BDNF/TrKB介導(dǎo)的突觸丟失對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙的影響及機(jī)制

孫衍昶 馮基高 歐陽(yáng)一彬 劉達(dá)遠(yuǎn) (海南醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科,海南 海口 570311)

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是由外部物理力量引起的腦功能損傷或其他腦病理特征〔1〕。在中國(guó),TBI 患者的死亡率為 13/10 萬(wàn)人,雖然近年來(lái)TBI發(fā)病率有所下降,但由于TBI病理復(fù)雜性,中樞神經(jīng)系統(tǒng)常出現(xiàn)不可逆性損傷,仍會(huì)有約30%的顱腦損傷患者死于繼發(fā)性二次損傷,致殘致死率高〔2〕。

研究發(fā)現(xiàn),TBI發(fā)生過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生腫塊損傷、挫傷、彌漫性軸索損傷及一系列可以造成神經(jīng)元損傷的機(jī)制,如缺血、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、皮質(zhì)擴(kuò)散抑制和微血管血栓形成等,導(dǎo)致不同的臨床病理特征〔3〕。盡管對(duì) TBI 機(jī)制的大多數(shù)研究都集中在神經(jīng)元損傷上,但有研究〔4〕表明,突觸及其內(nèi)在分子通路在多種腦部疾病中發(fā)揮重要作用,這增加了突觸與 TBI 相關(guān)的可能性。且多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)〔5～7〕,在TBI動(dòng)物模型中可觀察到突觸丟失的現(xiàn)象,進(jìn)一步提示了突觸功能在TBI中的重要作用。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中研究最廣泛的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,可促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和分化及成人的突觸調(diào)節(jié)〔8〕。BDNF與酪氨酸激酶受體(Trk)B作為調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要通路,參與帕金森病、阿爾茨海默病、抑郁癥、癲癇和慢性疼痛等〔9〕多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。并且,許多證據(jù)表明了BDNF在TBI中發(fā)揮重要作用,如王國(guó)強(qiáng)等〔10〕研究發(fā)現(xiàn),腺病毒介導(dǎo)的 BDNF 基因過(guò)表達(dá)可保護(hù)TBI小鼠的海馬神經(jīng)元;康雅琴等〔11〕發(fā)現(xiàn)異氟醚處理后通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腦組織胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1、BDNF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá)對(duì)新生小鼠缺血缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用,可改善小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能。但是目前還不清楚BDNF-TrkB參與TBI的具體機(jī)制,且是否和突觸丟失存在聯(lián)系亦不清楚。故本實(shí)驗(yàn)擬在TBI中探究BDNF-TrkB信號(hào)通路與突觸功能的關(guān)系,并闡明其對(duì)腦損傷后遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制,為TBI臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料 定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)引物合成于金唯智公司;腺病毒過(guò)表達(dá)/敲低載體由上海吉瑪基因公司制備;原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司;一抗p-磷脂酰激醇-3激酶(PI3K)、PI3K、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、cleaved-半胱天冬蛋白酶(caspased)3、BDNF、TrkB、p-TrKB(Tyr516)、突觸蛋白(SYN)1、SYNA、突觸素(Synaptophysin)、突觸后致密蛋白(PSD)95、二抗抗兔IgG、辣根過(guò)氧化酶(HRP)-相關(guān)抗體、二抗抗鼠IgG、HRP相關(guān)抗體等均購(gòu)自CST;熒光二抗山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor? 488)、山羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor? 594)購(gòu)自Abcam公司。

1.2動(dòng)物分組及模型制備 雄性C57BL/6小鼠240只,8～10周齡,體質(zhì)量(28.0±2.0)g,由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)。分為Sham組、TBI組、TBI_OE_NC組、TBI_OE_BDNF組、TBI_Sh_NC組、TBI_Sh_BDNF組,每組40只。采用控制性皮質(zhì)撞擊(CCI)法〔12〕構(gòu)建TBI小鼠模型。以甲苯噻嗪(10 mg/kg) 和氯胺酮(75 mg/kg)腹腔注射麻醉,麻醉穩(wěn)定后去除小鼠頂部毛發(fā),俯臥位固定于立體定位儀,碘伏消毒頭頂部位,作正中切口,分開(kāi)頭皮剝離骨膜,在右側(cè)冠狀縫和人字縫之間、中線旁2 mm處顱骨鉆開(kāi)直徑為3 mm的骨窗,將小鼠頭部固定于立體定位儀,應(yīng)用CCI打擊儀,設(shè)定參數(shù)為:打擊速度1.5 m/s,深度1.5 mm,停留時(shí)間100 ms。打擊后,還納骨瓣,縫合小鼠頭皮,無(wú)菌棉紗布包扎。手術(shù)完成后將動(dòng)物置于加熱墊上,待其恢復(fù)意識(shí)后,放回籠中。Sham組麻醉后只暴露骨窗,不做打擊。腺病毒注入方式:TBI_OE_NC組和TBI_OE_BDNF組于CCI打擊后立即在骨窗中心處導(dǎo)入10 μl微量注射器針頭,深度3 mm,以1 μl/min的速度分別注入AAV_OE_NC和AAV_OE_BDNF病毒緩沖液3 μl,然后進(jìn)行還納骨瓣,縫合小鼠頭皮,無(wú)菌棉紗布包扎。TBI_Sh_NC組、TBI_Sh_BDNF組麻醉后只暴露骨窗,不做打擊,以同樣的位置和方式分別注射AAV_Sh_NC和AAV_Sh_BDNF病毒緩沖液3 μl。

1.3qPCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,Nanodrop2000測(cè)定RNA的濃度與純度,0.8 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,qPCR體系(20 μl)為1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl、8.2 μl ddH2O。預(yù)變性95 ℃、5 min,94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 1 min,40個(gè)循環(huán)后終延伸完成PCR。內(nèi)參選用β-actin,以2-△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。 引物序列(3′-5′):ACTB正向引物:CAGCACAGAGCCTCGCCTTT,反向:AGACAAGAG-ACCCCGCCGGTT;BDNF正向引物:ATGTGATGCCCTCGGATTATC,反向:GAGGAAGAGTAGCCAAGTGTG;TrkB正向引物:GCACTCACCTCTTCAGAACG,反向:CATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG。

1.4Western印記法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集目標(biāo)小鼠腦部組織,使用冷凍研磨儀進(jìn)行組織勻漿,14 000 r/min離心10 min收集上清即為總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。每組樣品取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,一抗4 ℃過(guò)夜孵育;次日,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次,二抗室溫孵育2 h;PBST洗滌后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液進(jìn)行顯影。

1.5TUNEL法凋亡檢測(cè) 嚴(yán)格參照原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),簡(jiǎn)言之,對(duì)小鼠腦部組織切片進(jìn)行透化,并在37 ℃下與 TUNEL反應(yīng)混合物一起孵育60 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3 min后,將樣品在 0.1%4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)中孵育5 min,然后在 PBS 中洗滌。使用蔡司LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.6免疫熒光檢測(cè) 將腦片放到12孔板,加3%雙氧水封閉10 min,中杉金橋超敏二步法試劑后PBS 洗兩遍,將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈,一抗Synaptophysin(1∶100)、BDNF(1∶200)稀釋,加入稀釋后的一抗,4 ℃過(guò)夜,次日PBS 洗凈兩遍后參照中杉金橋超敏二步法試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。使用蔡司LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.7Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組分別于造模后28 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。將圓形池分為4個(gè)象限。跟蹤攝像機(jī)放置游泳池上方,用于記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。隨機(jī)選擇象限將小鼠面向池壁放入水迷宮,計(jì)算機(jī)跟蹤分析小鼠尋找目標(biāo)平臺(tái)(第一象限中水面下方2 cm處)的潛伏期,定90 s為最長(zhǎng)時(shí)間,若90 s還沒(méi)到達(dá),人為將小鼠置于平臺(tái)20 s,記錄逃避潛伏期為90 s。每只動(dòng)物訓(xùn)練5次/d,每次訓(xùn)練之間間隔10 min,連續(xù)訓(xùn)練5 d。于造模后32 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),最后一次訓(xùn)練結(jié)束后移去平臺(tái),將小鼠面向池壁放在第三象限,計(jì)算機(jī)記錄小鼠90 s內(nèi)的游泳速度及路徑,計(jì)算目標(biāo)象限穿越次數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析,GraphPad8.0軟件繪制相關(guān)圖片。

2 結(jié) 果

2.1BDNF/TrkB在TBI中表達(dá)降低 透射電鏡結(jié)果顯示,與Sham組相比,TBI組神經(jīng)元突觸后致密物厚度(5、7 d)和突觸體密度(3、5、7 d)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。qPCR及Western印跡結(jié)果顯示,TBI組腦組織中BDNF和TrkB mRNA和蛋白水平隨時(shí)間逐漸降低(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)TBI組BDNF/TrkB蛋白表達(dá)

表1 兩組神經(jīng)元突觸后致密物厚度及突觸體密度

表2 TBI組腦組織中BDNF、TrkB相對(duì)mRNA表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)BDNF增加TBI小鼠模型海馬體中突觸數(shù)量 與Sham組比較,TBI_OE_NC組海馬體BDNF表達(dá)顯著減少;而TBI_OE_BDNF組BDNF蛋白表達(dá)水平顯著高于TBI_OE_NC組(P<0.05)。TBI_OE_BDNF組突觸數(shù)量顯著多于TBI_OE_NC組(P<0.05),但與Sham組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。相較于TBI_OE_NC組,TBI_OE_BDNF組腦海馬體組織中TrkB、p-TrkB、SYN1、SYNA、PSD95蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.05),與Sham組水平相當(dāng)(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖2、圖3。

圖2 免疫熒光檢測(cè)各組海馬體中突觸數(shù)量(×200)

1～3:Sham組、TBI_OE_NC組、TBI_OE_BDNF組;圖6同圖3 Western印跡檢測(cè)各組BDNF/TrkB及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 各組突觸數(shù)量、TrkB、p-TrkB、SYN1、SYNA、PSD95蛋白表達(dá)比較

2.3過(guò)表達(dá)BDNF提高TBI小鼠模型遠(yuǎn)期認(rèn)知能力 與Sham組比較,TBI_OE_NC組逃避潛伏期(3、4、5 d)顯著升高,目標(biāo)平臺(tái)駐留時(shí)間、平臺(tái)穿越次數(shù)及游泳速度顯著降低(P<0.05)。與TBI_OE_NC組比較,TBI_OE_BDNF組逃避潛伏期(2、3、4、5 d)顯著降低,目標(biāo)平臺(tái)駐留時(shí)間、平臺(tái)穿越次數(shù)及游泳速度顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 過(guò)表達(dá)BDNF對(duì)各組水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

2.4過(guò)表達(dá)BNDF抑制小鼠海馬體組織細(xì)胞凋亡水平 相較于Sham組〔(2.31±0.13)%〕,TBI_OE_NC組細(xì)胞凋亡水平〔(32.3±3.78)%〕顯著升高;而TBI_OE_BDNF組細(xì)胞凋亡水平〔(9.33±1.53)%〕顯著低于TBI_OE_NC組。見(jiàn)圖4。Western印跡結(jié)果顯示,相較于TBI_OE_NC組,TBI_OE_BDNF組腦海馬體組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05),p-PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),Bax、cleaved-caspased3蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖5。

圖4 TUNEL法檢測(cè)各組海馬組織細(xì)胞凋亡(×400)

圖5 Western印跡檢測(cè)各組PI3K/AKT相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 各組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)比較

2.5敲低BDNF損傷小鼠的遠(yuǎn)期認(rèn)知能力 相較于TBI_Sh_NC組(164.00±13.11),TBI_Sh_BDNF組海馬體中突觸數(shù)量(84.00±13.15)顯著降低(t=7.47,P=0.002)。Morris 水迷宮結(jié)果顯示,相較于TBI_Sh_NC組,TBI_Sh_BDNF組逃避潛伏期(3、4、5 d)顯著增長(zhǎng)(P<0.05),目標(biāo)平臺(tái)駐留時(shí)間、平臺(tái)穿越次數(shù)及游泳速度顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6、表6。

圖6 共聚焦顯微鏡觀察兩組海馬Synaptophysin

表6 敲低BDNF對(duì)兩組水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

3 討 論

TBI是晚年癡呆的危險(xiǎn)因素,關(guān)于TBI的具體機(jī)制,之前的研究大多側(cè)重于神經(jīng)元損傷方面,隨著突觸及其內(nèi)部分子通路研究的增多,越來(lái)越多的證據(jù)表明,突觸在腦部疾病中發(fā)揮重要作用〔13〕。對(duì)發(fā)育、精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的突觸蛋白質(zhì)組和基因組測(cè)序的研究表明〔14～16〕,超過(guò) 130 種腦部疾病是由突觸蛋白突變引起的。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá),可在發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)某些神經(jīng)元群的存活和分化。在成年期,BDNF 可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸強(qiáng)度,并與學(xué)習(xí)和記憶的海馬機(jī)制和疼痛的脊髓機(jī)制有關(guān),是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑,因此被認(rèn)為是理想的腦部疾病藥物靶點(diǎn)。BDNF 與高親和力受體 TrkB 結(jié)合后,受體二聚化、自身磷酸化〔17〕,進(jìn)而促進(jìn)多種細(xì)胞內(nèi)途徑的激活:ras-絲裂原活化蛋白激酶〔18,19〕、磷脂酶 Cγ〔20～22〕、 磷脂酰肌醇 3' 激酶〔23,24〕、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶〔25〕和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化,誘導(dǎo)部分蛋白質(zhì)合成及突觸可塑性,影響學(xué)習(xí)和記憶的形成。本研究發(fā)現(xiàn),BDNF-TrkB信號(hào)通路與TBI后發(fā)生的突觸丟失有著密切聯(lián)系,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),BDNF-TrkB信號(hào)通路對(duì)突觸內(nèi)部蛋白調(diào)控作用及可突觸重塑中的作用。

本研究Morris 水迷宮結(jié)果表明,BDNF對(duì)小鼠海馬體突觸密度及學(xué)習(xí)和記憶能力具有支持作用。突觸丟失的主要原因是PSD中蛋白質(zhì)失調(diào)引起的,而B(niǎo)DNF-TrkB通路可調(diào)控miRNA表達(dá)、局部蛋白質(zhì)合成來(lái)調(diào)控突觸的可塑性。BDNF-TrkB可激活PI3K/Akt 相關(guān)通路發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡和促存活活性,并調(diào)節(jié) N-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDAR) 依賴性突觸可塑性。本研究表明,BDNF過(guò)表達(dá)后可激活下游PI3K/AKT通路,促進(jìn)抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡,保護(hù)突觸功能。