SFRP1減輕血管緊張素Ⅱ誘導H9C2心肌細胞損傷的機制

常學鋒 曲萌 顧明 石賀 何援越 趙東明 王思文 鄒德利

(北華大學 1附屬醫(yī)院急診科,吉林 吉林 132011;2基礎醫(yī)學院分子生物學教研室;3附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

心力衰竭是好發(fā)于中老年人群的慢性疾病,據(jù)流行病學統(tǒng)計顯示〔1〕,發(fā)達國家中心力衰竭發(fā)生率約為2.0%,其中65歲以上人群心衰占比更是超過1/10,而我國目前心力衰竭患病率約為1.3%,全國心衰患者接近1 800萬。研究表明,盡管目前治療和康復等技術(shù)發(fā)展,心力衰竭再住院率仍高達24.5%,約20.0%和50.0%患者在確診后1年和5年內(nèi)死亡,該數(shù)據(jù)與癌癥相當,甚至高于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌等多種常見癌癥的死亡率〔2〕。心肌肥大是導致心力衰竭的重要致病因素,是指心肌細胞體積增大、重量增加,包括向心性肥大和離心性肥大兩個類型,是心臟在長時間負荷過重的情況下導致的。心肌肥大是慢性心力衰竭的一個重要的代償方式,使心臟在一段時間內(nèi)維持機體對心輸出量的需求,而不至于發(fā)生心力衰竭,但持續(xù)心肌肥大可導致心臟結(jié)構(gòu)不可逆重塑,最終導致心力衰竭病情加重。基礎研究發(fā)現(xiàn),機體通過自噬實現(xiàn)凋亡細胞的清除,是目前治療心肌肥大所致心力衰竭的重要靶點。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)1是調(diào)節(jié)典型β-連環(huán)蛋白(catenin)活性的重要因子,同時也被認為是Wnt信號通路的抑制劑,既往研究發(fā)現(xiàn)〔3〕,SFRP1可抑制Wnt信號通路激活,阻礙心肌梗死后纖維化進程,其原理是抑制Wnt信號通路下游自噬相關(guān)基因(ATG)級聯(lián)蛋白表達。本研究中擬采用血管緊張素(Ang)Ⅱ刺激小鼠H9C2細胞建立一個體外心肌肥大模型,用腺相關(guān)病毒9型(AAV9)-SFRP1對其進行治療,努力為心肌肥大、心肌細胞凋亡導致的心力衰竭和心臟性猝死提供新的治療方法并探索其機制。

1 材料與方法

1.1材料 H9C2心肌細胞購自中國科學院(上海)細胞庫。從Abcam購買以下主要抗體:SFRP1(ab4193)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2(ab32124)、Bcl-2相關(guān)X相關(guān)蛋白(Bax,ab232479)、細胞色素(Cyt)c(ab244288)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase-3,ab32351)、p62(ab109012)、ATG5(ab108327)、Beclin1(ab207612)、心房鈉尿肽(ANP,ab251006)、腦鈉尿肽(BNP,ab309127)、β-肌球蛋白重鏈(MHC,ab37484)、GAPDH(ab181602)。Ang Ⅱ和3-甲基腺嘌呤(MA)從Sigma購買。腺相關(guān)病毒9型過表達人全長SFRP1(AAV9-SFRP1)由漢寶(中國上海)制造;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑從Hyclone購買。

1.2細胞培養(yǎng)與心肌肥大模型建立 采用含10%胎牛血清(FBS)和抗生素(青霉素-100 U/ml和鏈霉素-100 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃培養(yǎng)箱中加入5%的CO2中培養(yǎng)H9C2細胞,每天定時換液,當細胞密度達到80%～90%時,采用細胞計數(shù)儀測定細胞密度,調(diào)整細胞密度在1×106個/ml,將細胞接種在6孔培養(yǎng)板上,每個培養(yǎng)板上有5×105個細胞,加入含有10.0% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5.0%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞密度達到80%～90%后,培養(yǎng)基更換為2.0%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,AngⅡ(1 μmol/L)在轉(zhuǎn)染5 d后暴露于H9C2細胞48 h,誘導H9C2細胞肥大。

1.3腺相關(guān)病毒過表達載體轉(zhuǎn)染 用含有Sfrp1基因或不含Sfrp1基因的重組AAV9載體轉(zhuǎn)染H9C2細胞(MOI=6×105vg/細胞)。在轉(zhuǎn)染5 d后H9C2細胞暴露于Ang Ⅱ(1μmol/L)48 h以誘導肥大,其中含有Sfrp1基因的H9C2細胞為過表達SFRP1(SFRP1)組,不含Sfrp1基因的H9C2細胞為Ang Ⅱ組,未暴露于Ang Ⅱ而且未進行轉(zhuǎn)染的正常H9C2細胞為正常(Control)組。如果腺相關(guān)病毒含有熒光蛋白,一般轉(zhuǎn)染48 h后可見明顯熒光表達。Western轉(zhuǎn)染效率驗證可在轉(zhuǎn)染后48 h進行,PCR驗證通常在24 h進行。

1.4細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8活力測定 通過CCK-8(中國上海Dojindo實驗室)測量細胞活力,并嚴格按照制造商的說明進行操作。H9C2細胞接種在96孔板中,每個孔板上有1×105個細胞。重塑后,將細胞與10 μl WST-8(一種細胞增殖檢測試劑)在37 ℃下孵育2 h。使用微孔板讀取器測量細胞的吸光度。細胞活力=試驗孔中的平均吸光度/對照孔中的平均吸光度×100%

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 采用膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染色法檢測細胞凋亡,嚴格按照制造商的指示(中國北津4A生物技術(shù)公司)進行操作。首先設置空白管、單染管、實驗管和陰性管,其中空白管細胞不加任何染料,用于調(diào)節(jié)電壓;單染管分別單獨添加 PI 和熒光標記的Annexin Ⅴ兩個單染管,用來調(diào)節(jié)補償;試驗管誘導凋亡的細胞加本實驗的所有熒光染料;陰性管是正常培養(yǎng)細胞加入染料,確認細胞正常狀態(tài),排除假陽性。細胞處理和染色步驟:取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔板中,在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)保證最終收集的細胞數(shù)大于5×105個;取出6孔板中細胞培養(yǎng)基,采用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞5 min,加入不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞,為避免胰蛋白酶對質(zhì)膜破壞導致Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細胞膜的細胞質(zhì)表面上出現(xiàn)假陽性染色,胰蛋白酶消化后可使細胞在最佳細胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復約 30 min,然后再染色。將收集的H9C2細胞混勻,4 ℃ 2 990 r/min速度離心5 min,棄上清。用預冷的1×PBS 洗滌細胞2次,每次5 min。加入1× 結(jié)合緩沖液,將細胞調(diào)節(jié)成相同濃度(常規(guī)為1×106/ml),取(1～2)×105個細胞懸液于流式管中,加入適量標記了熒光染料的Annexin Ⅴ和適量 PI,輕輕混勻,并在室溫避光環(huán)境下孵育15～20 min,最后添加300 μl PBS 重懸細胞,盡快(2 h內(nèi))用流式細胞儀(ACEA,美國)分析每個樣本中的細胞,每次測量共記錄10 000個有關(guān)細胞活動的數(shù)據(jù)點。利用FLOWJO軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。

1.6Western印跡分析 去除細胞培養(yǎng)基并經(jīng)1×PBS洗滌3次,每次5 min,隨后加入適當體積1×PBS,細胞刮刮下細胞后在離心機中以9 967 r/min速度離心10 min,去除上層PBS,根據(jù)每107個細胞加1 ml裂解緩沖液的比例加入預冷的裂解緩沖液,用冰冷裂解緩沖液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的里帕緩沖液)制備細胞提取物,細胞溶解液在冰上裂解30 min,隨后在4 ℃(179 400 r/min,15 min)下離心。細胞溶解液蛋白濃度采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定,每孔加入蛋白50 μg。通過SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(微孔)上。然后在室溫下用脫脂乳封閉膜1 h,然后在4 ℃下與主要抗體(anti-SFRP1、anti-BCL-2、anti-BAX、anti-CYTC、anti-Caspase-3、anti-p62、anti-ATG5、anti-beclin1、anti-ANP、anti-BNP、anti-β-MHC、anti-GAPDH)孵育過夜。次日,PBS進行洗膜,3次×10 min,然后將膜與辣根過氧化物酶二級抗體在室溫搖床下孵育1 h。最后,用增強化學發(fā)光(ECL)系統(tǒng)對蛋白表達進行了可視化,并用ImageJ軟件進行了定量分析。

1.7BCA測定 ①蛋白標準品的準備:蛋白標準品稀釋至終濃度為0.5 mg/ml,可以用0.9% NaCl或PBS 稀釋標準品,稀釋后的0.5 mg/ml蛋白標準可以-20 ℃長期保存;②BCA工作液配制:根據(jù)樣品數(shù)量,按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制適量BCA工作液,充分混勻。比如5 ml BCA試劑A加0.1 ml BCA試劑B,混勻,配制成5.1 ml BCA工作液。BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定;③蛋白濃度測定:將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加到96孔板的標準品孔中,加標準品稀釋液補足到20 μl,相當于標準品濃度分別為0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/ml。加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中。樣本可適度稀釋,如果樣品不足20 μl,加標準品稀釋液補足到20 μl。請注意記錄稀釋倍數(shù)。各孔加入200 μl BCA工作液,37 ℃放置20～30 min。BCA法測定蛋白濃度時,顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低,適合在較高溫度孵育,或適當延長孵育時間。用酶標儀測定A562波長的吸光度,根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS27.0軟件行χ2、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1過表達SFRP1可明顯增強H9C2心肌細胞活力 與Control組比較,Ang Ⅱ組H9C2心肌細胞活力明顯下降(P<0.05)。與Ang Ⅱ組比較,SFRP1組H9C2心肌細胞活力顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 3組心肌細胞活力、ANP、BNP、β-MHC、p62、ATG5和Beclin1蛋白相對表達量比較

2.2過表達SFRP1可促進H9C2心肌細胞啟動自噬程序 與Control組比較,Ang Ⅱ誘導后H9C2細胞的ANP、BNP和β-MHC蛋白表達明顯升高(P<0.05),給予腺相關(guān)病毒過表達SFRP1處理后,ANP、BNP和β-MHC蛋白表達顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3過表達SFRP1可抑制H9C2心肌細胞肥大標志物表達 與Control組比較,Ang Ⅱ誘導后,H9C2細胞的p62等蛋白表達明顯升高,ATG5和Beclin1蛋白表達明顯降低(P<0.05),給予過表達SFRP1后p62蛋白表達顯著降低,ATGF5和Beclin1蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表1。

2.4過表達SFRP1可抑制H9C2心肌細胞凋亡 與Control組比較,Ang Ⅱ誘導后,H9C2細胞的Bax、Cytc和Caspase-3蛋白表達明顯升高,Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05),給予腺相關(guān)病毒過表達SFRP1處理后,Bax、Cytc和Caspase-3蛋白表達顯著降低,Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 3組Bax、Cytc、Caspase-3和Bcl-2蛋白相對表達量比較

3 討 論

心力衰竭作為全球范圍內(nèi)高死亡率的慢性疾病,其發(fā)病病例機制復雜,研究證實〔4〕,包括心肌肥大在內(nèi)的多種因素均是導致心力衰竭病情進展的重要因素。心肌肥大是心肌細胞對生理或者病理性刺激的適應性調(diào)整,通過降低心室壁的應力,最終達到滿足心臟正常功能需求,但隨著心肌肥大持續(xù)性改變轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇苑蚀?造成心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu),最終導致心力衰竭發(fā)生。伴隨現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)發(fā)展和醫(yī)療理念的轉(zhuǎn)變,心力衰竭治療已從短暫改善癥狀,轉(zhuǎn)變至預防、延緩甚至逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)為目標〔5〕。目前,諸如醛固酮拮抗劑、β受體阻滯劑、腦啡肽酶抑制劑等多種拮抗心肌重構(gòu)藥物被應用于臨床,患者整體死亡率已得到顯著控制,但仍存在藥物相關(guān)副作用較多、患者生活質(zhì)量欠佳等一系列問題,最終誘發(fā)多種并發(fā)癥〔6〕,直接損害患者預后質(zhì)量。

通過Ang Ⅱ刺激H9C2細胞建立離體心肌肥大模型,H9C2細胞因其具由傳代能力強、細胞活性高及實驗操作性廣等優(yōu)勢〔7〕,常被作為心血管疾病離體模型的理想細胞載體,用于探索藥物或基因在心肌細胞中作用的機制研究。Ang Ⅱ作為機體腎素-血管緊張素-醛固酮軸中重要的效應因子,已被證實在臨床眾多心血管疾病中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,其在可在不加重外周血管阻力和心臟后負荷條件下,直接刺激心肌細胞促進其肥大進程,因此本研究將Ang Ⅱ作為H9C2細胞肥大模型的刺激因子,該模型有效性已被文獻充分證實。基礎研究表明〔8,9〕,機體通過自噬實現(xiàn)心肌凋亡細胞的清除,是目前逆轉(zhuǎn)心肌肥大進程的重要治療方向。Wnt/β-catenin信號通路被證實在心臟發(fā)育和結(jié)構(gòu)重構(gòu)中起主導作用,且與心肌肥大發(fā)生密切相關(guān),目前多種Wnt信號通路抑制劑被證實可改善心肌重塑,但由于存在明顯的不良反應,極大限制其臨床使用,因為尋求更為安全高效的治療靶點迫在眉睫〔10〕。SFRP1是Wnt信號通路關(guān)鍵的抑制劑,因其自身富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域具有與卷曲受體相似結(jié)構(gòu),可實現(xiàn)競爭性結(jié)合效應〔11〕,使Wnt/β-catenin無法進入細胞核激活下游轉(zhuǎn)錄因子。既往研究發(fā)現(xiàn)〔12,13〕,敲除SFRP1基因小鼠表現(xiàn)為更嚴重的心肌纖維化和更差的心功能,且Wnt/β-catenin信號通路被激活,此外過表達SFRP1基因具有抑制心肌細胞凋亡作用。同時研究表明〔14〕,SFRP1能抑制ATG級聯(lián)蛋白表達,啟動心肌細胞自噬程序。本研究結(jié)果顯示,過表達SFRP1能夠明顯促進H9C2細胞增殖活性,同時通過流式細胞術(shù)和Western印跡提示H9C2細胞凋亡明顯減少。自噬是真核細胞獨有且進化高度保守的代謝調(diào)控機制,能夠降解結(jié)構(gòu)和功能異常蛋白、損傷和老化細胞器,以維持細胞正常物質(zhì)循環(huán)、能量代謝及自我更新。近年來研究發(fā)現(xiàn),心血管疾病發(fā)生發(fā)展與自噬密切相關(guān),其中細胞自噬能力減弱被證實可促進心肌肥大發(fā)展。敲除Atg5等自噬相關(guān)基因后,心肌肥厚進程明顯加快,而促進自噬有助于延緩心肌肥大。本研究提示SFRP1在心肌細胞自噬過程中發(fā)揮重要作用,是維持心肌細胞自噬活性的重要基因。抑制心肌肥大是臨床治療的重要目標,ANP、BNP和β-MHC是目前公認的心肌肥大標志物,其中ANP和BNP既往常備作為心衰等心血管疾病診斷與預后的生化標志物,其表達水平與左心室舒縮功能、瓣膜功能及右心室功能存在明顯相關(guān)性,目前已被證實其參與心肌肥大和重構(gòu)。心肌細胞是一種分化成熟的終末功能細胞,正常情況下高表達α-肌球蛋白,而心肌肥大時β-MHC蛋白大量表達并占據(jù)優(yōu)勢,提示心肌細胞重構(gòu)處于高度活躍狀態(tài),是評估心肌細胞重構(gòu)的重要標志物。本文結(jié)果提示SFRP1在心肌肥大進程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用,與其促進心肌細胞增殖、抑制凋亡及啟動自噬程序清除凋亡細胞等作用有關(guān)。

綜上,過表達SFRP1能夠促進心肌細胞增殖和抑制凋亡,同時啟動心肌肥大進程中自噬程序,清除凋亡心肌細胞,是抑制心肌肥大的重要基因和潛在治療靶點。