芬戈莫德對(duì)抑郁大鼠行為學(xué)及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

張玲 張磊 王建楠 劉思蕓 隋汝波

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 錦州 121000;2護(hù)理學(xué)院;3研究生院)

抑郁癥在世界范圍內(nèi)的患病率為4%左右,在我國,這一比例高達(dá)5%～6%,受各種內(nèi)外因素的影響,近年來該病的發(fā)病率不斷上升〔1〕。目前抗抑郁藥主要為5-羥色胺再攝取抑制劑及三環(huán)類藥物,僅僅為補(bǔ)充單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少,本質(zhì)上為對(duì)癥治療,治標(biāo)不治本,且療效不一〔2,3〕,所以進(jìn)一步尋找新的治療途徑至關(guān)重要。在抑郁癥發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥因子發(fā)揮著重要作用,主要表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)系統(tǒng)的激活〔4,5〕。研究顯示〔6〕,環(huán)氧化酶-2抑制劑塞來昔布可用于抗抑郁,但由于該種藥物的作用僅局限于炎癥反應(yīng)的單一靶點(diǎn),因此抗抑郁效果十分有限。而主要作用于T淋巴細(xì)胞的1-磷酸鞘氨醇受體調(diào)節(jié)劑芬戈莫德(FTY720)可以抑制炎癥反應(yīng)中的上游因素〔7〕,因此在抑制炎癥反應(yīng)方面更加有效。FTY720主要發(fā)揮T淋巴細(xì)胞從次級(jí)淋巴器官遷出的抑制作用,可以降低促炎因子水平,此外還能否減少腦內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤,改善由慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激所致的抑郁尚不明確〔8,9〕。本實(shí)驗(yàn)選用FTY720進(jìn)行免疫干預(yù),采用行為學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法,探討FTY720對(duì)大鼠抑郁行為的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,50只SPF 級(jí)SD大鼠〔動(dòng)物許可證號(hào) SCXK(遼)2017-0006〕,雄性,平均體質(zhì)量(200±15)g。

1.2實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 ①適應(yīng)性喂養(yǎng)。于錦州醫(yī)科大學(xué) SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。②所有大鼠開展敞箱實(shí)驗(yàn)和糖水消耗實(shí)驗(yàn)。③測量基線體質(zhì)量。④選取體質(zhì)量和行為學(xué)指標(biāo)等基線值均衡可比大鼠為試驗(yàn)大鼠?？偣?0只。本試驗(yàn)開展前獲得錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 由美國Sigma公司提供FTY720,蘇州禮來制藥有限公司提供鹽酸氟西汀膠囊,沈陽萬類生物有限公司提供兔抗大鼠去甲腎上腺素(NE)抗體、兔抗大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β抗體、兔抗大鼠IL-6抗體、兔抗大鼠多巴胺(DA)、兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G及5-羥色胺(HT)抗體。美國R&D公司提供酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒。德國Leica公司提供RM2235型石蠟切片機(jī),日本Olympus公司提供BX53型顯微鏡,美國Biotek公司提供ELX-800型酶標(biāo)儀。

1.4動(dòng)物分組及造模 實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激(CUMS)組,對(duì)照(Con)組,FTY720低、中、高劑量(FTY-L、FTY-M、FTY-H)組,每組10只。除Con組外,其余各組均建立抑郁模型〔10〕,給予大鼠禁食水、潮濕墊料、傾籠、行為限制、晝夜顛倒、4 ℃冰浴游泳、電擊足底、夾尾等9種刺激方法,建模大鼠每天進(jìn)行1種刺激,刺激方式在上述9中方法中隨機(jī)選取1種,共刺激3 w。在進(jìn)行上述刺激前1 d,各組均分別腹腔注射給藥,其中Con組和CUMS組均給予等體積去離子水,FTY-L組、FTY-M組和FTY-H組分別給予0.5、1.0、2.0 mg/kg FTY720。

1.5體質(zhì)量 共進(jìn)行4次體質(zhì)量測量,測量時(shí)間為刺激前1 d、刺激后第8、15及22天。

1.6糖水消耗 根據(jù)文獻(xiàn)〔7〕方法,對(duì)造模大鼠給予蔗糖水(濃度為1%)75 ml,并同時(shí)給予75 ml蒸餾水,觀察并記錄大鼠行為,1 h后,將上述蔗糖水和蒸餾水取出,測量并記錄大鼠消耗的水量,并由此推算大鼠糖和水的消耗比例。

1.7敞箱實(shí)驗(yàn) 參照標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法〔11〕,所使用的敞箱為自制箱,箱壁為黑色,底部為白色,且無需加蓋(箱子長和寬均為80 cm,高50 cm)。在箱子的底部用黑色筆劃分25個(gè)等格,再將各大鼠置于所劃分的中心方格內(nèi)。在5 min時(shí)間內(nèi),觀察并記錄大鼠穿越格數(shù)和兩后肢直立次數(shù),上述記錄值分別代表大鼠的水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模完成后,各大鼠取血,迅速采用4%多聚甲醛于心臟進(jìn)行灌注固定,并取大鼠大腦的海馬組織,先后經(jīng)過脫水、透明、浸蠟與包埋步驟制作海馬組織蠟塊,并常規(guī)切片,HE染色觀察大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)改變。

1.9Western印跡 造模完畢且大鼠取血后,將大鼠斷頭取腦,于冰塊上分離大鼠的海馬組織,然后加入200 μl RIPA裂解液〔含1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕,于冰塊上研磨成組織勻漿,4 ℃ 12 500 r/min離心15 min后取上清,依照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。蛋白定量完成后開展聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。加入一抗前,利用脫脂牛奶(濃度為5%)進(jìn)行封閉。一抗成分為:兔抗大鼠DA(1∶300)、兔抗大鼠5-HT(1∶500)、兔抗大鼠NE(1∶500)。加入一抗后設(shè)定溫度為4 ℃,搖床24 h,TBST緩沖液洗滌,按10 min/次的頻率共洗滌3次,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔(1∶5 000)二抗,室溫孵育2 h。按5 min/次的頻率采用TBST緩沖液進(jìn)行洗滌,共洗滌3次,電化學(xué)發(fā)光,灰度分析采用ImageJ軟件。

1.10ELISA 抑郁造模完畢后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,12 500 r/min離心,離心后取上清,待測。嚴(yán)格按試劑盒說明書開展ELISA。A450 nm應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,最后計(jì)算相應(yīng)樣本濃度,主要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線開展。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀態(tài) Con組進(jìn)食水情況較好,鼠毛順滑無脫落,較活躍。CUMS組進(jìn)食減少,體質(zhì)量增長緩慢,鼠毛毛躁且脫毛嚴(yán)重,活動(dòng)量銳減。FTY-L、FTY-M、FTY-H組進(jìn)食水略差,鼠毛基本無脫落,活動(dòng)量尚可。

2.2體質(zhì)量情況 Con組體質(zhì)量變化與飼養(yǎng)時(shí)間有關(guān),時(shí)間越長其體質(zhì)量增加越多(P<0.05)。CUMS組體質(zhì)量增長緩慢,僅刺激后第22天與刺激前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CUMS組和FTY-L、FTY-M、FTY-H組體質(zhì)量在刺激后第8、15、22天均顯著低于Con組(P<0.05);FTY-L組體質(zhì)量在刺激后第22天顯著高于CUMS組(P<0.05);FTY-M、FTY-H組體質(zhì)量在刺激后第15、22天顯著高于CUMS組(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間體質(zhì)量及水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分、糖水消耗比例情況

2.3敞箱實(shí)驗(yàn)及糖水消耗實(shí)驗(yàn) 與Con組的水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分及糖水消耗比例相比,CUMS組上述各指標(biāo)顯著更低(P<0.05);與CUMS組相比,FTY-M、FTY-H組水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分及糖水消耗比例顯著更高(P<0.05)。見表1。

2.4大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果表明,Con組海馬組織各區(qū)神經(jīng)元形態(tài)完整而飽滿,神經(jīng)元排列致密且有序;CUMS組CA1區(qū)神經(jīng)元表現(xiàn)萎縮,神經(jīng)元排列紊亂且稀疏,核固縮等凋亡現(xiàn)象;FTY-M及FTY-H組神經(jīng)元排列緊密有序,細(xì)胞形態(tài)飽滿,核固縮等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象顯著減少,見圖1。

圖1 各組海馬組織形態(tài)學(xué)(HE染色,×400)

2.5大鼠海馬組織DA、5-HT及NE表達(dá)水平 與Con組相比,CUMS組海馬組織中DA、5-HT及NE表達(dá)明顯下降(P<0.05);與CUMS組相比,FTY-M及FTY-H組DA、5-HT及NE表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組海馬組織DA、5-HT及NE表達(dá)及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.6大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α比較 與Con組比較,CUMS組血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量明顯上升(P<0.05);與CUMS組比較,FTY-L、FTY-M、FTY-H組血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠抑郁模型造模成功;給予FTY720后,盡管不能完全恢復(fù)到Con組水平,但抑郁大鼠的體質(zhì)量增長率在一定程度上有所增加,且可顯著提高大鼠行為學(xué)評(píng)分,即改善抑郁大鼠食欲減退、快感缺失、運(yùn)動(dòng)下降和探索行為下降等抑郁核心癥狀。綜上,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)應(yīng)用FTY720可顯著改善大鼠抑郁行為。

本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑郁大鼠的海馬組織有嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷現(xiàn)象,且主要集中于CA1區(qū),而FTY720則可以抑制這種現(xiàn)象的發(fā)生。其可能是因?yàn)?海馬在學(xué)習(xí)及情感表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。此前相關(guān)研究表明,抑郁大鼠的海馬神經(jīng)元多半會(huì)出現(xiàn)再生障礙,且隨著再生障礙程度的不斷加深,海馬神經(jīng)元甚至?xí)霈F(xiàn)凋亡,此時(shí)便會(huì)發(fā)生抑郁〔12〕。據(jù)此推測,FTY720發(fā)揮改善大鼠抑郁行為正是通過改善抑郁大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷而實(shí)現(xiàn)的。雖然目前缺乏相關(guān)研究,但有研究已證實(shí)FTY720對(duì)自閉癥及阿爾茨海默病模型的海馬組織神經(jīng)元具有保護(hù)作用〔13,14〕。

DA、NE和5-HT均是抑郁癥單胺類神經(jīng)遞質(zhì)機(jī)制中重要組成部分,其中NE可參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié),如調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)、情緒、體溫,此外,NE還參與機(jī)體的記憶與學(xué)習(xí)能力,并影響人體的睡眠與覺醒,還影響人體對(duì)痛覺與焦慮的感知等。當(dāng)NE功能下降時(shí),中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NE含量表達(dá)下降,則可引發(fā)抑郁癥。5-HT是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),其生理作用表現(xiàn)為副交感神經(jīng)節(jié)前纖維被抑制,而交感神經(jīng)節(jié)前纖維被興奮。這種生物學(xué)作用,可以使其參與多項(xiàng)中樞神經(jīng)運(yùn)動(dòng),如情緒控制,還可以調(diào)節(jié)人體的睡眠,并影響機(jī)體的攝食行為,還影響人體的焦慮等負(fù)面情緒及性行為的發(fā)生等。而當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí),5-HT的水平將隨之發(fā)生變化,上述各種中樞神經(jīng)運(yùn)動(dòng)也受到影響,由此便發(fā)生抑郁癥等精神類疾病。多巴胺能中邊緣獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的改變可能導(dǎo)致快感缺失〔15〕。所以DA、5-HT及NE的表達(dá)水平亦是反映抑郁現(xiàn)象的特異性指標(biāo)。而5-HT再攝取抑制劑等抗抑郁藥物通過提高5-HT的水平來達(dá)到抗抑郁治療效果,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FTY720同樣能夠通過提高DA、5-HT及NE的含量達(dá)到抗抑郁的治療效果。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的降低均可導(dǎo)致抑郁發(fā)生。而炎癥因子IL-1β、IL-6與TNF-α增多可過度激活下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸,此過程可升高糖皮質(zhì)激素水平〔16〕, 同時(shí)由于激活了吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)使邊緣系統(tǒng)受到影響,神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和DA水平隨之下降,并可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞釋放BDNF〔17〕,這提示,炎癥系統(tǒng)的激活可造成單胺類神經(jīng)遞質(zhì)降低,其為抑郁的始動(dòng)因素,也是疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素。如果能通過免疫干預(yù)減輕炎癥反應(yīng)必然會(huì)減少單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及BDNF的下降,這是治療抑郁的根本。目前免疫抑制治療抑郁的研究仍然較少,有限的研究〔18〕顯示,英夫利昔單抗為一種TNF-α拮抗劑,可以抑制炎癥指標(biāo)水平,從而緩解患者的抑郁癥狀。本研究結(jié)果顯示,FTY720通過降低IL-1β、IL-6與TNF-α水平同樣能夠提高單胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá),與此同時(shí)還可以改善海馬神經(jīng)元損傷,最終實(shí)現(xiàn)抑郁治療。

綜上,FTY720能夠有效改善海馬神經(jīng)元損傷并增加DA、5-HT和NE的表達(dá)進(jìn)而緩解大鼠的抑郁行為,其機(jī)制可能是通過降低IL-1β、IL-6與TNF-α水平實(shí)現(xiàn)的。本團(tuán)隊(duì)下一步研究的重點(diǎn)為進(jìn)一步探索FTY20是否能夠治療血管性癡呆,以期為臨床提供更多更有力的證據(jù)。