L）處理AC16細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）12、24、48 h，并以5×103個(gè)/孔接細(xì)胞種到96孔板中，培養(yǎng)48 h，分別收集細(xì)胞上清液用于評(píng)估LDH的活性。用酶標(biāo)儀記錄上清液在490 nm波長(zhǎng)處的OD 值。LDH 釋放總量（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD對(duì)照組）/OD對(duì)照組×100%。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)TUG1、PDCD4和miR-181b-5p 的表達(dá) 各組AC16 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)48 h 后用TRIzol 試劑提取AC16 細(xì)胞總RNA。通過(guò)PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒或miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA。采用SYBR Premix Dimer Eraser Kit 進(jìn)行qRTPCR 分析。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，56.5 ℃20 s，68 ℃15 s，共40 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系：PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，加雙蒸水至20 μL；采用2-ΔΔCt法計(jì)算TUG1、PDCD4 和miR-181b-5p 的表達(dá)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）或U6 小核RNA（snRNA）作為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Primers for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物列表

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3遍后，重新懸浮在100 μL結(jié)合緩沖液中，并與Annexin V-FITC（5 μL）和PI（10 μL）染液混合室溫避光染色15 min，參照Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)AC16細(xì)胞凋亡情況，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞Bax、cleaved caspase 3、PDCD4 蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)48 h，PBS 洗滌后加入裂解緩沖液，從細(xì)胞中提取總蛋白，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。提取的總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳（100 V 恒壓）分離，然后將分離的蛋白質(zhì)以0.65 mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移1.5 h 至PVDF 膜，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入兔抗Bax（1∶1 000）、cleaved caspase 3（1∶500）、PDCD4（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 500），于4 ℃孵育過(guò)夜。一抗孵育后PVDF膜經(jīng)TBST沖洗后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。之后用ECL化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影，通過(guò)ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate 顯示蛋白條帶，用Image J 軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化，GAPDH 為內(nèi)參蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞caspase 3 活性 根據(jù)方案使用caspase-Glo3 檢測(cè)試劑盒評(píng)估caspase 3 活性。各組AC16 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種到96 孔板中，培養(yǎng)48 h 后，每孔加入caspase-Glo3試劑（100 μL），室溫孵育1 h。然后在光度計(jì)平板閱讀器中檢測(cè)發(fā)光，caspase 3活性用發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度表示。

1.10 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-181b-5p 與TUG1或PDCD4 的靶向關(guān)系 通過(guò)starBase 3.0（https://starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測(cè)miR-181b-5p 與TUG1 或PDCD4 的結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增TUG1的結(jié)合位點(diǎn)WT-TUG1和WT-PDCD4片段及其突變體（MUT）序列，并克隆到pGL3載體中。AC16細(xì)胞通過(guò)Lipofectamine 3000試劑與螢光素酶報(bào)告載體、對(duì)照載體和miR-181b-5p 或miR-NC 共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，通過(guò)螢光素酶報(bào)告試劑盒評(píng)估AC16細(xì)胞的螢光素酶強(qiáng)度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件和GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)AC16 細(xì)胞活力、LDH 釋放及TUG1、miR-181b-5p 表達(dá)的影響 與NG 組相比，HG 處理后的AC16 細(xì)胞在12、24 和48 h 的細(xì)胞活力和miR-181b-5p表達(dá)水平降低，LDH釋放總量和TUG1表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of viability,LDH release and expression of TUG1 and miR-181b-5p between two groups of AC16 cells表2 各組AC16細(xì)胞活力、LDH釋放及TUG1、miR-181b-5p表達(dá)比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of viability,LDH release and expression of TUG1 and miR-181b-5p between two groups of AC16 cells表2 各組AC16細(xì)胞活力、LDH釋放及TUG1、miR-181b-5p表達(dá)比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與NG組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組12 h 24 h 48 h F細(xì)胞活力/%100.00±10.03 81.23±9.24a 60.45±5.16a 38.72±2.35a 76.862＊LDH釋放總量/%100.00±1.47 126.34±3.95a 176.51±5.87a 228.63±7.68a 697.645＊TUG1 1.00±0.08 1.35±0.11a 2.16±0.18a 3.31±0.32a 164.702＊miR-181b-5p 1.00±0.11 0.76±0.09a 0.51±0.06a 0.37±0.03a 75.206＊

2.2 TUG1 和miR-181b-5p 對(duì)高糖刺激的AC16 細(xì)胞活力、LDH釋放和凋亡的影響 與NG組相比，HG組TUG1 表達(dá)水平、LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3表達(dá)水平及caspase 3活性均升高，miR-181b-5p 表達(dá)水平和細(xì)胞活力均降低（均P＜0.05）；與HG 組和HG+sh-NC 組相比，HG+sh-TUG1組TUG1 表達(dá)水平、LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3表達(dá)水平及caspase 3活性均降低，miR-181b-5p 表達(dá)水平和細(xì)胞活力升高（均P＜0.05）；與HG 組和HG+miR-NC 組相比，HG+miR-181b-5p組TUG1表達(dá)水平、LDH釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3 表達(dá)水平及caspase 3 活性均降低，miR-181b-5p 表達(dá)水平和細(xì)胞活力升高（均P＜0.05），見(jiàn)圖1、2，表3、4。

Fig.1 Flow cytometry detection of apoptosis in each group of AC16 cells圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組AC16細(xì)胞凋亡

Fig.2 Western blot assay of Bax,cleaved caspase 3 protein expression in each group of AC16 cells圖2 Western blot檢測(cè)各組AC16細(xì)胞中Bax、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)

Tab.3 Comparison of TUG1 and miR-181b-5p expression as well as viability and LDH release between six groups of AC16 cells表3 各組AC16細(xì)胞TUG1和miR-181b-5p表達(dá)以及細(xì)胞活力、LDH釋放比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of TUG1 and miR-181b-5p expression as well as viability and LDH release between six groups of AC16 cells表3 各組AC16細(xì)胞TUG1和miR-181b-5p表達(dá)以及細(xì)胞活力、LDH釋放比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與NG組比較，b與HG組比較，c與HG+sh-NC組比較，d與HG+miR-NC組比較，P＜0.05；表4同。

組別NG組HG組HG+sh-NC組HG+sh-TUG1組HG+miR-NC組HG+miR-181b-5p組F TUG1 1.00±0.05 3.46±0.37a 3.42±0.35 1.23±0.11bc 3.44±0.36 1.38±0.14bd 128.928＊miR-181b-5p 1.00±0.05 0.31±0.02a 0.33±0.03 0.74±0.04bc 0.32±0.02 2.89±0.31bd 353.223＊細(xì)胞活力/%100.00±9.42 42.31±2.36a 42.28±2.34 81.25±5.47bc 43.12±2.41 80.42±4.65bd 148.302＊LDH釋放總量/%10.03±0.05 59.43±3.62a 58.27±3.71 22.34±1.52bc 60.13±3.84 27.52±1.68bd 382.182＊

Tab.4 Comparison of apoptosis and related protein expression between six groups of AC16 cells表4 各組AC16細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of apoptosis and related protein expression between six groups of AC16 cells表4 各組AC16細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

組別NG組HG組HG+sh-NC組HG+sh-TUG1組HG+miR-NC組HG+miR-181b-5p組F凋亡率/%3.48±0.11 26.59±2.31a 26.72±2.35 14.12±1.06bc 25.89±2.42 14.56±1.11bd 169.000＊Bax 1.00±0.02 2.51±0.17a 2.48±0.19 1.65±0.11bc 2.45±0.23 1.52±0.08bd 106.345＊cleaved caspase 3 1.00±0.03 2.38±0.21a 2.45±0.26 1.32±0.09bc 2.29±0.31 1.49±0.12bd 61.122＊caspase 3/（×103 RLU）21.43±1.14 68.54±4.69a 69.72±5.11 38.63±2.15bc 66.49±6.04 32.41±0.17bd 161.682＊

2.3 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-181b-5p 與TUG1 的關(guān)系 starBase 3.0 預(yù)測(cè)顯示，miR-181b-5p具有TUG1 的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。在共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimic 和WT-TUG1 螢光素酶活性低于miR-NC+WT-TUG1 組（0.36±0.02vs.1.00±0.06，t=24.787，P＜0.05）。然而，在共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimic 與MUT-TUG1 螢光素酶報(bào)告基因的AC16 細(xì)胞中，螢光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.98±0.05vs.1.00±0.08，t=0.519，P＞0.05）。此外，sh-TUG1 組AC16 細(xì)胞中miR-181b-5p 表達(dá)水平升高（2.54±0.36vs.1.02±0.03，t=10.307，P＜0.05）；pc-TUG1 組AC16 細(xì)胞中miR-181b-5p 表達(dá)水平降低（0.42±0.03vs.1.00±0.02，t=39.403，P＜0.05）。

Fig.3 Prediction of TUG1 binding sites in miR-181b-5p by starBase 3.0圖3 通過(guò)starBase 3.0預(yù)測(cè)TUG1在miR-181b-5p中的結(jié)合位點(diǎn)

2.4 TUG1 調(diào)控miR-181b-5p 對(duì)高糖刺激的AC16細(xì)胞活力、LDH 釋放和凋亡的影響 與HG+sh-TUG1組和HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組比較，HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p 組AC16 細(xì)胞內(nèi)miR-181b-5p 表達(dá)水平和細(xì)胞活力均降低，LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3 表達(dá)水平及caspase 3活性均升高（均P＜0.05），見(jiàn)圖4、5，表5。

Fig.4 Flow cytometry results of apoptosis in each group of AC16 cells圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組AC16細(xì)胞凋亡

Fig.5 Western blot assay of Bax,cleaved caspase 3 protein expression in each group of AC16 cells圖5 Western blot檢測(cè)各組AC16細(xì)胞中Bax、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)

Tab.5 Comparison of miR-181b-5p expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表5 各組AC16細(xì)胞miR-181b-5p表達(dá)、活力、LDH釋放和凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

Tab.5 Comparison of miR-181b-5p expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表5 各組AC16細(xì)胞miR-181b-5p表達(dá)、活力、LDH釋放和凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與HG+sh-TUG1組比較，b與HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別HG+sh-TUG1組HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p組F miR-181b-5p 0.75±0.06 0.77±0.05 0.35±0.02ab 155.446＊細(xì)胞活力/%81.27±5.45 80.63±5.51 53.45±2.36ab 69.163＊LDH釋放總量/%23.41±1.54 23.45±1.49 45.38±2.62ab 252.339＊凋亡率/%14.18±1.05 14.21±1.08 23.96±1.21ab 153.264＊Bax 1.68±0.15 1.69±0.13 2.27±0.18ab 28.604＊cleaved caspase 3 1.35±0.11 1.38±0.09 2.14±0.23ab 49.354＊caspase 3/（×103 RLU）38.54±2.12 38.68±2.31 59.15±4.58ab 82.171＊

2.5 PDCD4 與miR-181b-5p 的靶向關(guān)系 starBase 3.0 預(yù)測(cè)顯示，PDCD4 可能是miR-181b-5p 的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖6。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PDCD4 螢光素酶報(bào)告基因和miR-181b-5p mimic的AC16細(xì)胞螢光素酶活性降低（0.41±0.02vs.1.00±0.03，t=40.083，P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染MUTPDCD4 和miR-181b-5p mimic 的AC16 細(xì)胞無(wú)明顯變化（0.97±0.03vs.1.00±0.05，t=1.260，P＞0.05）。此外，過(guò)表達(dá)miR-181b-5p 降低了AC16 細(xì)胞中PDCD4 蛋白表達(dá)水平（0.32±0.01vs.1.00±0.02，t=74.490，P＜0.05），但敲低miR-181b-5p 表達(dá)則增高了AC16 細(xì)胞中PDCD4 蛋白表達(dá)水平（2.24±0.33vs.1.02±0.04，t=8.990，P＜0.05），見(jiàn)圖7。

Fig.6 Prediction of PDCD4 binding sites in miR-181b-5p by starBase 3.0圖6 通過(guò)starBase 3.0預(yù)測(cè)PDCD4在miR-181b-5p中的結(jié)合位點(diǎn)

Fig.7 Western blot assay of PDCD4 protein expression in each group of AC16 cells圖7 Western blot檢測(cè)各組AC16細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)

2.6 miR-181b-5p 調(diào)控PDCD4 對(duì)高糖刺激的AC16細(xì)胞活力、LDH 釋放和凋亡的影響 與HG+miR-181b-5p 組和HG+miR-181b-5p+pcDNA 組比較，HG+miR-181b-5p+pc-PDCD4 組 AC16 細(xì)胞中PDCD4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平、LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3 表達(dá)水平及caspase 3 活性均升高，細(xì)胞活力降低（P＜0.05），見(jiàn)表6，圖8、9。

Fig.8 Flow cytometry results of apoptosis in each group of AC16 cells圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組AC16細(xì)胞凋亡

Fig.9 PDCD4,Bax and cleaved caspase 3 protein expression in each group of AC16 cells detected by Western blot assay圖9 Western blot檢測(cè)各組AC16細(xì)胞中PDCD4、Bax、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)

Tab.6 Comparison of PDCD4 expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表6 各組AC16細(xì)胞PDCD4表達(dá)、活力、LDH釋放和凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

Tab.6 Comparison of PDCD4 expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表6 各組AC16細(xì)胞PDCD4表達(dá)、活力、LDH釋放和凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與HG+miR-181b-5p組比較，b與HG+miR-181b-5p+pcDNA組比較，P＜0.05。

組別HG+miR-181b-5p組HG+miR-181b-5p+pcDNA組HG+miR-181b-5p+pc-PDCD4組F PDCD4 mRNA 1.00±0.08 1.02±0.01 2.59±0.25ab 189.863＊PDCD4蛋白0.98±0.06 1.00±0.09 2.13±0.18ab 176.857＊細(xì)胞活力/%80.35±4.63 80.48±4.69 51.85±2.17ab 101.696＊LDH釋放總量/%27.56±1.72 27.59±1.70 43.78±2.54ab 128.099＊凋亡率/%14.53±1.08 14.51±1.05 24.15±1.28ab 142.406＊Bax 1.54±0.11 1.56±0.12 2.19±0.15ab 50.192＊cleaved caspase 3 1.51±0.13 1.53±0.15 2.08±0.21ab 22.556＊caspase 3/（×103 RLU）32.45±2.03 32.48±2.13 61.23±4.64ab 164.458＊

2.7 高糖對(duì)沉默TUG1 的AC16 細(xì)胞中PDCD4 表達(dá)的影響 與NG 組相比，HG 組PDCD4 mRNA、蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與HG 組和HG+sh-NC 組相比，HG+sh-TUG1組PDCD4 mRNA、蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與HG+sh-TUG1 組和HG+sh-TUG1+anti-miR-NC 組相比，HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p 組PDCD4 mRNA、蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖10、表7。

Fig.10 PDCD4 protein expression in each group of AC16 cells detected by Western blot assay圖10 Western blot檢測(cè)各組AC16細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)

Tab.7 Comparison of PDCD4 expression between six groups表7 各組PDCD4表達(dá)比較 （n=6，±s）

Tab.7 Comparison of PDCD4 expression between six groups表7 各組PDCD4表達(dá)比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05；a與NG組比較，b與HG組比較，c與HG+sh-NC組比較，d 與HG+sh-TUG1 組比較，e 與HG+sh-TUG1+anti-miR-NC 組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組HG+sh-NC組HG+sh-TUG1組HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p組F PDCD4 mRNA 1.00±0.02 2.48±0.31a 2.51±0.35 1.29±0.21bc 1.27±0.23 2.21±0.34de 38.625＊PDCD4蛋白1.00±0.03 1.76±0.22a 1.78±0.24 1.23±0.16bc 1.25±0.19 1.75±0.21de 19.805＊

3 討論

高糖可引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，損傷心肌細(xì)胞［12］。高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞常用于建立DCM細(xì)胞模型［13］。Ma等［11］發(fā)現(xiàn)25 mmol/L葡萄糖可導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，并誘導(dǎo)細(xì)胞異常凋亡，降低細(xì)胞活性。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)AC16 細(xì)胞后，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞LDH釋放總量、細(xì)胞凋亡率，以及Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達(dá)水平均升高，表明DCM 細(xì)胞模型構(gòu)建成功，高糖會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，損傷心肌細(xì)胞。

有研究表明，LncRNA是治療DCM的潛在靶點(diǎn)，TUG1 可在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞損傷［7，14］。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)TUG1 表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌損傷并預(yù)防急性心肌梗死后心肌缺血-再灌注損傷［14］。Zhao 等［7］研究亦發(fā)現(xiàn)下調(diào)TUG1 表達(dá)能改善DCM 小鼠心臟肥大和舒張功能障礙。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)高糖處理的AC16 細(xì)胞中TUG1 表達(dá)上調(diào)，抑制TUG1表達(dá)可提高高糖處理下AC16細(xì)胞的活力，降低LDH 釋放總量和細(xì)胞凋亡率，與Zhao等［7］研究一致，提示抑制TUG1表達(dá)可改善高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。另有研究顯示，糖尿病腎病模型小鼠腎小管和高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平降低，其過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡改善糖尿病腎?。?5］。這一結(jié)果與本研究結(jié)果相反，推測(cè)其原因可能是TUG1在不同組織中的生物學(xué)功能不同，其作用于腎小管上皮細(xì)胞，TUG1 表達(dá)下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞增殖減少，加劇糖尿病腎病病理?yè)p傷，但在心肌細(xì)胞中，TUG1 表達(dá)下調(diào)可能會(huì)抑制心肌細(xì)胞異常凋亡而緩解細(xì)胞損傷，其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。

TUG1 作為miRNA 的海綿參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤［16］、糖尿病視網(wǎng)膜病變［17］等疾病的進(jìn)展。本研究使用starBase 3.0 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TUG1 和miR-181b-5p 間有相互結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)TUG1可靶向調(diào)控miR-181b-5p。有研究顯示，miR-181b-5p 過(guò)表達(dá)促進(jìn)高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制凋亡［18］。此外，上調(diào)miR-181b-5p能夠抑制缺氧/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)高糖處理的AC16 細(xì)胞中miR-181b-5p 表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-181b-5p 可提高高糖刺激的心肌細(xì)胞活力，并降低LDH釋放總量和細(xì)胞凋亡，這一結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，且下調(diào)miR-181b-5p 可明顯減弱TUG1 抑制對(duì)高糖處理AC16 細(xì)胞活力和凋亡的保護(hù)作用，提示TUG1 通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-181b-5p影響高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡，參與DCM的發(fā)病機(jī)制。

為進(jìn)一步探究miR-181b-5p參與高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷機(jī)制，本研究使用starBase 3.0 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PDCD4 是miR-181b-5p 的靶點(diǎn)，并經(jīng)雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)。有研究顯示PDCD4 在DCM 大鼠中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)PDCD4 的表達(dá)會(huì)通過(guò)減弱心肌細(xì)胞凋亡、炎癥和纖維化防止DCM大鼠發(fā)生左心室重塑、功能障礙和胰島素抵抗，進(jìn)而改善DCM［20］。Zhao等［10］研究發(fā)現(xiàn)PDCD4 在高糖處理的人心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)PDCD4 會(huì)減弱miR-181a-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，PDCD4在高糖誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且過(guò)表達(dá)PDCD4 可部分減弱miR-181b-5p 上調(diào)對(duì)高糖處理AC16 細(xì)胞活力的促進(jìn)作用和對(duì)凋亡的抑制作用。這一結(jié)果與Zhao等［10］研究結(jié)果基本一致。另外，在高糖誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞中，TUG1可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-181b-5p調(diào)控PDCD4的表達(dá)，表明高糖誘導(dǎo)的TUG1 通過(guò)抑制miR-181b-5p，上調(diào)PDCD4表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，沉默TUG1可通過(guò)吸收miR-181b-5p來(lái)降低PDCD4的表達(dá)，從而抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。但是本研究?jī)H通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究LncRNA TUG1/miR-181b-5p/PDCD4 軸對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，未經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。后續(xù)將通過(guò)建立DCM 大鼠模型深入探究TUG1 在DCM發(fā)病機(jī)制中的作用，為DCM的靶向治療提供依據(jù)。