光果金櫻子三萜類化合物的分離鑒定與抗SARSCoV-2 活性評價

敖卓儀, 關(guān)曉嫻, 吳杰偉

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006)

金櫻子(Rosalaevigata)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬植物，廣泛分布于江蘇、湖南、廣東、廣西等地[1]。目前從薔薇屬植物中分離得到的化學(xué)成分主要有黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)等, 其中黃酮類與三萜類化合物是該屬植物的主要活性成分[2]。金櫻子是我國較常用的中藥，《本草綱目》記載 “性酸、澀、平、無毒；主治脾瀉下痢、止小便利、澀精氣, 久服, 令人耐寒輕身, 補血益精, 有奇效”[3]。光果金櫻子(R.laevigatavar.leiocapus)是金櫻子變種，其性狀、顯色特征、多糖含量相似，但光果金櫻子的葉稍薄, 果光滑無刺[4–5]，如能作為金櫻子的來源,在采收加工時無需去刺，可以提高生產(chǎn)效率，節(jié)省人工成本，發(fā)展前景十分廣闊。

本課題對光果金櫻子的三萜類化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離出15 個三萜化合物，用增強型2019-nCoV Mpro/3CLpro抑制劑篩選試劑盒對化合物抑制嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)活性進(jìn)行評價，為后續(xù)光果金櫻子化學(xué)成分的提取分離及新的抗SARS-CoV-2 藥物的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

Bruker AV-400 MHz 核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；Waters 2695 LC 偶聯(lián)Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS 液質(zhì)聯(lián)用儀；XHRE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海霄漢實業(yè)發(fā)展公司)；Agilent 1100 制備型高效液相(美國安捷倫公司)；Waters Sunfire?RP C18 制備型色譜柱(5μm, 30 mm×150 mm)；多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer 公司)；柱層析硅膠：200～300 和300～400 目(青島海洋化工有限公司)；葡聚糖凝膠LH-20 (美國Pharmacia 公司)；實驗所用有機試劑均屬分析純級別。

植物材料于2020 年11 月采自廣東省河源市紫金縣龍窩鎮(zhèn)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院吳杰偉副研究員鑒定為薔薇屬植物光果金櫻子(Rosalaevigatavar.leiocapus)的果實。

1.2 提取和分離

光果金櫻子果實15 kg，陰干，切碎，用95%乙醇常溫滲濾提取3 次(每次7 d)，過濾后合并3 次滲濾液，減壓濃縮得到總提取物浸膏。后將獲得的總浸膏首先用純凈水懸浮，乙酸乙酯連續(xù)萃取3 次，合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯部位浸膏(130.6 g)。首先，乙酸乙酯部位浸膏使用硅膠柱層析進(jìn)行處理，石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫(10/1～2/1,V/V)，并利用TLC 檢測合并得到組分Fr.1 (4.5 g)、Fr.2 (15.4 g)、Fr.3 (7.9 g)、Fr.4 (10.4 g)和Fr.5 (3.3 g)。Fr.2 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離(甲醇作洗脫劑)，分別得到4 個亞組分Fr. 2A～Fr. 2D。組分Fr. 2B 經(jīng)制備型HPLC 純化，以乙腈/水為流動相，流速20 mL/min，制得化合物2 (23.2 mg)、10 (19.1 mg)和15 (7.5 mg)。Fr. 2C 經(jīng)制備型高效液相(乙腈-水=5:95～50:95，20 mL/min，0～120 min)純化，分別得到化合物3 (22.4 mg)、6 (2.4 mg)和7(6.4 mg)。Fr. 3 經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷/甲醇[50/1～10/1,V/V]梯度洗脫，進(jìn)一步經(jīng)Sephadex LH-20、制備HPLC 純化，分離得到化合物11 (14.2 mg)、14 (4.5 mg)和9 (8.6 mg)。其余洗脫組分再經(jīng)制備HPLC 純化，以乙腈-水為流動相，流速20 mL/min，制得化合物13 (21.3 mg) 和12 (9.5 mg)。Fr. 4 通過反復(fù)硅膠柱層析和C18柱制備得到化合物1 (8.4 mg)、4 (9.6 mg)、5 (18.7 mg)和8 (10.8 mg)。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

本研究從光果金櫻子的果實中分離得到15 個三萜類化合物(圖1)，包括6 個齊墩果烷型三萜(化合物2、4、5、6、11、15)、7 個烏蘇烷型三萜(化合物3、7、9、10、12、13、14)、2 個羽扇豆烷型三萜(化合物1、8)，其中化合物1 為裂環(huán)羽扇豆烷型，化合物12 為烏蘇烷型降三萜。

圖1 三萜化合物1～15 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of triterpenes 1–15

化合物1無色針晶; 分子式C30H48O4, ESIMSm/z: 473 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH2.09 (1H, dd,J= 15.0, 10.0 Hz, H-1a), 1.35 (1H,dd,J= 15.0, 10.0 Hz, H-1b), 0.93 (1H, m, H-5), 0.81(3H, s, H-23), 0.98 (3H, s, H-24), 1.05 (6H, overlapped, H-25/H-26), 1.00 (3H, s, H-27), 4.57 (1H, s,H-29a), 4.68 (1H, s, H-29b), 1.67 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC45.9 (C-1), 94.9 (C-2),71.6 (C-3), 39.9 (C-4), 61.7 (C-5), 21.8 (C-6), 35.6(C-7), 42.6 (C-8), 49.0 (C-9), 42.0 (C-10), 23.6 (C-11),27.4 (C-12), 39.9 (C-13), 43.9 (C-14), 30.7 (C-15),33.4 (C-16), 57.6 (C-17), 50.3 (C-18), 48.7 (C-19),151.9 (C-20), 31.7 (C-21), 38.2 (C-22), 28.3 (C-23),21.4 (C-24), 15.0 (C-25), 17.6 (C-26), 14.9 (C-27),180.5 (C-28), 110.2 (C-29), 19.6 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報道一致, 故鑒定為laevigaterpene A。

化合物2白色粉末; 分子式C30H48O5, ESIMSm/z: 487 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.88 (1H, m, H-2), 3.41 (1H, m, H-3), 5.26 (1H, t,J=3.2 Hz, H-12), 3.40 (1H, d,J= 10.8 Hz, H-23a), 3.53(1H, d,J= 10.8 Hz, H-23b), 0.79 (3H, s, H-24), 1.02(3H, s, H-25), 0.82 (3H, s, H-26), 1.19 (3H, s, H-27),0.91 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-30);13C NMR(100 MHz, CD3OD):δC47.2 (C-1), 67.2 (C-2), 78.7(C-3), 40.6 (C-4), 49.9 (C-5), 19.0 (C-6), 33.8 (C-7),42.0 (C-8), 44.2 (C-9), 39.2 (C-10), 24.0 (C-11), 123.5(C-12), 145.3 (C-13), 42.7 (C-14), 28.7 (C-15), 24.6(C-16), 47.6 (C-17), 43.0 (C-18), 42.5 (C-19), 31.6(C-20), 34.9 (C-21), 33.5 (C-22), 71.3 (C-23), 17.8(C-24), 17.3 (C-25), 17.6 (C-26), 26.5 (C-27), 181.9(C-28), 33.6 (C-29), 24.0 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道一致，故鑒定為2α,23-二羥基齊墩果酸。

化合物3白色粉末; 分子式C30H48O6, ESIMSm/z: 527 [M + Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD):δH3.41 (1H, d,J=3.2 Hz, H-1), 3.64 (1H,dd,J= 9.7, 3.2 Hz, H-2), 3.46 (1H, d,J= 9.7 Hz, H-3),1.48 (1H, m, H-5), 2.17 (1H, m, H-9), 5.29 (1H, m,H-12), 2.49 (1H, s, H-18), 0.97 (3H, s, H-23), 0.88(3H, s, H-24), 1.02 (3H, s, H-25), 0.80 (3H, s, H-26),1.35 (3H, s, H-27), 1.20 (3H, s, H-29), 0.93 (3H, d,J=6.7 Hz, H-30);13C NMR(100 MHz, CD3OD):δC81.3(C-1), 71.8 (C-2), 80.7 (C-3), 41.8 (C-4), 49.1 (C-5),19.4 (C-6), 34.2 (C-7), 43.0 (C-8), 48.9 (C-9), 38.9(C-10), 26.6 (C-11), 130.6 (C-12), 138.8 (C-13), 44.3(C-14), 29.6 (C-15), 29.1 (C-16), 49.0 (C-17), 54.9(C-18), 73.6 (C-19), 42.5 (C-20), 27.3 (C-21), 39.0(C-22), 28.3 (C-23), 22.4 (C-24), 13.0 (C-25), 17.7(C-26), 24.9 (C-27), 182.4 (C-28), 27.1 (C-29), 16.6(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道一致, 故鑒定為1β-羥基薔薇酸。

化合物4白色粉末; 分子式C39H54O5, ESIMSm/z: 625 [M + Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD):δH1.44 (2H, m, H-1), 1.53 (2H, m, H-2),4.58 (1H, t,J= 7.5 Hz, H-3), 1.14 (2H, m, H-6), 1.23(2H, m, H-7), 5.26 (1H, brs, H-12), 2.80 (1H, dd,J=13.8, 4.6 Hz, H-18), 0.90 (3H, s, H-23), 1.18 (3H, s,H-24), 1.02 (3H, s, H-25), 0.94 (3H, s, H-26), 0.87(3H, s, H-29), 0.82 (3H, s, H-30), 5.85 (1H, d,J=16.0 Hz, H-2′), 6.89 (1H, d,J= 16.0 Hz, H-3′), 7.65(2H, d,J= 7.8 Hz, H-6′, H-8′), 6.74 (2H, d,J= 7.8 Hz,H-5′, H-9′);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC40.4(C-1), 24.1 (C-2), 85.3 (C-3), 39.4 (C-4), 56.5 (C-5),19.4 (C-6), 33.6 (C-7), 40.6 (C-8), 47.7 (C-9), 39.3(C-10), 24.0 (C-11), 123.3 (C-12), 144.8 (C-13), 42.9(C-14), 29.0 (C-15), 24.6 (C-16), 47.3 (C-17), 42.8(C-18), 46.1 (C-19), 31.6 (C-20), 34.9 (C-21), 33.8(C-22), 29.2 (C-23), 17.7 (C-24), 17.0 (C-25), 18.2(C-26), 28.8 (C-27), 177.6 (C-28), 26.4 (C-29), 33.8(C-30), 168.6 (C-1′), 116.8 (C-2′), 145.5 (C-3′), 127.8(C-4′), 133.6 (C-5′/C-9′), 159.8 (C-7′), 115.8 (C-6′/C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道一致, 故鑒定為3β-(p-hydroxy-trans-cinnamoyloxy)-olean-12-en-28-oicacid。

化合物5白色針晶; 分子式C39H54O6, ESIMSm/z: 617 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.87 (1H, m, H-2), 4.68 (1H, m, H-3), 5.24 (1H, m,H-12), 0.88 (3H, s, H-23), 0.93 (6H, s, H-30/H-24),1.04 (3H, s, H-25), 0.81 (3H, s, H-26), 1.17 (3H, s,H-27), 0.89 (3H, s, H-29), 6.37 (1H, d,J= 16.1 Hz,H-2′), 7.61 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-3′), 7.45 (2H, d,J=8.7 Hz, H-2″, H-6″), 6.80 (2H, d,J= 9.9 Hz, H-3″,H-5″);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC47.2 (C-1/C-17), 67.6 (C-2), 85.6 (C-3), 40.6 (C-4), 56.5 (C-5),19.5 (C-6 ), 31.6 (C-7/C-29), 39.3 (C-8), 47.7 (C-9),34.9 (C-10), 24.0 (C-11/C-30), 123.3 (C-12), 145.4(C-13), 42.7 (C-14), 28.8 (C-15), 24.0 (C-16), 40.6(C-18), 43.0 (C-19), 29.2 (C-20), 33.6 (C-21), 33.8(C-22), 26.4 (C-23), 18.3 (C-24), 17.1 (C-25), 17.7(C-26), 24.6 (C-27), 182.1 (C-28), 169.7 (C-1′), 115.8(C-2′), 146.3 (C-3′), 127.3 (C-1″), 116.9 (C-2″/C-6″),131.1 (C-3″/C-5″), 161.1 (C-4″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道一致, 故鑒定為3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸。

化合物6白色粉末; 分子式C30H48O4, ESIMSm/z: 473 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.56 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-2), 2.91 (1H, d,J=13.4 Hz, H-3), 5.26 (1H, m, H-12), 1.00 (3H, s, H-23),0.81 (3H, s, H-24), 1.03 (3H, s, H-25), 0.84 (3H, s,H-26), 1.16 (3H, s, H-27), 0.93 (3H, s, H-29), 0.96(3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC34.9(C-1), 67.2 (C-2), 80.1 (C-3), 40.6 (C-4), 48.2 (C-5),19.0 (C-6), 34.0 (C-7), 39.5 (C-8), 47.3 (C-9), 39.4(C-10), 24.0 (C-11), 122.3 (C-12), 144.2 (C-13), 42.7(C-14), 28.8 (C-15), 24.6 (C-16), 46.1 (C-17), 42.1(C-18), 45.1 (C-19), 33.4 (C-20), 39.2 (C-21), 33.5(C-22), 31.6 (C-23), 22.4 (C-24), 16.6 (C-25), 17.2(C-26), 27.7 (C-27), 183.1 (C-28), 39.0 (C-29), 26.5(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道一致, 故鑒定為2α,3α-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸。

化合物7白色粉末; 分子式C30H48O4, ESIMSm/z: 471 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.64 (1H, m, H-3), 5.32 (1H, m, H-12), 2.20 (1H,m, H-15), 3.16 (1H, m, H-16), 3.00 (1H, s, H-18), 1.31(3H, s, H-23), 0.94 (3H, s, H-24), 0.81 (3H, s, H-25),0.88 (3H, s, H-26), 1.21 (3H, s, H-27), 1.35 (3H, s, H-29), 1.00 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC40.5 (C-1), 26.6 (C-2), 80.1 (C-3), 39.4 (C-4), 55.1(C-5), 19.3 (C-6), 33.1 (C-7), 42.7 (C-8), 47.9 (C-9),39.1 (C-10), 23.7 (C-11), 130.9 (C-12), 140.1 (C-13),43.1 (C-14), 28.1 (C-15), 26.9 (C-16), 48.1 (C-17),54.0 (C-18), 73.7 (C-19), 41.2 (C-20), 27.1 (C-21),39.5 (C-22), 29.2 (C-23), 16.9 (C-24), 16.6 (C-25),17.6 (C-26), 24.9 (C-27), 182.7 (C-28), 27.3 (C-29),15.5 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致, 故鑒定為坡模酸。

化合物8白色粉末; 分子式C31H50O3, ESIMSm/z: 469 [M - H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.16 (1H, m, H-3), 0.95 (3H, s, H-23), 0.79 (3H, s,H-24), 0.86 (3H, s, H-25), 1.02 (3H, s, H-26), 1.00(3H, s, H-27), 4.73 (1H, s, H-29b), 4.62 (1H, s, H-29a), 1.13 (3H, brs, H-30), 3.66 (3H, s, OCH3);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC39.8 (C-1), 28.8 (C-2),84.4 (C-3), 40.4 (C-4), 57.9 (C-5), 19.5 (C-6), 35.4 (C-7), 41.9 (C-8), 56.8 (C-9), 37.9 (C-10), 22.2 (C-11), 26.8(C-12), 39.5 (C-13), 43.5 (C-14), 31.6 (C-15), 33.1(C-16), 69.7 (C-17), 50.6 (C-18), 40.5 (C-19), 151.8(C-20), 30.8 (C-21), 38.1 (C-22), 29.1 (C-23), 16.6(C-24), 17.2 (C-25), 17.9 (C-26), 16.0 (C-27), 178.2(C-28), 110.3 (C-29), 21.6 (C-30), 51.9 (OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道一致, 故鑒定為樺木酸甲酯。

化合物9白色粉末; 分子式C30H48O6, ESIMSm/z: 505 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.88 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-2), 5.31 (1H, m, H-12),3.54 (1H, d,J= 11.0 Hz, H-23a), 3.39 (1H, d,J= 11.0 Hz,H-23b), 0.94 (3H, s, H-24), 0.79 (3H, s, H-25), 1.17(3H, s, H-26), 1.32 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-29),0.90 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz,CD3OD):δC42.7 (C-1), 67.2 (C-2), 78.7 (C-3), 43.0(C-4), 44.2 (C-5), 19.1 (C-6), 33.7 (C-7), 41.1 (C-8),48.5 (C-9), 39.1 (C-10), 24.7 (C-11), 129.2 (C-12),140.1 (C-13), 42.5 (C-14), 29.5 (C-15), 26.6 (C-16),48.9 (C-17), 55.0 (C-18), 73.6 (C-19), 42.2 (C-20),27.1 (C-21), 39.0 (C-22), 71.3 (C-23), 17.3 (C-24),17.6 (C-25), 17.6 (C-26), 24.9 (C-27), 182.5 (C-28),27.3 (C-29), 16.6 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道一致, 故鑒定為2α,3α,19α,23-四羥基-12-烯-烏蘇酸。

化合物10白色粉末; 分子式C33H52O5, ESIMSm/z: 529 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.95 (1H, dd,J= 12.9, 5.0 Hz, H-11), 5.30 (1H, m,H-12), 1.28 (3H, s, H-23), 0.97 (3H, s, H-25), 1.03(3H, s, H-26), 1.19 (3H, brs, H-27), 0.79 (3H, s, H-28),0.88 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, d,J= 9.0 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC36.0 (C-1), 25.1 (C-2),73.6 (C-3), 45.2 (C-4), 46.7 (C-5), 19.4 (C-6), 34.0(C-7), 43.1 (C-8), 47.8 (C-9), 38.9 (C-10), 77.8 (C-11),124.6 (C-12), 144.7 (C-13), 43.5 (C-14), 27.1 (C-15),27.3 (C-16), 34.2 (C-17), 56.4 (C-18), 39.1 (C-19),39.0 (C-20), 33.6 (C-21), 40.7 (C-22), 26.6 (C-23),182.4 (C-24), 16.6 (C-25), 17.7 (C-26), 24.9 (C-27),28.7 (C-28), 17.4 (C-29), 22.4 (C-30), 172.7 (CO),54.9 (CH3O), 20.8 (CH3CO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道一致，故鑒定為乙?；?11α-甲氧基-β-乳香酸。

化合物11白色粉末; 分子式C30H48O5, ESIMSm/z: 489 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.63 (1H, m, H-2), 2.92 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-3),5.33 (1H, m, H-12), 1.01 (3H, s, H-23), 0.94 (3H, s,H-24), 0.82 (3H, s, H-25), 0.77 (3H, s, H-26), 1.30(3H, s, H-27), 1.00 (3H, s, H-29), 0.96 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC48.0 (C-1), 69.5(C-2), 84.5 (C-3), 39.4 (C-4), 56.8 (C-5), 19.7 (C-6),33.9 (C-7), 40.8 (C-8), 49.9 (C-9), 40.5 (C-10), 24.9(C-11), 124.7 (C-12), 144.8 (C-13), 42.6 (C-14), 29.4(C-15), 28.1 (C-16), 46.7 (C-17), 45.2 (C-18), 82.5(C-19), 36.0 (C-20), 29.3 (C-21), 34.1 (C-22), 29.5(C-23), 17.8 (C-24), 16.9 (C-25), 17.4 (C-26), 25.1(C-27), 180.7 (C-28), 28.7 (C-29), 25.1 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道一致，故鑒定為阿江欖仁尼酸。

化合物12白色粉末; 分子式C29H48O3, ESIMSm/z: 445 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.93 (1H, m, H-2), 3.31 (1H, m, H-3), 5.30 (1H, m,H-12), 0.95 (3H, s, H-23), 0.87 (3H, s, H-24), 0.99(6H, s, H-25), 0.79 (3H, s, H-26), 1.36 (3H, s, H-27),1.20 (3H, s, H-29), 0.92 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC42.7 (C-1), 67.2 (C-2),80.1 (C-3), 39.5 (C-4), 49.6 (C-5), 19.3 (C-6), 34.1(C-7), 41.3 (C-8), 49.1 (C-9), 39.0 (C-10), 24.7 (C-11),129.3 (C-12), 140.0 (C-13), 43.1 (C-14), 29.6 (C-15),27.1 (C-16), 39.4 (C-17), 55.1 (C-18), 73.6 (C-19),43.1 (C-20), 27.3 (C-21), 26.9 (C-22), 29.2 (C-23),22.4 (C-24), 17.5 (C-25), 17.8 (C-26), 24.9 (C-27),30.7 (C-29), 19.3 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道一致，故鑒定為2α,3α,19α-Trihydroxy-28-norurs-12-ene。

化合物13白色粉末; 分子式C30H48O5, ESIMSm/z: 489 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.94 (1H, m, H-2), 3.35 (1H, m, H-3), 5.30 (1H, m,H-12), 2.51 (1H, s, H-18), 1.00 (6H, overlapped, H-23/H-24), 0.88 (3H, s, H-25), 0.80 (3H, s, H-26), 1.36(1H, s, H-27), 1.20 (3H, s, H-29), 0.94 (3H, d,J= 7.0 Hz,H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC42.5 (C-1),67.2 (C-2), 80.1 (C-3), 41.3 (C-4), 49.3 (C-5), 24.9(C-6), 34.1 (C-7), 39.4 (C-8), 48.2 (C-9), 39.5 (C-10),27.3 (C-11), 129.4 (C-12), 140.1 (C-13), 42.7 (C-14),29.6 (C-15), 26.6 (C-16), 49.3 (C-17), 55.1 (C-18),73.6 (C-19), 43.1 (C-20), 19.3 (C-21), 39.0 (C-22),29.3 (C-23), 22.5 (C-24), 17.5 (C-25), 16.9 (C-26),27.1 (C-27), 182.3 (C-28), 16.6 (C-29), 24.7 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道一致, 故鑒定為薔薇酸。

化合物14白色針晶; 分子式C30H46O5, ESIMSm/z: 487 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD),關(guān)鍵氫質(zhì)子信號如下:δH4.59 (1H, m, H-2), 5.31 (1H,m, H-12), 2.52 (1H, s, H-18), 1.19 (3H, s, H-23), 0.86(3H, s, H-24), 1.12 (3H, s, H-25), 0.90 (3H, s, H-26),1.33 (3H, s, H-27), 1.29 (3H, s, H-29), 0.94 (3H, d,J=6.9 Hz, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC50.5(C-1), 70.4 (C-2), 217.1 (C-3), 49.0 (C-17/C-4), 58.9(C-5), 20.4 (C-6), 33.9 (C-7), 41.1 (C-8), 48.3 (C-9),38.9 (C-10), 24.8 (C-11), 129.0 (C-12), 140.2 (C-13),42.7 (C-14), 30.5 (C-15), 27.0 (C-16), 55.0 (C-18),73.6 (C-19), 43.0 (C-20), 26.6 (C-21), 39.0 (C-22),26.2 (C-23), 22.1 (C-24), 17.7 (C-25), 16.6 (C-26),25.4 (C-27), 182.2 (C-28), 27.3 (C-29), 16.4 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道一致，故鑒定為2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid。

化合物15白色粉末; 分子式C30H48O3, ESIMSm/z: 457 [M + H]+;1H NMR (400 MHz, CD3OD):δH3.14 (1H, dd,J= 3.9, 11.0 Hz, H-3), 0.77 (1H, brs,H-5), 5.24 (1H, m, H-12), 0.94 (3H, s, H-23), 0.82 (3H,s, H-24), 0.91 (3H, s, H-25), 0.93 (3H, s, H-26), 0.91(3H, s, H-27), 0.97 (3H, s, H-29), 1.16 (3H, s, H-30);13C NMR (100 MHz, CD3OD):δC39.8 (C-4/C-1),27.9 (C-2), 79.7 (C-3), 56.8 (C-5), 19.5 (C-6), 34.0(C-7), 40.5 (C-8), 48.4 (C-9), 38.2 (C-10), 24.5 (C-11),123.6 (C-12), 145.2 (C-13), 42.9 (C-14), 28.7 (C-15),24.0 (C-16), 47.6 (C-17), 42.7 (C-18), 47.3 (C-19),31.6 (C-20), 34.9 (C-21), 33.6 (C-22), 28.8 (C-23),16.3 (C-24), 15.9 (C-25), 17.7 (C-26), 26.4 (C-27),182.0 (C-28), 33.8 (C-29), 24.1 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道一致, 故鑒定為齊墩果酸。

1.4 化合物抗SARS-CoV-2 活性評價

通過測試化合物對SARS-CoV-2 Mpro的劑量效應(yīng)，來評估從光果金櫻子中分離得到的化合物抑制SARS-CoV-2 活性的能力。本實驗使用增強型2019-nCoV Mpro/3CLpro抑制劑篩選試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，按照說明書在黑色96 孔板中進(jìn)行實驗。設(shè)置空白對照組、100%酶活性對照組、陽性抑制劑Ebselen (依布硒)對照組以及給藥組，各組設(shè)3個復(fù)孔。將待測溶液稀釋至最終濃度(100、50、25、12.5、6.25μmol/L)，按照說明書依次加入試劑和樣品后37℃孵育10 min。低溫下每孔快速加入4μL底物，混勻，37 ℃避光孵育5 min。使用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射波長為393 nm 處進(jìn)行熒光測定，記錄每個樣品孔及空白對照孔的熒光值，以半數(shù)抑制濃度(IC50)表示抑制率。抑制率(%)=(RFU100%酶活性對照-RFU樣品)/(RFU100%酶活性對照-RFU空白對照)×100%，式中，RFU 為相對熒光單位。

2 結(jié)果和討論

本研究從光果金櫻子中分離鑒定出15 個三萜類化合物，分別為：laevigaterpene A (1)、2α,23-二羥基齊墩果酸 (2)、1β-羥基薔薇酸 (3)、3β-(p-hydroxytranscinnamoyloxy)olean-12-en-28-oic acid (4)、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸 (5)、2α,3α-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸 (6)、坡模酸 (7)、樺木酸甲酯 (8)、2α,3α,19α,23-四羥基-12-烯-烏蘇酸(9)、乙?；?11α-甲氧基-β-乳香酸 (10)、阿江欖仁尼酸 (11)、2α,3α,19α-trihydroxy-28-norurs-12-ene (12)、薔薇酸 (13)、2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid (14)和齊墩果酸 (15)。這15 個三萜類化合物均為首次從光果金櫻子中分離得到，此外化合物4、10、12 為首次從薔薇屬植物中分離得到?；衔?、4、8、12、15 均具有SARS-CoV-2 Mpro抑制活性，IC50值分別為(51.39±0.42)、(45.02±0.28)、(6.74±0.33)、(40.21±0.10)和(5.19±0.25)μmol/L，化合物8、15 比陽性藥依布硒[(1.63±0.17)μmol/L]的抑制作用強;化合物2、4、12 對SARS-CoV-2 Mpro表現(xiàn)出較弱的抑制活性，而其他化合物則顯示出微弱的抑制活性(IC50>100μmol/L)。初步的構(gòu)效關(guān)系分析表明，當(dāng)化合物C-2 位上的氫未被取代，C-3 位為β-OH 取代時，抑制SARS-CoV-2 Mpro活性得到增強；引入羥基的數(shù)目也會影響其抑制活性，如化合物8 和15只有1 個羥基，化合物2 和12 有3 個羥基，前者的SARS-CoV-2 Mpro抑制活性強于后者；另一方面, 具有SARS-CoV-2 Mpro抑制活性的5 個化合物中，有3 個是齊墩果烷型三萜，提示后續(xù)作用機制的研究以及抗SARS-CoV-2 藥物的開發(fā)可重點關(guān)注齊墩果烷型三萜化合物。

研究表明，三萜類化合物具有廣泛的藥理活性,主要表現(xiàn)在抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗HIV 和護(hù)肝等方面[21]。據(jù)報道，化合物15 具有降糖、降脂、抗癌、增強免疫力等多種藥理活性[22]，化合物11 可以通過c-Jun氨基末端激酶(JNK)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞凋亡，是一種有效的NSCLC 化療藥物[23]。此外，光果金櫻子與金櫻子植物親緣相近, 可能具有相似的化學(xué)成分和藥理作用,如能作為金櫻子的來源去開發(fā)利用，前景十分廣闊。本研究進(jìn)一步豐富了光果金櫻子的化學(xué)成分，為其日后的研究與開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，更為后續(xù)光果金櫻子抗SARS-CoV-2 藥物的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。