巨桉擴(kuò)展蛋白EgrEXPA8 和EgrEXPA10 基因的克隆和表達(dá)特性分析

羅萍, 王曉萍, 張昊楠,2, 范春節(jié), 王玉嬌, 徐建民*

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局熱帶林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510520；2. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

擴(kuò)展蛋白(expansin, EXP)是植物中重要的蛋白之一，最早在黃瓜(Cucumissativus)的根尖細(xì)胞壁中被發(fā)現(xiàn)[1]，是一類能夠使植物細(xì)胞壁松弛的活性蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境抗性過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和毛果楊(Populustrichocarpa)中各有36 個(gè)EXP 成員[3–4]，葡萄(Vitisvinifera)中有29 個(gè)[5]，水稻(Oryzasativa)中有58 個(gè)[3]。根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異，擴(kuò)展蛋白可分為4 個(gè)亞家族，分別為擴(kuò)展蛋白A、B 亞家族(EXPA、EXPB)和類擴(kuò)展蛋白A、B 亞家族(EXLA、EXLB)[6]。其中EXPA 主要參與植物的根毛發(fā)生與伸長(zhǎng)[7]、種子萌發(fā)[8–9]、果實(shí)軟化[10–11]、木質(zhì)部的形成[12]、纖維發(fā)育[13]、莖和節(jié)間的伸長(zhǎng)[14]、葉片發(fā)育[15]等重要發(fā)育過程，同時(shí)也參與響應(yīng)植物非生物脅迫的過程,如耐鹽性[16]、抗旱性[17]、抗重金屬[18]等；EXPB 則主要參與花粉管伸長(zhǎng)[19–22]等。

桉樹(Eucalyptus)是世界三大速生樹種之一，具有生長(zhǎng)速度快、輪伐周期短、適應(yīng)性強(qiáng)以及木材質(zhì)量較好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于制漿造紙、木材加工、醫(yī)療和香料等產(chǎn)業(yè)，因此具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及生態(tài)價(jià)值[23]。其大量?jī)?yōu)良基因的功能尚待挖掘，巨桉(E.grandis)基因組測(cè)序的完成為開展相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)[24]，目前在巨桉中共發(fā)現(xiàn)35 個(gè)EXP 家族成員[25]，其中EXPA 亞家族成員24 個(gè)，但其在桉樹生長(zhǎng)發(fā)育或者響應(yīng)脅迫中的具體功能尚未見報(bào)道。

前期對(duì)桉樹不同節(jié)間進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在初生生長(zhǎng)到次生生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換過程中EgrEXPA8和EgrEXPA10存在差異表達(dá)，尤其是在次生生長(zhǎng)階段表達(dá)量顯著下降，說明其可能參與到桉樹的次生生長(zhǎng)或者木質(zhì)部發(fā)育的負(fù)調(diào)控。本研究以巨桉無性系GL1 為材料,克隆了2 個(gè)擴(kuò)展蛋白基因EgrEXPA8和EgrEXPA10，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等進(jìn)行了分析，采用qRT-PCR 技術(shù)分析它們的組織表達(dá)模式及對(duì)不同脅迫的響應(yīng)，并初步對(duì)EgrEXPA8和EgrEXPA10基因功能進(jìn)行分析，為其功能挖掘和分子調(diào)控機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

使用巨桉(Eucalyptusgrandis)無性系GL1 組培苗為材料，選取生長(zhǎng)健壯的生根苗移植到中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所溫室培養(yǎng)，6 個(gè)月后苗木生長(zhǎng)至約1.5 m，分別取根、莖尖、木質(zhì)部、韌皮部、幼葉、成熟葉，同時(shí)選取從頂端起第1、3、5、7、9、11 節(jié)間作為初生生長(zhǎng)到次生生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的材料。

生根的組培苗移植至溫室后，經(jīng)改良霍格蘭營養(yǎng)液水培生長(zhǎng)至約20 cm 高，選取生長(zhǎng)健壯、根系良好的水培苗，分別用0.1 mmol/L 茉莉酸甲酯(MeJA)、0.1 mmol/L 水楊酸(SA)進(jìn)行噴施、200 mmol/L NaCl溶液灌根，并在處理后0、1、6、24 和168 h 收集葉片。將水培苗轉(zhuǎn)移至去除磷(磷酸二氫鉀)或硼元素(硼酸)的改良霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別在6、24、48、96 和21 d 后收集葉片。每處理5 株苗，每處理3 個(gè)重復(fù)，取樣統(tǒng)一采集頂端向下第4～6 片葉片。所有樣品采集后迅速置于液氮中速凍，隨后立即轉(zhuǎn)入超低溫冰箱-80 ℃保存，用于RNA 提取。

1.2 菌株與質(zhì)粒

克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector 購于全式金生物技術(shù)(北京)有限公司，DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自擎科生物科技(北京)有限公司，植物RNA 提取試劑盒購于艾德萊生物科技(北京)有限公司，DNA 回收試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑購于美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)，熒光定量PCR 試劑TB Green?Premix Ex TaqTM 購于大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)。

1.3 RNA 的提取與cDNA 的合成

按照Aidlab EASYspin植物RNA快速提取試劑盒的說明書進(jìn)行RNA 提取，然后經(jīng)過DNase I 消化基因組DNA，得到純化的總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳以及NanoDrop one (購于美國賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)RNA 質(zhì)量和濃度，分別取1μg 檢測(cè)合格的總RNA，采用SuperscriptIII 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 合成。

1.4 基因克隆與測(cè)序

從Phytozome 13 (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)數(shù)據(jù)庫中分別下載EgrEXPA8和EgrEXPA10基因序列。利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)巨桉EgrEXPA8和EgrEXPA10基因的特異性克隆引物(表1)，由擎科生物科技(北京)有限公司合成。以稀釋10 倍的cDNA 為模板，采用Q5 High-Fidelity PCR Kit (NEB)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，采用20μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，68 ℃/70 ℃(EgrEXPA8/EgrEXPA10)退火20 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，并使用天根(北京)膠回收試劑盒回收位置正確且條帶明亮的產(chǎn)物，隨后連接到pEASY?-T1CloningKit 載體上并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在抗性平板上挑取平滑的菌落搖菌進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，選取正確的樣本菌液送睿博興科生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸序列的理化性質(zhì)，包括理論等電點(diǎn)、氨基酸長(zhǎng)度以及蛋白分子量等；利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線工具分析蛋白質(zhì)的疏水性和親水性；利用SOPMA (https://npsapra bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.exp asy.org/interactive)在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用NCBI 的Conserved domains database (CDD)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stru cture/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；在擬南芥信息數(shù)據(jù)庫(https://www.Arabidopsis.org/index.jsp)中檢索并下載了所有EXPA 蛋白的氨基酸序列，利用Clustal 程序?qū)﹁駱鋽U(kuò)展蛋白EgrEXPA8、EgrEXPA10與擬南芥擴(kuò)展蛋白EXPA 亞家族所有成員進(jìn)行多序列比對(duì)分析，使用MEGA 6.0 軟件，采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；同時(shí)利用NCBI BlASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線查找在擬南芥、楊樹、水稻、葡萄、大豆(Glycinemax)和黃瓜中的同源序列，并通過PFAM和SMART 對(duì)不同植物的同源序列進(jìn)行驗(yàn)證，下載各成員的蛋白序列，并利用DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)同源序列分析，利用MEGA 6.0 內(nèi)置的Clustal W 程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的差異表達(dá)分析

將巨桉RNA 樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以稀釋10 倍的cDNA 樣品為模板，根據(jù)克隆的EgrEXPA8和Egr-EXPA10測(cè)序結(jié)果，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)特異性定量引物，由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)，以EgrEF2為內(nèi)參基因。使用Roche公司的Light Cycler 96 熒光定量分析儀以及大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)的SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒。實(shí)時(shí)定量PCR 的反應(yīng)體系為20μL，包括1μL cDNA、10μL SYBR Green Ⅰ Master、10μmol/L 的正反向引物各0.8 和7.4μL，用ddH2O 補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,共40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析程序采用95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)以及3 次技術(shù)重復(fù)，根據(jù)2–ΔΔCT 法[26]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS22 分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較(P=0.05),然后利用GraphPad Prism 8 進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 EgrEXPA8 和EgrEXPA10 基因克隆

提取巨桉葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，根據(jù)擴(kuò)展蛋白基因Eucgr.J00120.1 和Eucgr.I01954.1 序列設(shè)計(jì)引物(表1)，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，克隆目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，2 個(gè)擴(kuò)展蛋白片段長(zhǎng)度均約為750 bp (圖1)?；厥漳康钠?，連接到T 載體上并進(jìn)行測(cè)序，其長(zhǎng)度分別為750 和735 bp，編碼249 和244 個(gè)氨基酸，命名為EgrEXPA8(Eucgr.J00120.1)和EgrEXPA10(Eucgr.I01954.1)。

圖1 巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 基因的PCR 擴(kuò)增電泳圖。M: DL 2000 DNA Marker; 1: EgrEXPA10; 2: EgrEXPA8。Fig. 1 PCR amplification of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 gene in Eucalyptus grandis. M: DL 2000 DNA Marker; 1: EgrEXPA10; 2: EgrEXPA8.

2.2 EgrEXPA8和EgrEXPA10蛋白的理化性質(zhì)分析

采用ProtParam 對(duì)EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析。EgrEXPA8 蛋白的理論分子量為26.52 kD，等電點(diǎn)(pI)為7.53，脂溶性指數(shù)為61.20。EgrEXPA10 蛋白的理論分子量與EgrEXPA8 近似，為26.29 kD，等電點(diǎn)為9.1，脂溶性指數(shù)為69.10。此外，EgrEXPA8 蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)為31.20，而EgrEXPA10達(dá)40.32，表明其穩(wěn)定性低于EgrEXPA8。這也表明這2 個(gè)蛋白可能具有不同的功能。

ProtScale 預(yù)測(cè)巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白為親水性蛋白。SOPMA 和SWISS-MODEL 工具同源建模法預(yù)測(cè)表明，EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以延伸鏈和無規(guī)卷曲為主(圖2)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明EgrEXPA8 和EgrEXPA10 蛋白均含有2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域DPBB_1 和Pollen_allerg_1。

圖2 巨桉EgrEXPA8 (A, C)和EgrEXPA10 (B, D)的二級(jí)(A, B)和三級(jí)(C, D)結(jié)構(gòu)模型Fig. 2 Secondary (A, B) and tertiary (C, D) structures model of EgrEXPA8 (A, C) and EgrEXPA10 (B, D) of Eucalyptus grandis

2.3 同源分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)Sampedro 等[27]的分類方法，27 個(gè)EXPA蛋白可分為10 個(gè)類群，EgrEXPA10 屬于第I 類群，與擬南芥的AtEXPA5 親緣關(guān)系最近，EgrEXPA8 屬于第III 類群，與擬南芥的AtEXPA8 親緣關(guān)系最近(圖3: A)。同源序列分析表明，EgrEXPA8 與其他植物擴(kuò)展蛋白的同源性為73.83%～82.81%，其中與葡萄VvEXPA8 的同源性最高。從構(gòu)建的進(jìn)化樹可見，巨桉EgrEXPA8 與葡萄、大豆、楊樹、擬南芥聚在同一支上(圖3: B)，親緣關(guān)系較近。EgrEXPA10 與其他植物擴(kuò)展蛋白的同源性為67.43%～82.38%，與葡萄VvEXPA10 的同源性最高，巨桉EgrEXPA10與黃瓜CsEXPA5 的親緣關(guān)系最近，且與葡萄、大豆、楊樹、擬南芥聚在同一支上(圖3: C)。

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹。A: EgrEXPA8、EgrEXPA10 和擬南芥α-expansins; B: EgrEXPA8 與其他植物α-expansins; C: EgrEXPA10 與其他植物α-expansins; Egr:巨桉; Pt: 毛果楊; Gm: 大豆; Vv: 葡萄; At: 擬南芥; Os: 水稻; Cs: 黃瓜。Fig. 3 Phylogenetic tree. A: EgrEXPA8 and EgrEXPA10 with α-expansins in Arabidopsis thaliana; B: EgrEXPA8 and α-expansins in other plants; C:EgrEXPA10 and α-expansins in other plants. Egr: Eucalyptus grandis; Pt: Populus trichocarpa; Vv: Vitis vinifera; At: Arabidopsis thaliana; Os: Oryza sativa;Cs: Cucumis sativus.

2.4 EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達(dá)模式

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)EgrEXPA8和EgrEXPA10在不同組織和不同節(jié)間的表達(dá)模式。結(jié)果表明，EgrEXPA8和EgrEXPA10在根、莖尖、木質(zhì)部、韌皮部、幼葉、成熟葉中呈現(xiàn)相似的表達(dá)特征，均在幼葉和莖尖表達(dá)量最高，而在木質(zhì)部和韌皮部中相對(duì)較低(圖4: A)。EgrEXPA8和EgrEXPA10均在莖的9 和11 節(jié)間的表達(dá)量顯著降低，說明Egr-EXPA8和EgrEXPA10可能參與桉樹初生生長(zhǎng)階段細(xì)胞壁的維持，也可能參與桉樹負(fù)調(diào)控次生生長(zhǎng)。同時(shí)，EgrEXPA8和EgrEXPA10在莖節(jié)間的表達(dá)略微不同,隨著節(jié)間的次生發(fā)育越來越成熟,EgrEXPA8均被抑制表達(dá)，EgrEXPA10在中間節(jié)間上調(diào)表達(dá)，而在未木質(zhì)化或者木質(zhì)化程度較高的兩端節(jié)間被抑制表達(dá)，其中在莖的節(jié)間7 表達(dá)量最高(圖4: B)。

圖4 巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達(dá)模式。R: 根; A: 莖尖; XY: 木質(zhì)部; P: 韌皮部; YL: 幼葉; ML: 成熟葉。Fig. 4 Expression patterns of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 in Eucalyptus grandis. R: Root; A: Apical; XY: Xylem; P: Phloem; YL: Young leaf; ML: Mature leaf.

EgrEXPA8能快速響應(yīng)鹽脅迫，鹽處理1 h 的表達(dá)量急劇下降，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量繼續(xù)下降。EgrEXPA10的表達(dá)量在鹽處理后也呈下降的趨勢(shì)，與EgrEXPA8不同的是，其在處理6 h 才出現(xiàn)顯著降低，處理168 h 的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)(圖5: A)。EgrEXP8和EgrEXPA10的表達(dá)對(duì)茉莉酸甲酯表現(xiàn)出相似的響應(yīng)方式，均被抑制表達(dá)(圖5: B)。在水楊酸處理下，EgrEXPA8和EgrEXPA10的表達(dá)呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)，EgrEXPA8的表達(dá)量迅速顯著提高, 且長(zhǎng)期噴施處理仍保持著較高水平,EgrEXPA10只在處理168 h時(shí)比對(duì)照顯著提高(圖5: C)。長(zhǎng)期缺硼條件下,Egr-EXPA8和EgrEXPA10的表達(dá)量均顯著提高，均在處理504 h 后達(dá)最高，EgrEXPA8在處理48 h 內(nèi)均被抑制表達(dá)，而EgrEXPA10在處理24 h 后逐漸上調(diào)表達(dá)(圖6: A)。缺磷條件下，EgrEXPA8的表達(dá)量呈下降-升高-下降的趨勢(shì)，在處理48 h后達(dá)到峰值, 約為對(duì)照的1.6 倍；EgrEXPA10的表達(dá)量在處理24 h后顯著提高，且在處理48 h 后達(dá)到峰值，約為對(duì)照的8～9 倍，隨后其表達(dá)量有所下調(diào)，但仍比對(duì)照提高(圖6: B)。

圖5 不同脅迫下巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達(dá)模式Fig. 5 Expression patterns of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 in Eucalyptus grandis under different stresses

圖6 缺硼和缺磷下巨桉EgrEXPA8 和EgrEXPA10 的表達(dá)模式Fig. 6 Expression patterns of EgrEXPA8 and EgrEXPA10 in Eucalyptus grandis under boron and phosphorus deficiency

這表明巨桉在不同的脅迫和激素處理下，Egr-EXPA8和EgrEXPA10的調(diào)控途徑及調(diào)控機(jī)制存在差異性，同時(shí)也說明EgrEXPA8和EgrEXPA10在巨桉響應(yīng)逆境脅迫中具有重要的調(diào)控作用。

3 結(jié)論和討論

擴(kuò)展蛋白是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，主要參與細(xì)胞擴(kuò)張以及一系列發(fā)生細(xì)胞壁修飾的發(fā)育過程以及植物抗病的重要生理過程[28]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到2 個(gè)在莖不同節(jié)間差異表達(dá)的基因，并克隆得到cDNA 序列，利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這2 個(gè)基因均含有DPBB_1 結(jié)構(gòu)域和Pollen_allerg_1 結(jié)構(gòu)域，均為擴(kuò)展蛋白基因且屬于EXPA 亞家族成員。采用qRT-PCR 技術(shù)分析EgrEXPA8和Egr-EXPA10基因在不同組織部位、不同節(jié)間以及不同脅迫條件下的表達(dá)模式，以期初步探索它們?cè)阼駱渖L(zhǎng)調(diào)控、逆境脅迫過程中的作用。

由于植物擴(kuò)展蛋白以酶的催化方式使細(xì)胞壁組分松弛、細(xì)胞伸展，因此不同的擴(kuò)展蛋白基因在植物體內(nèi)的發(fā)育階段具有不同的表達(dá)模式，且與細(xì)胞生長(zhǎng)和組織分化一致[29]。qRT-PCR 結(jié)果表明,Egr-EXPA8和EgrEXPA10基因均在分生組織或者細(xì)胞分裂旺盛的部位如嫩葉和莖尖中表達(dá)量較高，推測(cè)其主要在細(xì)胞分裂中起重要作用。另外,EgrEXPA8和Egr-EXPA10在莖尖和初生生長(zhǎng)占主要作用的上部節(jié)間表達(dá)量較高，而在次生生長(zhǎng)占主導(dǎo)的下部節(jié)間表達(dá)量急劇降低，推斷其可能主要調(diào)控初生生長(zhǎng)或者負(fù)調(diào)控次生生長(zhǎng)，這與前期轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)趨勢(shì)一致。已有研究表明外源噴施油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid, BR)可以提高擬南芥AtEXPA5的表達(dá)，且在det2-1和bri1-301突變體中AtEXPA5的表達(dá)量減少, 而在bzr1-1D功能獲得型突變體中表達(dá)量增強(qiáng)[30]。近期研究表明BR 在木本植物次生生長(zhǎng)過程中主要通過促進(jìn)纖維細(xì)胞的增加和減少木質(zhì)素，同時(shí)促進(jìn)木質(zhì)部細(xì)胞的膨大起作用[31–33]。這表明EgrEXPA8和EgrEXPA10可能參與了BR 調(diào)控次生木質(zhì)部發(fā)育過程。通過構(gòu)建Egr-EXPA8和EgrEXPA10表達(dá)載體，以探索其在桉樹生長(zhǎng)調(diào)控中的作用尤其是木材形成中的作用。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(如水楊酸等)是生物脅迫及非生物脅迫反應(yīng)的重要信號(hào)分子，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生持續(xù)抗性，從而減緩植物對(duì)多種逆境脅迫的傷害。本研究結(jié)果表明，EgrEXPA8和EgrEXPA10基因?qū)}脅迫、水楊酸與茉莉酸甲酯、缺磷、缺硼等逆境的響應(yīng)方式類似，推測(cè)同一亞家族的擴(kuò)展蛋白對(duì)相同脅迫或植物激素可能有相似的響應(yīng)模式。在鹽處理下，巨桉葉片內(nèi)EgrEXPA8和EgrEXPA10基因的表達(dá)量均顯著降低，這與地黃(Rehmanniaglutinosa)擴(kuò)展蛋白基因RgEXPA10的表達(dá)趨勢(shì)一致[34]。小麥(Triticumaestivum)擴(kuò)展蛋白TaEXPB23在茉莉酸甲酯處理后的mRNA 水平提高[35]，而本研究中Egr-EXPA8和EgrEXPA10基因表達(dá)在茉莉酸甲酯處理下均被抑制，可能是由于EgrEXPA8和EgrEXPA10基因與TaEXPB23為不同的亞家族，其響應(yīng)方式不同, 也可能是由于物種不同的原因。硼高效品種甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)在缺硼脅迫下根系中的BnaEXPA6、幼葉中的BnaEXPA5及老葉中的BnaEXPA3、Bna-EXPA5、BnaEXPA8和BnaEXPA16基因的表達(dá)水平均顯著高于硼低效品種[36]。巨桉EgrEXPA8和EgrEXPA10基因在長(zhǎng)期缺硼脅迫下均顯著上調(diào)，且EgrEXPA10較EgrEXPA8響應(yīng)更迅速，說明這2 個(gè)擴(kuò)展蛋白可能在桉樹缺硼脅迫中發(fā)揮著重要作用,為將來研究桉樹中硼響應(yīng)的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

本研究從巨桉中克隆了2 個(gè)擴(kuò)展蛋白基因Egr-EXPA8和EgrEXPA10，可能參與桉樹初生細(xì)胞壁的維持及次生生長(zhǎng)，在鹽脅迫、茉莉酸甲酯處理下均被抑制表達(dá)，在水楊酸處理、缺硼、缺磷處理下均被上調(diào)表達(dá)，在非生物脅迫響應(yīng)中起調(diào)控作用。