吡非尼酮對慢性阻塞性肺疾病合并肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織BMP7/Smad1/5通路的影響

王凱 王佳 李偉偉 (延安大學(xué)附屬醫(yī)院 胸外科,陜西 延安 76000;腫瘤科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種全球流行性疾病,也是全球疾病相關(guān)死亡的主要原因之一,其主要特征是持續(xù)的呼吸道癥狀和進行性氣流阻塞〔1,2〕。隨著COPD的進展,患者會發(fā)生肺間質(zhì)纖維化(PIF),引發(fā)低氧血癥或呼吸衰竭,嚴重威脅患者的生命健康,但至今仍缺乏特效藥物,因此有必要對COPD-PIF的發(fā)生及治療機制深入探究〔3〕。吡非尼酮是一種常用于治療肺纖維化的有效藥物,最近有研究表明吡非尼酮在COPD并發(fā)肺纖維化中具有很好的臨床療效,能有效改善患者肺功能及氣道炎癥,但其在COPD-PIF中的詳細治療機制還未得到明確〔4〕。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)7/Smad1/5信號通路參與調(diào)控慢性支氣管哮喘、肺纖維化等慢性進行性肺部疾病的發(fā)生〔5,6〕。吡非尼酮在COPD-PIF中的療效機制是否可能與BMP7/Smad1/5信號通路有關(guān)值得探究,由于煙熏法聯(lián)合脂多糖(LPS)構(gòu)建的COPD-PIF大鼠模型病理過程與人類COPD-PIF極為相似,因此本研究通過該方法構(gòu)建COPD-PIF大鼠模型,探究吡非尼酮對COPD-PIF大鼠肺組織BMP7/Smad1/5通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 將從百奧賽圖江蘇基因生物技術(shù)有限公司購買的75只SPF級SD大鼠(體質(zhì)量245～290 g)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w(55%的相對濕度環(huán)境、12 h明暗交替),許可證:SCXK(蘇)2016-0004,期間自由采食、飲水,于實驗前禁食12 h。

1.2主要試劑 吡非尼酮(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司,批準文號:國藥準字H20133375);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海信帆生物科技有限公司,貨號:G1120-100);二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司,貨號:23227);總蛋白提取試劑盒〔晨學(xué)生物科技(廣州)有限公司,貨號:SD-001〕;標記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗抗體、兔抗β-actin抗體、p-Smad1/5抗體(Cell Signaling Technology,貨號:7074、4970、9516);兔抗Smad1/5抗體(AF0614,貨號:Affinity Biosciences);兔抗BMP7抗體(Proteintech,貨號:12221-1-AP);實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,貨號:WE0149-UFL、BTN170403-RFS);白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號:E-EL-R0012c、E-EL-R0019c);IL-8 ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司,貨號:YS04227B);層黏連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA,江西艾博因生物科技有限公司,貨號:IB-E14153、IB-E12044);羥脯氨酸(HYP,上海瑞楚生物科技有限公司,貨號:R200796)。BioSpectrum Imaging System購自上海書俊儀器設(shè)備有限公司;SpectraMax iD5-多功能酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3分組與模型構(gòu)建 SD大鼠隨機取10只為對照組,其余60只進行模型構(gòu)建。采用煙熏法聯(lián)合脂多糖(LPS)構(gòu)建COPD-PIF模型構(gòu)建〔7〕:將大鼠置于自制密閉玻璃箱內(nèi),內(nèi)部點燃10支香煙進行煙熏實驗(2次/d、30 min/次),每天煙熏結(jié)束后移入正常環(huán)境中飼養(yǎng),于1 d及14 d對大鼠進行水合氯醛麻醉、仰臥固定后將注射器于聲門插入氣道注射LPS(200 μl、1 mg/ml),注射結(jié)束后將大鼠直立使LPS均勻流向肺部,為期28 d,對照組于第1天及14天向氣道注射等劑量生理鹽水,未進行煙熏實驗〔7〕。造模結(jié)束后以每組15只分為COPD-PIF組、低劑量組(50 mg/kg吡非尼酮)、中劑量組(100 mg/kg吡非尼酮)、高劑量組(200 mg/kg吡非尼酮)〔8〕,于造模結(jié)束后低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg吡非尼酮,對照組、COPD-PIF組灌胃等量生理鹽水,為時2 w,觀察大鼠一般情況。

1.4大鼠肺功能情況檢測 實驗結(jié)束后將所有大鼠麻醉后切開皮膚暴露氣管,進行氣管插管后一側(cè)連接小動物呼吸機,另一側(cè)連接肺功能檢測儀記錄大鼠第0.1秒用力呼氣容積(FEV0.1),用力肺活量(FVC)及呼氣峰流速(PEF)。

1.5HE及Masson染色觀察大鼠肺組織情況 每組選5只大鼠進行頸椎脫臼處死,取肺組織在甲醛溶液中固定、乙醇脫水后石蠟包埋后進行4 μm連續(xù)切片,左肺組織切片通過HE染色、乙醇脫水后進行封片觀察(n=5),右肺組織切片用麗春紅酸性品紅液中孵育2 min后依次添加磷酸鋁水溶液酶染及甲基綠染色2 min經(jīng)乙醇脫水后透明、封片觀察,即Masson染色。

1.6ELISA檢測大鼠肺組織中炎癥因子及LN、HA水平情況 另取5只大鼠肺組織(左肺組織用于檢測炎癥因子水平,右肺組織用于后續(xù)HYP含量檢測)進行勻漿后根據(jù)試劑盒說明書在450 nm處檢測組織中IL-1β、TNF-α、IL-8、LN、HA含量(設(shè)5個復(fù)孔)。

1.7堿水解法檢測大鼠肺組織HYP含量 取1.6所得肺組織勻漿液,使用HYP含量檢測試劑盒測定大鼠肺組織中HYP含量(設(shè)5個復(fù)孔)。

1.8Western印跡檢測肺組織BMP7/Smad1/5通路蛋白表達 取剩余5只大鼠右肺組織經(jīng)勻漿添加裂解液裂解后離心取上清、提取總蛋白,按照BCA試劑盒說明書步驟檢測蛋白含量,按40 μg/孔進行凝膠電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,經(jīng)低溫轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉后添加兔抗p-Smad1/5、Smad1/5、β-actin、BMP7(1∶1 000)一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜后經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(1∶3 000)孵育,清洗后使用電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色,在蛋白凝膠成像儀中觀察,使用Image-J軟件定量分析蛋白含量(重復(fù)5次)。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、多組間進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況觀察 實驗結(jié)束后,對照組狀況良好、行動敏捷;COPD-PIF組皮毛暗淡無光澤、飲食減少、大便干燥、行動緩慢、精神不濟,出現(xiàn)哮喘、呼吸急促困難、氣喘癥狀;與COPD-PIF組相比,低劑量組、中劑量組及高劑量組上述癥狀均得到不同程度減輕。

2.2吡非尼酮對大鼠肺功能的影響 與對照組相比,COPD-PIF組PEF、FVC和FEV0.1值顯著降低(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組PEF、FVC和FEV0.1值顯著增加(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組PEF、FVC和FEV0.1值顯著增加(P<0.05);與中劑量組細胞,高劑量組PEF、FVC和FEV0.1值顯著增加(P<0.05),見表1。

表1 各組肺功能及肺組織炎癥因子水平

2.3吡非尼酮對大鼠肺組織炎癥因子水平的影響 與對照組相比,COPD-PIF組肺組織IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著增加(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著降低(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,高劑量組IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.4吡非尼酮對大鼠肺組織病理學(xué)的影響 對照組肺組織肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)正常完整,上皮細胞整齊排列、結(jié)構(gòu)完整,未出現(xiàn)炎性細胞浸潤;COPD-PIF組肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,肺泡壁斷裂、支氣管壁及肺泡壁增厚,氣道平滑肌、杯狀細胞及結(jié)締組織增生、氣道管狹窄、管壁水腫、充血,黏膜上皮細胞脫落壞死、出現(xiàn)炎性細胞浸潤現(xiàn)象;與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組上述現(xiàn)象得到不同程度改善,見圖1。

圖1 各組肺組織病理學(xué)(HE染色,×200)

2.5吡非尼酮對大鼠肺組織纖維化的影響 對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常,未出現(xiàn)纖維組織沉積現(xiàn)象;COPD-PIF組肺組織中出現(xiàn)成纖維細胞增生、膠原纖維成片聚集現(xiàn)象,肺泡結(jié)構(gòu)受到損壞;與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組肺組織纖維組織沉積現(xiàn)象得到不同程度改善,見圖2。

圖2 各組肺組織纖維化(Masson染色,×200)

2.6吡非尼酮對大鼠肺組織HA、LN及HYP水平的影響 與對照組相比,COPD-PIF組肺組織HA、LN及HYP水平顯著增加(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組HA、LN及HYP水平顯著降低(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組HA、LN及HYP水平顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,高劑量組HA、LN及HYP水平顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 各組肝功能及纖維化指標、肺組織中BMP7/Smad1/5通路蛋白表達

2.7吡非尼酮對大鼠肺組織中BMP7/Smad1/5通路蛋白表達的影響 與對照組相比,COPD-PIF組肺組織中BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著降低(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著增加(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著增加(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著增加(P<0.05),見表2、圖3。

1～5:對照組,COPD-PIF組,低劑量組,中劑量組,高劑量組圖3 各組肺組織中BMP7/Smad1/5通路蛋白表達

3 討 論

COPD被認定為不完全可逆氣流受限的慢性肺病,其特征在于由遺傳和環(huán)境危險因素相互作用造成的肺部過度炎癥反應(yīng)所誘發(fā)的慢性支氣管炎和肺氣腫,這將導(dǎo)致免疫功能紊亂和肺組織破壞〔9,10〕。COPD造成的長期炎癥反應(yīng)可最終PIF的發(fā)生,COPD-PIF作為COPD進程中的一大常見病理改變,會加重患者肺功能損傷,加速疾病的進程,然而,COPD-PIF的發(fā)病機制及治療機制尚未闡明,并且缺乏特效藥,因此深入探究其治療機制迫在眉睫〔3,4〕。

吡非尼酮具有抗纖維化和抗發(fā)炎的特性,已在多種體外系統(tǒng)和肺纖維化動物模型中測試發(fā)現(xiàn)其在抗炎及抗氧化劑方面具有高效性〔11〕。PEF、FVC和FEV0.1是體現(xiàn)肺功能狀況的有效指標〔12〕。有研究表明吡非尼酮對COPD并發(fā)肺纖維化患者呼吸癥狀、炎癥反應(yīng)具有有效治療作用,可顯著改善肺功能〔4〕。吡非尼酮可通過抑制老年COPD-PIF患者血漿中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1誘導(dǎo)的NOX4表達而發(fā)揮疾病治療作用〔13〕。本研究結(jié)果表明,吡非尼酮可有效改善COPD-PIF大鼠肺功能。HYP為膠原蛋白所特有,可間接用于反映纖維化的程度〔14〕。間質(zhì)細胞所產(chǎn)生的HA,其生成在纖維化發(fā)生時顯著上升〔14〕。當LN大量生成時可導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng),而其進一步造成的過度修復(fù)則是纖維化發(fā)生的主要成因之一〔14〕。本研究結(jié)果表明,吡非尼酮可有效降低COPD-PIF大鼠氣道炎癥反應(yīng),抑制肺損傷及纖維化程度,從而對COPD-PIF具有有效治療作用。

BMP7作為TGF-β超家族成員之一,最先發(fā)現(xiàn)于骨組織中,與骨及軟骨形成有關(guān),但現(xiàn)今已有報道稱,其可表達于肺和腎臟等器官中,在肺發(fā)育和氣管上皮干細胞再生中發(fā)揮作用,參與氣道炎癥、支氣管肺發(fā)育不良、肺癌等肺部疾病的發(fā)生〔15～19〕。TGF-β1已被證明是促纖維化因子,而BMP7可作為天然拮抗劑抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肺成纖維細胞分化及細胞外基質(zhì)積累,除此之外,還可抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細胞中Ⅰ型膠原α鏈mRNA表達,從而具有潛在的抗纖維化作用〔15,20〕。支氣管肺發(fā)育不良(BMD)模型大鼠肺組織中BMP7表達異常降低,其在BMD大鼠肺泡發(fā)育中具有重要作用,是預(yù)防異常肺泡發(fā)育的保護性細胞因子〔15〕。重組BMP-7鼻內(nèi)治療可減少哮喘小鼠肺部炎癥和Ⅰ型膠原沉積,對肺過敏性炎癥具有保護作用〔21〕。Smads蛋白中受體型蛋白包括Smad1、5,參與BMP7/Smad信號通路〔22〕。BMP參與并刺激BMP R-Smad蛋白Smad1/5的磷酸化〔23〕。有研究發(fā)現(xiàn),積雪草苷可通過促進BMP7/Smad1/5信號通路激活來抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化程度〔5〕。本研究結(jié)果表明,吡非尼酮可顯著激活COPD-PIF大鼠BMP7/Smad1/5信號通路。