miR-424靶向PTEN基因調(diào)控IL-6/STAT3信號通路影響骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制

肖仕珊 朱紅倩 (貴州省人民醫(yī)院血液科,貴州 貴陽 550002)

在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中,多發(fā)性骨髓瘤(MM)占比為12%～15%,僅次于非霍奇金淋巴瘤〔1〕。其主要病理基礎(chǔ)是漿細(xì)胞異常增殖及單克隆免疫球蛋白的過度表達(dá)。目前臨床多采用藥物化療及造血干細(xì)胞移植等治療MM,雖然取得重大進(jìn)展,但由于復(fù)發(fā)及多重耐藥性的原因,使得患者5年生存率仍然不超過40%〔2,3〕。故進(jìn)一步探究MM新型治療模式至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)其本身無法表達(dá)蛋白,主要是通過與靶基因結(jié)合,終止靶基因mRNA表達(dá)從而參與生物學(xué)特性調(diào)控〔4,5〕。研究表明多種腫瘤當(dāng)中miRNA表達(dá)出現(xiàn)異常,扮演著促癌或者抑癌基因的角色,從而參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程中,同時(shí)對腫瘤預(yù)后及靶向治療均具有十分重要意義〔6,7〕。據(jù)報(bào)道,miR-424參與某些癌癥的腫瘤生長、細(xì)胞分化和凋亡。如趙梓丹等〔8〕發(fā)現(xiàn)在肝癌組織和細(xì)胞中miR-424-5p低表達(dá),過表達(dá)miR-424-5p顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。Ueda等〔9〕發(fā)現(xiàn)miR-27a在乳腺癌組織中低表達(dá),miR-424-3p可通過破壞活性氧穩(wěn)態(tài)和損害自噬來改善乳腺癌細(xì)胞的化學(xué)抗性。Dastmalchi等〔10〕發(fā)現(xiàn)miR-424-5p靶向調(diào)控張力蛋白同源第10號染色體缺失的磷酸酶基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PTEN/PI3K/AKT/mTOR)在抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。然而目前尚無研究報(bào)道m(xù)iR-424與MM的關(guān)聯(lián)。另外有研究發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素(IL)-6/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3信號通路對MM的進(jìn)展至關(guān)重要,降低IL-6、STAT3水平顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡〔11〕。本研究擬探討miR-424與PTEN的關(guān)系,同時(shí)觀察期其對MM細(xì)胞凋亡和IL-6/STAT3信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1病歷資料 選擇2019年2月至2020年12月在貴州省人民醫(yī)院確診為MM的60例患者,查閱電子病例信息收集患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、免疫球蛋白分型、ISS分期、危險(xiǎn)分層、輕鏈類型等方面的信息,按照miR-424相對表達(dá)量(平均水平)分為高表達(dá)組(38例)和低表達(dá)組(22例)。納入患者均未進(jìn)行生物靶向、免疫、放療、化療等治療。研究方案獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號:2019006008)。

1.2研究材料 正常漿細(xì)胞、MM細(xì)胞株H929、U266、IM-9、RPMI8226(中科院上海細(xì)胞庫);噻唑藍(lán)(MTT,美國Sigma公司,批號:M2136);RPMI1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司,批號:23608-014);胎牛血清(中國四季青生物公司,批號:120824);胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素(美國GIBCO公司,批號:26139-021);PTEN、IL-6、STAT3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、原癌基因(c-Myc)抗體(美國Cell Signaling公司,批號:1610762、1390283、1411085、1304128、1205309、1126327);β-actin抗體(美國Santa Cruz公司,批號:sc-128046);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(二抗)(中國中杉金橋公司,批號:ZB-3219);miR-424 mimic、anti-miR-424 mimic、mimic nc、si-PTEN、si-control(上海吉?jiǎng)P基因公司);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司,批號:13426-083);miR-424、PTEN、U6引物(上海華大基因科技有限公司);DYCZ 425D型雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠);IX51倒置顯微鏡(日本olimpus公司);Multiskan FC酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞培養(yǎng):將正常漿細(xì)胞、MM細(xì)胞株U266、H929、RPMI8226及IM-9復(fù)蘇后,加入RPMI1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素)中,然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),條件:37 ℃、5%CO2。細(xì)胞適合度80%時(shí),加入胰蛋白酶消化,然后傳代。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染:H929、U266細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板,采用LipofectamineTM2000將miR-424 mimic、anti-miR-424 mimic和mimic NC轉(zhuǎn)染至H929、U266細(xì)胞中,獲得過表達(dá)miR-424和低表達(dá)miR-424的細(xì)胞株,然后選取低表達(dá)miR-424的細(xì)胞株,將si-control、si-PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)去,獲得低表達(dá)PTEN的anti-miR-424+si-PTEN細(xì)胞株。細(xì)胞分組:H929、U266細(xì)胞分為對照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染mimic nc的細(xì)胞)、miR-424組(轉(zhuǎn)染miR-424 mimic的細(xì)胞)、anti-miR-424組(轉(zhuǎn)染anti-miR-424 mimic的細(xì)胞)、anti-miR-424+si-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-424 mimic和si-control的細(xì)胞)、anti-miR-424+si-PTEN組(轉(zhuǎn)染anti-miR-424 mimic和si-PTEN的細(xì)胞)。

1.4靶基因預(yù)測及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 生信(TargetScanHuman)預(yù)測miR-424可能靶向PTEN。以PTEN質(zhì)粒為載體,分別構(gòu)建野生型3′UTR(PTEN 3′UTR-WT)和突變型3′UTR(PTEN 3′UTR-MUT)質(zhì)粒。通過LipofectamineTM2000將兩種質(zhì)粒分別與mimic nc、miR-424 mimic、anti-miR-424 mimic混合共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,48 h收集細(xì)胞裂解物,采用熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.5qRT-PCR檢測MM標(biāo)本及細(xì)胞中miR-424和PTEN的表達(dá) 在MM標(biāo)本及細(xì)胞當(dāng)中加入Trizol試劑提取總RNA,然后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,Prime Scrip TM試劑盒合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,條件如下:預(yù)變性:95 ℃,5 s;變性:95 ℃,5 s;退火:60 ℃,60 s,40個(gè)循環(huán)。以U6作內(nèi)參,過2-ΔΔCt來表示各目的基因的相對表達(dá)量,引物序列:miR-424上游引物,5′-CGCAAAACGTGAG GCGCT-3′,下游,5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′。U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PTEN上游引物,5′-ATAGCACGACGAGAGCAAACG-3′,下游5′-TTGTGATTATCGGCAGCGTC-3′。

1.6MTT法及癌細(xì)胞單克隆形成數(shù)目檢測細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,加入胰蛋白酶進(jìn)行消化計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度,按照1×103/孔接種到96孔板中,在24、48、72 h,分別加入MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,取出離心,將上清去掉,重懸于二甲基亞砜(DMSO)中,采用酶標(biāo)儀讀取450 nm值。加入胰蛋白酶進(jìn)行消化計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度,按照1×103/孔接種到6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)10 d,采用4%多聚甲醛溶液固定,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.7膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC/PI)染色檢測細(xì)胞株凋亡情況 加入胰蛋白酶進(jìn)行消化計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度,按照1×103/孔接種到6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,消化離心收集細(xì)胞,重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC及PI混勻,室溫避光孵育15 min,上機(jī)檢測。

1.8Western印跡檢測PTEN、IL-6、STAT3、Bcl-2、Bax、c-Myc表達(dá) 細(xì)胞在4 ℃裂解液中放置30 min,離心,并將上清液稀釋,常規(guī)方法提取樣本中的總蛋白,以50 μg樣品進(jìn)行上樣,電泳后,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗(PTEN、IL-6、STAT3、Bcl-2、Bax、c-Myc的稀釋比均為1∶2 000),二抗(1∶10 000)稀釋后,室溫孵育后,顯色30 min,以GAPDH為參照,分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-424靶向PTEN 3′UTR抑制PTEN表達(dá) TargetScanHuman預(yù)測結(jié)果顯示miR-424與PTEN 3′UTR在第281～287和1 892～1 898核苷酸位置存在靶向結(jié)合位置(圖1)。雙熒光素酶結(jié)果顯示W(wǎng)T miR-424組熒光素酶活性明顯低于miR-NC組,anti-miR-424組熒光素酶活性明顯高于miR-NC組(P<0.05),而MUT各組間的熒光素酶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。提示miR-424可能靶向調(diào)控PTEN。

表1 各組細(xì)胞雙熒光素酶結(jié)果比較

圖1 miR-424與PTEN 3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)

2.2miR-424及PTEN在MM骨髓標(biāo)本及MM細(xì)胞系中的表達(dá) MM骨髓標(biāo)本中miR-424表達(dá)(1.62±0.32)明顯高于正常骨髓組織(1.15±0.28,P<0.05),而PTEN的表達(dá)(1.02±0.23)明顯低于正常骨髓組織(3.41±0.56,P<0.05),且MM骨髓組織中miR-424與PTEN水平呈負(fù)相關(guān)(r=0.737 4,P<0.001)。MM細(xì)胞系H929、U266、IM-9、RPMI-8226中miR-424表達(dá)明顯高于正常漿細(xì)胞,而PTEN明顯低于正常漿細(xì)胞(P<0.05)。見表2。

表2 miR-424及PTEN在骨髓瘤細(xì)胞系中表達(dá)

2.3miR-424表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 miR-424高表達(dá)與ISS分期、危險(xiǎn)分層、輕鏈類型呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 miR-424高表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.4各組細(xì)胞增殖能力比較 與miR-NC組相比,miR-424組24、48、72 h的OD值、克隆數(shù)明顯升高,anti-miR-424組24 h、48 h、72 h的OD值、克隆數(shù)明顯降低(P<0.05);與anti-miR-424+si-NC組相比,anti-miR-424+si-PTEN組24、48、72 h的OD值、克隆數(shù)明顯升高(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組細(xì)胞增殖能力比較

圖2 各組細(xì)胞單克隆數(shù)目(結(jié)晶紫染色)

2.5各組細(xì)胞凋亡能力比較 miR-424組細(xì)胞凋亡率明顯低于miR-NC組,anti-miR-424組細(xì)胞凋亡率明顯高于miR-NC組(P<0.05);anti-miR-424+si-PTEN組細(xì)胞凋亡率明顯低于anti-miR-424+si-NC組(P<0.05)。見圖3、表5。

表5 各組細(xì)胞凋亡率比較

圖3 各組細(xì)胞凋亡能力

2.6各組細(xì)胞PTEN、IL-6、STAT3、Bcl-2、Bax、c-Myc表達(dá)水平的比較 與miR-NC組相比,miR-424組PTEN、Bax表達(dá)水平明顯降低,IL-6、STAT3、Bcl-2、c-Myc表達(dá)水平明顯升高;anti-miR-424組PTEN、Bax表達(dá)水平明顯升高,IL-6、STAT3、Bcl-2、c-Myc表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與anti-miR-424+si-NC組相比,anti-miR-424+si-PTEN組PTEN、Bax表達(dá)水平明顯降低,IL-6、STAT3、Bcl-2、c-Myc表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖4、表6。

表6 各組細(xì)胞PTEN、IL-6、STAT3、Bcl-2、Bax、c-Myc表達(dá)水平的比較

1～6:對照組、miR-NC組、miR-424組、anti-miR-424組、anti-miR-424+si-NC組、anti-miR-424+si-PTEN組圖4 各組細(xì)胞PTEN、IL-6、STAT3、Bcl-2、Bax、c-Myc表達(dá)水平

3 討 論

miR-424與多種腫瘤的形成、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。Ning等〔12〕發(fā)現(xiàn)肝癌組織和細(xì)胞中miR-424-5p下調(diào),X(染色體)失活特異性轉(zhuǎn)錄物(XIST)與miR-424-5p競爭性結(jié)合以增加O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)的表達(dá),從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性表型及裸鼠的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Dastmalchi等〔10〕發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR-424-5p下調(diào),miR-424-5p通過靶向調(diào)控PD-L1表達(dá),抑制乳腺癌細(xì)胞的生長,促進(jìn)其凋亡,激活T細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng),起到抑癌基因的作用。張洪波等〔13〕發(fā)現(xiàn)miR-424-5p能夠靶向NAcht富含亮氨酸重復(fù)蛋白(NLRP)1,抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖遷移和侵襲能力。Fan等〔14〕發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA癌癥易感性候選基因(LncRNA CASC)9直接靶向調(diào)控miR-424-5p,在體內(nèi)、外顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷。提示miR-424與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,但是發(fā)揮的作用不一致。本研究結(jié)果提示,miR-424在一定程度上促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖并抑制凋亡,在MM中發(fā)揮促癌作用。

PTEN是一種常見的腫瘤抑癌基因,研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA可靶向調(diào)控PTEN通路參與MM進(jìn)展。如Sun等〔15〕發(fā)現(xiàn)miR-32靶向調(diào)控PTEN的表達(dá),加入PTEN抑制劑SF1670后,MM細(xì)胞U266增殖能力明顯恢復(fù),凋亡能力明顯降低。彭志霞等〔16〕發(fā)現(xiàn)miR-30a通過靶向抑制PTEN表達(dá),激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制人卵巢癌細(xì)胞自噬,降低卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥性。周瑜輝等〔17〕發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織及乳腺癌MCF-7細(xì)胞miR-455-5p表達(dá)上調(diào),miR-455-5p通過抑制PTEN水平促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,抑制其凋亡。本研究說明,PTEN能夠抑制MM細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡。

MM是一種增殖與凋亡活性均低的分子克隆病。IL-6是維持MM細(xì)胞生存和促進(jìn)其增殖的核心細(xì)胞因子,IL-6介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子STAT3持續(xù)激活參與MM進(jìn)展。c-Myc屬于myc家族的成員,在腫瘤中異常表達(dá),扮演促癌基因角色。Bcl-2是一種凋亡抑制蛋白,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的概率。Bax是促細(xì)胞凋亡蛋白,在腫瘤細(xì)胞系及組織中呈低表達(dá),Bax/Bcl-2的比值是決定細(xì)胞凋亡抑制強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。吳含等〔18〕發(fā)現(xiàn)RAS癌基因家族成員RAB1A通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá),促進(jìn)多發(fā)性MM細(xì)胞8226增殖,而RablA siRNA可有效抑制RPMI8226細(xì)胞RablA的表達(dá),從而抑制其增殖,并促進(jìn)凋亡。Li等〔19〕發(fā)現(xiàn)在MM細(xì)胞系U266中,lncRNA UCA1通過靶向miRNA-331-3p/IL-6軸激活JAK2/STAT3途徑,提高c-Myc、CyclinD1、Bcl-2水平,降低Bax蛋白表達(dá),來促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。馮佳等〔20〕發(fā)現(xiàn)樺木酸通過抑制JAK2/STAT3信號通路,抑制c-Myc、cyclin D1、Bcl-2的表達(dá),從而促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡、抑制MM細(xì)胞增殖及裸鼠移植瘤生長。本研究說明,miR-424及PTEN通過調(diào)控IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮作用。

綜上,MM細(xì)胞的增殖、凋亡受miR-424及PTEN的雙重調(diào)控,miR-424可靶向PTEN調(diào)控IL-6/STAT3信號通路影響MM細(xì)胞的增殖和凋亡。