西葫蘆CpWRKY2 基因的分離、鑒定及其對(duì)非生物脅迫分析

劉建汀, 曾美娟, 張前榮, 葉新如, 陳敏氡, 裘波音, 王彬, 李永平,朱海生, 溫慶放

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 福建省蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心, 福州 350013)

植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中往往面臨各種生物和非生物脅迫，并在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的自我防御反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。WRKY 是一類(lèi)植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育代謝、生物和非生物脅迫(溫度、干旱等)調(diào)控[1–4]。研究表明，WRKY 家族成員的典型特征是含有1 或2 個(gè)由約60 個(gè)氨基酸構(gòu)成的高度保守WRKY 結(jié)構(gòu)域，其5′端包含保守的WRKYGQK 基序(極少數(shù)突變?yōu)閃RKYGKK、WRKYGMK、WRKYGEK 等)，3′端則含有1 個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)基序，可以特異結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子核心序列中的W-box 順式元件，激活或抑制下游基因的表達(dá)，并對(duì)生物和非生物脅迫反應(yīng)，改變植株的耐逆性[5–6]。根據(jù)WRKY 的結(jié)構(gòu)數(shù)目和特點(diǎn),WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可分為3 類(lèi)，第一類(lèi)(Ⅰ)含有2 個(gè)WRKY 保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型；第二類(lèi)(Ⅱ)含有1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)均為C2H2型, 又可細(xì)分為5 個(gè)亞類(lèi)(Ⅱa～Ⅱe)；第三類(lèi)(Ⅲ)含有1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC 型[7–8]。目前, 從植物中分離到的WRKY 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子大多都定位于細(xì)胞核中，且大部分WRKY 含有核定位信號(hào)保守基序[9]。

近年來(lái)，西葫蘆(Cucurbitapepo)的栽培面積僅次于黃瓜(Cucumissativus)，己經(jīng)成為農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要栽培作物。西葫蘆易受低溫、干旱等非生物脅迫影響，造成落花落果、果實(shí)畸形以及多種病害等生理障礙，導(dǎo)致產(chǎn)量與品質(zhì)嚴(yán)重下降[10–11]。據(jù)PlantTFDB v5.0 統(tǒng)計(jì)，目前已分離出約94 個(gè)擬南芥、125 個(gè)馬鈴薯(Solanumtuberosum)、109 個(gè)水稻(Oryzasativasubsp.indica)、69 個(gè)辣椒(Capsicumannuum)和88 個(gè)黃瓜WRKY 轉(zhuǎn)錄因子。植物通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)并產(chǎn)生一系列應(yīng)答基因表達(dá)產(chǎn)物，以減少脅迫產(chǎn)生的傷害和增加耐受性，WRKY蛋白起著重要的調(diào)控作用。WRKY 對(duì)逆境脅迫反應(yīng)主要依賴(lài)于脫落酸(ABA)[12]、水楊酸(SA)[13–14]、茉莉酸(MeJA)[15]和乙烯利(ETH)[16]等激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，WRKY 能夠直接與自身或下游基因啟動(dòng)子中的W-box 結(jié)合，正向或負(fù)向調(diào)控下游靶基因的表達(dá),形成復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而增強(qiáng)或降低植物對(duì)環(huán)境的耐受能力[17–18]。玉米(Zeamays)的ZmWRKY79通過(guò)激活下游靶基因ZmAAO3的表達(dá)并增加ABA 激素合成來(lái)提高耐旱能力[19]；在黃瓜的CsWRKY46通過(guò)介導(dǎo)ABA激素響應(yīng)積極參與低溫脅迫反應(yīng)防御[20];番茄(Lycopersiconesculentum)中20 個(gè)SlWRKYs基因通過(guò)結(jié)合下游基因或與其他轉(zhuǎn)錄因子形成的復(fù)合體參與ICE-CBF-COR 低溫調(diào)控途徑[21]；密羅木(Myrothamnusflabellifolia)中MfWRKY17的過(guò)量表達(dá)可以調(diào)控ABA 響應(yīng)基因(靶基因MfNECD3和MfRAB18),以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)植株的耐鹽和抗旱性[22]；狗牙根(Cynodondactylon)的CdWRKY2基因受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，并提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性, CdWRKY2 能特異地結(jié)合到CdSPS1和CBF2啟動(dòng)子的W-box 元件并激活其表達(dá)，協(xié)調(diào)介導(dǎo)蔗糖的合成和CBF 信號(hào)通路，調(diào)控植物的抗寒性[23]。目前，除本研究團(tuán)隊(duì)2020 年報(bào)道了2 個(gè)WRKY基因外，還鮮見(jiàn)西葫蘆其他WRKY基因的克隆和功能分析研究。

前期田間育種過(guò)程中發(fā)現(xiàn)西葫蘆‘福美6 號(hào)’容易受低溫、干旱等逆境脅迫影響，引起產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。本研究以‘福美6 號(hào)’為材料，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)從葉片中克隆獲得CpWRKY2基因，對(duì)基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的生物信息學(xué)及其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，探討CpWRKY2在西葫蘆非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中的調(diào)控作用，為開(kāi)展西葫蘆優(yōu)良品種的選育以及非生物脅迫防御反應(yīng)的分子機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料西葫蘆‘福美6 號(hào)’ (Cucurbitapepo‘Fumei 6’)由福建省蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福清東張基地(119.18° E，25.69° N)保存[10]。植物DNA提取試劑盒FastPure?Plant DNA Isolation Mini Kit、DNA Marker (DL 2000)、植物RNA 提取試劑盒Fast-Pure?Plant total RNA Isolation Kit、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA、限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ和BamH Ⅰ購(gòu)于TaKaRa 公司，基因擴(kuò)增試劑盒Phanta Max Master Mix、熒光定量試劑盒ChangesQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix、DL2000 plus DNA Marker、質(zhì)粒抽提試劑盒FastPure?Plasmid Mini Kit、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒FastPure?Gel DNA Extraction Mini Kit、同源重組試劑盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit、DNA 快速克隆試劑盒TA/Blunt-Zero Cloning Kit 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，瞬時(shí)表達(dá)載體PC1300S-GFP由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101 菌株均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司，其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 WRKY 基因及其上游啟動(dòng)子擴(kuò)增

參考植物DNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取西葫蘆樣品的DNA，根據(jù)西葫蘆全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序庫(kù)中搜索到的CpWRKY2基因信息，設(shè)計(jì)基因啟動(dòng)子和全長(zhǎng)克隆引物(表1)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳、純化、回收后，與PCE2TA/Blunt-Zero載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR 檢測(cè)后的陽(yáng)性單克隆菌液送至福州尚亞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 引物Table 1 Primers

1.3 蛋白生物信息學(xué)分析

采用在線(xiàn)工具包(SMS)(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)進(jìn)行基因和蛋白序列分析; DNAMAN軟件和EditSeq 5.01軟件分析蛋白的理化性質(zhì);進(jìn)化樹(shù)的最大似然法構(gòu)建采用MEGA 7.0 軟件; 保守結(jié)構(gòu)域分析采用SMART 軟件(http://smart.emblheidelberg.de/); 蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)和ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)軟件; 蛋白翻譯后修飾采用MotifScan 軟件(http://myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan); 蛋白信號(hào)肽分析采用SignalP 6.1 Server 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/); 蛋白跨膜分析采用TMHMM Server v6.0 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/); 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用在線(xiàn)軟件CFSSP (http://www.biogem.org/tool/choufasman/); 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用在線(xiàn)軟件SWISSMODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)進(jìn)行蛋白模板比對(duì)，采用SPDBV 軟件構(gòu)建蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，采用VMD 軟件進(jìn)行蛋白模型呈現(xiàn); 亞細(xì)胞定位分析采用Wolf Psort Prediction 軟件(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)。

1.4 CpWRKY2 基因的表達(dá)分析

選取顆粒飽滿(mǎn)的西葫蘆種子，用0.2%高錳酸鉀溶液進(jìn)行浸泡消毒2 h，清水洗凈晾干，在福建省蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福清東張基地蔬菜育苗大棚內(nèi)，播種于32 孔穴盤(pán)中，出現(xiàn)第2 片真葉后進(jìn)行移栽，采集商品期的西葫蘆根、莖、葉、花和果，利用百泰克試劑盒提取各組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，調(diào)整cDNA 濃度至50 ng/μL。根據(jù)獲得的CpWRKY2序列設(shè)計(jì)特異引物(表1)，以西葫蘆Actin基因(GenBank 登錄號(hào)：MH21108)為內(nèi)參基因[24]，利用ABI7500 Real-Time PCR system (美國(guó)ABI 公司)，參考ChangesQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均開(kāi)展3 次生物學(xué)和3 次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 不同處理下CpWRKY2 的表達(dá)分析

西葫蘆種子發(fā)芽后播種于32 孔育苗盤(pán)中，在光照培養(yǎng)箱(28 ℃，16 h 光照/28 ℃，8 h 黑暗)中培養(yǎng)4 周后，在5 ℃、10% PEG 6000、0.1 mmol/L ABA、50 mmol/L ETH、10 mmol/L SA 和50 mmol/L MeJA分別處理幼苗20 株，在0、2、4、8 和12 h 采集葉片液氮速凍，并于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每處?個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 CpWRKY2 亞細(xì)胞定位分析

利用Primer3Plus 在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物MQCp-WRKY2(表1)，在CpWRKY2基因的開(kāi)放讀碼框(ORF)兩端加入酶切位點(diǎn)SacⅠ和BamH Ⅰ (去掉終止密碼子)，以測(cè)序驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒PCE2TA/Blunt-CpWRKY2為模板進(jìn)行ORF 全長(zhǎng)擴(kuò)增和膠回收。用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA 1300-GFP(35S::GFP)進(jìn)行雙酶切。用同源重組連接酶將回收的CpWRKY2連接載體35S::GFP，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)菌液PCR 及測(cè)序驗(yàn)證, 獲得重組質(zhì)粒35S::CpWRKY2::GFP。將重組質(zhì)粒35S::CpWRKY2::GFP和對(duì)照空載質(zhì)粒35S::GFP分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 菌株中，挑取陽(yáng)性的單克隆菌落于含有50μg/mL 利福平和50μg/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在28 ℃搖床以200 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜；用含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES 和100 mmol/L 乙酰丁香酮的侵染液重懸農(nóng)桿菌至OD600約為0.8，冰浴1 h 后，用無(wú)針頭的10 mL 注射器將35S::CpWRKY2::GFP重組載體和35S::GFP空載體的菌液注射至煙草(Nicotianatabacum)下表皮。注射后的煙草置于室溫黑暗放置24 h，然后于28 ℃氣候箱中培養(yǎng)1 d。利用激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP8，德國(guó)萊卡)觀(guān)察侵染煙草葉片，分析CpWRKY2蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 軟件和2–ΔΔCT方法計(jì)算CpWRKY2基因的相對(duì)表達(dá)量，利用SPSS 19.0 軟件中單因素方差分析法對(duì)CpWRKY2表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 CpWRKY 基因克隆

根據(jù)西葫蘆全基因組信息，設(shè)計(jì)WRKY基因啟動(dòng)子引物QCpWRKY2，擴(kuò)增得到西葫蘆WRKY基因啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度為1 513 bp (圖1)。通過(guò)設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物，從西葫蘆基因組中克隆得到1 條全長(zhǎng)為1 349 bp 基因序列，同源性分析表明，該CDS 序列與同為南瓜屬的中國(guó)南瓜(Cucurbitamoschata,XM_023091218.1，E value: 0)的WRKY序列相似性高達(dá)98.51%，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證和比對(duì)分析，獲得的WRKY基因(GenBank登錄號(hào): MF988287)[11]和NCBI中公布的西葫蘆WRKY全基因組(XM_023676898.1)序列信息完全一致[25]，將該基因命名為CpWRKY2。

圖1 西葫蘆CpWRKY2 基因和啟動(dòng)子的PCR 擴(kuò)增。 M: DL2000 marker;A: 啟動(dòng)子; B: CpWRKY2 基因。Fig. 1 PCR amplified of CpWRKY2 and promoter of Cucurbita pepo.M: DL2000 marker; A: Promoter; B: CpWRKY2 gene.

2.2 生物信息學(xué)分析

序列分析表明，CpWRKY2基因全長(zhǎng)1 351 bp，上游和下游非編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為193 和38 bp，基因編碼區(qū)含有2 個(gè)內(nèi)含子(第590～775，905～998 位)(圖2)。預(yù)測(cè)CpWRKY2基因編碼279個(gè)氨基酸(AA),CpWRKY2 蛋白(登錄號(hào): XP_023532666.1)理論分子量(Mw)為30.18 kD，等電點(diǎn)為9.29，pH 7.0 時(shí)的帶電荷數(shù)為12.87。CpWRKY2 蛋白由20 種氨基酸構(gòu)成，其中絲氨酸(Ser)含量最高(17.6%)，丙氨酸(Ala)次之(9%)，色氨酸(Trp)最低(0.7%)。CpWRKY2蛋白包含79 個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、W 和V)、91 個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T 和Y)、34 個(gè)堿性氨基酸(K 和R)和23 個(gè)酸性氨基酸(D 和E)。Cp-WRKY2 蛋白的總平均疏水性(GRAVY)為–0.534, 蛋白不穩(wěn)定系數(shù)(II)為48.37，脂肪族指數(shù)(AI)為68.60，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。

圖2 CpWRKY2 基因全長(zhǎng)及其編碼氨基酸序列。紅色: 特征序列WRKYGQK 和鋅指結(jié)構(gòu)域C2H2; 方框: 起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)。Fig. 2 Full-length sequence of CpWRKY2and encoding amino acid sequence. Red: Characteristic sequence WRKYGQK and C2H2 domain; Box: Start codon(ATG) and stop codon (TGA).

西葫蘆CpWRKY2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(CFSSP)分析表明，隨機(jī)卷曲最多，為71.68%，其次為α螺旋和延伸鏈，分別占19.71%和6.81%，沒(méi)有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL、SPDBV 和VMD 軟件進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模和可視化作圖(圖3)，擬參與WRKY轉(zhuǎn)錄激活功能的61 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(204～ 264 位)由1個(gè)WRKYGQK (212～218 位)基序和C2H2(Cys: 232,238 位；His: 262, 64 位)鋅指結(jié)構(gòu)共同組成。

圖3 CpWRKY2 的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of tertiary structure of CpWRKY2

圖 4 CpWRKY2 在本氏煙草下表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。35S::GFP: 攜帶空載pCAMBIA1300-GFP 的農(nóng)桿菌菌株；35S::CpWRKY2::GFP: 攜帶重組載體pCAMBIA1300-CpWRKY2-GFP 的農(nóng)桿菌菌株。Fig. 4 Subcellular localization of CpWRKY2 in lower epidermal cells of Nicotiana benthamiana. 35S::GFP: Agrobacterium tumefaciens strain withe empty vector pCAMBIA1300-GFP; 35S::CpWRKY2::GFP: A. tumefaciens strain with recombinant vector pCAMBIA1300-CpWRKY2-GFP.

Motif Scan 在線(xiàn)軟件分析表明，CpWRKY2 蛋白包含1 個(gè)保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域(201～267 位，E值為1.6e-24)，206～266 位為WRKY 蛋白DNA 結(jié)合區(qū)域，鋅指結(jié)構(gòu)域(232～264 位)為C2H2型，且含有1 個(gè)保守RTGHARFRRAP (76～86 位)氨基酸序列，屬于典型的Ⅱd 型WRKY 蛋白。分析表明，113～116 和263～266 位為N 糖基化位點(diǎn)；47～50 和267～270 位為酪蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)；166～171 位為N-豆蔻酰化位點(diǎn)；33～35、74～76、156～158、167～169、181～183、184～186、199～201、211～213 和234～236位為蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)。TMHMM 表明, Cp-WRKY2 屬于非跨膜蛋白，不含跨膜螺旋區(qū)。SignalP分析表明，CpWRKY2 蛋白不含信號(hào)肽序列。CpWRKY2 中沒(méi)有核定位信號(hào)保守基序。

蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，CpWRKY2 轉(zhuǎn)錄因子位于細(xì)胞核中。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)亞細(xì)胞定位分析表明，在注射空載體35S::GFP的對(duì)照組中，綠色熒光在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，而注射瞬時(shí)表達(dá)載體35S::CpWRKY2::GFP的細(xì)胞中，僅在細(xì)胞核中有綠色熒光。說(shuō)明CpWRKY2 蛋白定位在細(xì)胞核上，這與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致，推測(cè)CpWRKY2 在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用(圖4)。

從PlantTFDB (http://planttfdb.gao-lab.org/)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了18 個(gè)CpWRKY2 同源蛋白的序列，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建CpWRKY2 (XP_023532666.1)、6 個(gè)葫蘆科(Cucurbitaceae)、4 個(gè)十字花科(Brassicaceae)、4 個(gè)禾本科(Gramineae)和4 個(gè)茄科(Solanaceae)植物的WRKY 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，西葫蘆CpWRKY2 與中國(guó)南瓜、印度南瓜、黃瓜和甜瓜等葫蘆科植物WRKY 聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系較近，與煙草、番茄和馬鈴薯等茄科植物WRKY 蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

圖5 WRKY 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。XP_023532666.1: 西葫蘆; XP_022946986.1: 中國(guó)南瓜; KAG6605183.1: 野生灰籽南瓜; XP_023006860.1: 印度南瓜; XP_011648567.1: 黃瓜; XP_008462838.1: 甜瓜; XP_022148532.1: 苦瓜; XP_009102803.1: 蕪菁; AT2G23320.1: 擬南芥; XP_013593834.1: 甘藍(lán); NP_001288884.1: 歐洲油菜; MLOC_22356.1: 大麥; EEC72879.1: 水稻; XP_008647807.1: 玉米; XP_021306906.1: 高粱; XP_016465866.1, XP_009764599.1: 煙草; NP_001352739.1: 番茄; NP_001275001.1: 馬鈴薯。Fig. 5 Phylogenic tree of WRKY. XP_023532666.1: Cucurbita pepo; XP_022946986.1: C. moschata; KAG6605183.1: C. argyrosperma; XP_023006860.1: C.maxima; XP_011648567.1: Cucumis sativus; XP_008462838.1: C. melo; XP_022148532.1: Momordica charantia; XP_009102803.1: Brassica rapa;AT2G23320.1: Arabidopsis thaliana; XP_013593834.1: Brassica oleracea; NP_001288884.1: B. napus; MLOC_22356.1: Hordeum vulgare; EEC72879.1:Oryza sativa; XP_008647807.1: Zea mays; XP_021306906.1: Orghum bicolor; XP_016465866.1, XP_009764599.1: Nicotiana tabacum; NP_001352739.1:Lycopersicon esculentum; NP_001275001.1: Solanum tuberosum.

2.3 CpWRKY2 基因上游啟動(dòng)子分析

PlantCARE 啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析表明(表2)，CpWRKY2基因啟動(dòng)子上游1 513 bp 具有許多順式作用元件，其中包含ARE、ABRE、MBS、TC-rich repeat 和W-box 等脅迫響應(yīng)元件，也存在光響應(yīng)、晝夜節(jié)律響應(yīng)等元件，暗示CpWRKY2基因可能受低溫、弱光、干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

表2 PlantCARE 啟動(dòng)子預(yù)測(cè)Table 2 Promoter prediction by PlantCARE

2.4 CpWRKY2 基因表達(dá)模式分析

定量PCR 分析表明，CpWRKY2基因在西葫蘆的根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，其中，花中的表達(dá)豐度最高，其次為根和莖，在果實(shí)中的表達(dá)量最低，CpWRKY2基因表達(dá)呈現(xiàn)組織特異性(圖6)。

圖6 CpWRKY2 的表達(dá)模式。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同F(xiàn)ig. 6 CpWRKY2 Expression pattern of CpWRKY2. Different letters upon column indicate significant difference at 0.05 level. The same below

西葫蘆幼苗經(jīng)5 ℃低溫處理，CpWRKY2在處理2、4 和6 h 有較高的表達(dá)豐度，12 h 后表達(dá)量降低，但表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照(0 h) (圖7)。用10%PEG 6000 模擬干旱脅迫，CpWRKY2在處理4 h 內(nèi)的表達(dá)無(wú)明顯變化，處理8 h 后表達(dá)量顯著高于對(duì)照，并在12 h 出現(xiàn)峰值。0.1 mmol/L ABA 處理后CpWRKY2呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，處理2 h的表達(dá)量最高，為對(duì)照的23 倍，達(dá)極顯著差異。CpWRKY2表達(dá)在50 mmol/L ETH 處理2 和4 h 上調(diào)，此后逐漸降低。CpWRKY2表達(dá)在10 mmol/L SA處理12 h 內(nèi)總體呈上調(diào)趨勢(shì)，在12 h 的表達(dá)豐度最高。CpWRKY2表達(dá)在50 mmol/L MeJA 處理2 和4 h 上升，此后逐漸降低，處理8 和12 h 的表達(dá)量低于對(duì)照。

圖7 不同脅迫下CpWRKY2 基因的表達(dá)模式Fig. 7 Expression pattern of CpWRKY2 gene under different stresses

3 結(jié)論和討論

轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的應(yīng)答脅迫轉(zhuǎn)錄重排在植物耐逆防御反應(yīng)過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，并以多基因家族的形式存在，據(jù)PlantTFDB 統(tǒng)計(jì)。目前鑒定出的轉(zhuǎn)錄因子至少有58 種，主要包括NAC、MYB、WRKY、DREB/ERF 和M-type_MADS 等家族。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、全基因組測(cè)序等技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的WRKY基因被逐漸分離出來(lái)，植物中的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子已達(dá)14 549 個(gè)，成為高等植物中最為常見(jiàn)及研究較多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[26]。研究表明，植物通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)并產(chǎn)生一系列應(yīng)答基因表達(dá)產(chǎn)物，以此減少脅迫產(chǎn)生的傷害并增加耐受性，WRKY 蛋白在此起著重要的調(diào)控作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆與功能鑒定研究在模式植物和其他作物中不斷深入，但鮮見(jiàn)西葫蘆中WRKY基因的克隆和分析的報(bào)道。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從西葫蘆‘福美6號(hào)’葉片中克隆得到CpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子基因,CpWRKY2的ORF 全長(zhǎng)為840 bp，CpWRKY2 蛋白與中國(guó)南瓜(XP_022946987.1)和黃瓜(XP_011648567.1)同源蛋白的相似性分別為99.64%和86.39%，具有高度的蛋白進(jìn)化保守性。Wolf Psort 在線(xiàn)預(yù)測(cè)和煙草瞬時(shí)表達(dá)分析表明，CpWRKY2 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中。此外，Motif Scan 分析表明，CpWRKY2 蛋白包含WRKY 保守結(jié)構(gòu)域(201～267 位)、WRKY 蛋白DNA 結(jié)合區(qū)域(206～266 位)和C2H2型(Cx5Cx23HX1H)鋅指(232～264 位)，且含有1 個(gè)RTGHARFRRAP 氨基酸保守基序，屬于典型的Ⅱd 亞類(lèi)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族[27]。

本研究結(jié)果表明，CpWRKY2基因具有組織表達(dá)特異性，在花中的表達(dá)量較高，暗示CpWRKY2基因可能參與了西葫蘆花期的發(fā)育調(diào)控[28–29]。目前已識(shí)別和克隆的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在各種環(huán)境(干旱、低溫、鹽、機(jī)械損傷等)的誘導(dǎo)下，其表達(dá)具有快速、瞬時(shí)等特點(diǎn)，同時(shí)還具有組織表達(dá)特異性，可通過(guò)介導(dǎo)ETH、SA、ABA 和MeJA 等信號(hào)通路對(duì)多種逆境脅迫進(jìn)行防疫反應(yīng)[30–32]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子上游啟動(dòng)子的順式作用元件是其參與何種逆境脅迫響應(yīng)的重要依據(jù)，本研究通過(guò)PlantCARE 在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)CpWRKY2上游啟動(dòng)子1 513 bp 內(nèi)包括1 個(gè)脅迫響應(yīng)元件ARE、2 個(gè)脫落酸(ABA)響應(yīng)元件ABRE、1 個(gè)MBS 干旱脅迫響應(yīng)的MYB 結(jié)合響應(yīng)元件、1 個(gè)TCrich repeat 防御和脅迫反應(yīng)元件以及3 個(gè)結(jié)合WRKY響應(yīng)生物和非生物脅迫響應(yīng)的W-box 元件[33–35]。經(jīng)RT-qPCR 驗(yàn)證，在5 ℃、PEG 6000 模擬干旱脅迫、ABA、ETH、SA 和MeJA 處理后，CpWRKY2均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)，暗示CpWRKY2基因可能參與多種非生物逆境，包括低溫、干旱等脅迫的調(diào)控，這與課題組前期對(duì)CpWRKY2基因在低溫弱光脅迫中的研究結(jié)果一致[11]。進(jìn)一步分析表明，正常情況下，CpWRKY2在西葫蘆葉片的表達(dá)量相對(duì)較低，但ABA 處理后呈先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，可能受其他WRKY 蛋白或CpWRKY2 上游啟動(dòng)子中含有的W-box (TTGACC)結(jié)合而調(diào)控自身表達(dá)，或在此響應(yīng)過(guò)程中受其他轉(zhuǎn)錄因子的競(jìng)爭(zhēng)抑制影響而呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)[36–37]。因此，推測(cè)CpWRKY2可能通過(guò)ABA信號(hào)途徑介導(dǎo)并參與多種脅迫反應(yīng)。但對(duì)非生物脅迫下西葫蘆中CpWRKY2的生物學(xué)功能及其調(diào)控分子機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究加深了對(duì)CpWRKY42參與逆境應(yīng)答調(diào)控的認(rèn)識(shí)，為下一步開(kāi)展CpWRKY2轉(zhuǎn)錄因子基因調(diào)控低溫、干旱等非生物脅迫的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究從西葫蘆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出1 條CpWRKY2基因，全長(zhǎng)1 071 bp，與中國(guó)南瓜的WRKY核苷酸序列相似性為98.51%，具有高度的保守性。CpWRKY2 蛋白包含1 個(gè)WRKY 保守結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指，且含有1 個(gè)RTGHARFRRAP 氨基酸保守基序，屬于Ⅱd 亞類(lèi)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族。CpWRKY2基因啟動(dòng)子中含有ARE、ABRE 和W-box 等可能的脅迫響應(yīng)順式作用調(diào)控元件，且CpWRKY2基因可受激素、低溫及干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)CpWRKY2基因在響應(yīng)西葫蘆低溫、干旱等非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。