光周期和維生素對巴夫藻生長和物質生產能力的影響

劉 凡，王雨涵，董苗萍，靳翠麗，劉 青，周曉見

（揚州大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

巴夫藻（Pavlovasp.）細胞微小，繁殖速度快，營養(yǎng)物質豐富，是公認的重要營養(yǎng)產品[1-2]。巴夫藻中富含巖藻黃素和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA）。巖藻黃素是最豐富的海洋類胡蘿卜素，由于優(yōu)越的抗氧化性能，在制藥、營養(yǎng)和化妝品行業(yè)具有廣泛應用價值[1-2]。EPA 是一種長鏈n-3 多不飽和脂肪酸，在預防心血管疾病、炎癥、自身免疫性疾病等方面發(fā)揮作用，已成為全球范圍內稀缺的營養(yǎng)物質[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)Pavlovasp.OPMS 30543 中巖藻黃素的含量為8 mg·g-1左右，遠高于作為巖藻黃素主要商業(yè)來源的大型褐藻[5]。而EPA 攝取的主要來源是魚油，魚類中EPA 是通過食用含有EPA 的微藻在體內累積的，而巴夫藻因其能大量合成EPA 而被認為具有替代魚油的潛力[6]。另外，由于Pavlova屬沒有細胞壁，可以直接作為天然食品食用，而無需將細胞內的EPA 提取出來，該優(yōu)勢也有助于培養(yǎng)巴夫藻細胞作為整體食物的商業(yè)化生產進程[7]。

規(guī)?；⒃迮囵B(yǎng)的生長和胞內物質生產受培養(yǎng)體系中的光照和營養(yǎng)條件影響[8]。截至目前，光照條件對巴夫藻影響的研究主要集中在光強度和光質方面，對于光周期的研究比較欠缺[9-11]。而近年來針對其他微藻的研究發(fā)現(xiàn)，光周期不僅可能影響微藻的物質生產、色素組成，還會影響脂肪酸組成和生物柴油質量[12-13]。維生素作為一種微藻依賴的微量有機生長因子，影響微藻的生長速率，細胞大小和葉綠素含量等[14-15]。本研究以巴夫藻（Pavlovasp.）為研究對象，設置不同的光周期和維生素濃度，以雙因素實驗研究光周期和維生素對巴夫藻生長和物質產量的影響，并分析脂肪酸組成以及生物柴油質量的差異，為提高巴夫藻培養(yǎng)效益提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

巴夫藻由中國海洋大學教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室提供。培養(yǎng)基采用鹽度為30 的海水f/2 培養(yǎng)基[9]。

1.2 培養(yǎng)條件和實驗設計

實驗設置3 種維生素濃度1V、4V、8V（1V 為f/2配方中的維生素濃度；4V 和8V 分別是該濃度的4倍和8 倍）；3 種光周期，以24 h 為1 個周期，“光∶暗”分別為8 h∶16 h、16 h∶8 h、24 h∶0 h；共9 種處理，簡記為維生素濃度+光周期，如1V 24 h∶0 h，每個處理3 個重復。250 mL 三角瓶中裝有150 mL 培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期藻種接種，接種后初始660 nm光密度（記作D660，以下相同）在0.03 左右。照度為（65±2）μmol·m-2·s-1，溫度（24±1）℃，培養(yǎng)14 d，每天早晚各搖動2次。

1.3 測定方法

1.3.1 生長情況監(jiān)測和生物量測定 每2 d 取200 μL 藻液于96 孔板中，用酶標儀318-MC 測其D660[16]。培養(yǎng)結束時，用血球計數(shù)板測定最終細胞密度[17]。采用干質量法測定最終的生物量。取120 mL 混合均勻的藻液，以3 700 r·min-1離心10 min，去上清后加入10 mL 純水，震蕩混勻后再次離心去上清，將沉淀轉移至已烘干稱好質量的玻璃瓶中，用冷凍干燥機FreeZone 2.5 plus，-80 ℃真空凍干24 h后稱質量，得到藻粉干質量[9]。

1.3.2 葉綠素a 含量測定 培養(yǎng)結束時，取5 mL 藻液，離心（4 000 r·min-1、10 min）去上清后加5 mL 丙酮4 ℃避光8 h 提取后，次日超聲（700 W，超聲5 s，間隔3 s）10 min、離心，取上清分別于470 nm、644 nm和661 nm處測定光密度，根據以下方程計算色素含量（mg·L-1）[18]。

1.3.3 巖藻黃素含量測定 取凍干后的藻粉，按1∶40（1 g 藻粉溶于40 mL 的無水乙醇）的料液比加入無水乙醇，然后在60 ℃水浴鍋中避光浸提2 h，3 700 r·min-1離心10 min，轉移上清液，重復上述操作至藻粉為灰白色，用分光光度計測定提取的上清液在445 nm 處的光密度，根據公式計算巖藻黃素的含量[4]。

w：巖藻黃素質量分數(shù)（mg·g-1）；D445：巖藻黃素提取液在445 nm 處的光密度值；N：稀釋倍數(shù)；V：粗提取液體積（mL）表示巖藻黃素質量濃度為1 g·L-1時，光徑為1 cm 時的光吸收值；m：藻粉質量（g）。

1.3.4 蛋白質和多糖含量測定 培養(yǎng)結束時，取5 mL 藻液，3 700 r·min-1離心10 min，去上清，加入5 mL去離子水，用超聲波細胞破碎機JY92-IID冰浴超聲破碎（200 W，超聲3 s，間隔2 s）8 min，離心留上清液，用于測定蛋白質和多糖。蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定[19]，多糖含量用苯酚-硫酸法測定[20]。

1.3.5 脂肪提取與脂肪酸組成測定 采用氯仿/甲醇抽提法測定脂肪含量：取20 mg左右凍干后的藻粉，加入0.8 mL 去離子水，1 mL 三氯甲烷，2 mL 甲醇，混合均勻后，冰浴超聲破碎8 min，再加入1 mL三氯甲烷和1 mL去離子水，3 700 r·min-1離心10 min，將氯仿層轉移至烘干稱好質量的玻璃瓶中，常溫氮氣吹干后測其質量[21-22]。

稱取2 mg 脂肪，加入1 mL 正己烷，超聲10 min，加入0.2 mL 的KOH 甲醇溶液（11 g KOH 溶于100 mL 甲醇），超聲處理10 min，加入0.125 g 無水硫酸鈉，靜置后取上層，用0.22 μm 的膜過濾，轉移至進樣瓶中用于GC-MS分析[22]。

GC-MS 分析：采用Thermo Scientific ITO900 GC-MS 系統(tǒng)，色譜柱為TR-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm），載氣為He2（99.999%），流速0.8 mL·min-1，樣品以不分流形式注入，進樣口溫度230 ℃，進樣量1 μL。程序升溫：120 ℃恒溫1 min，然后以3 ℃·min-1升至240 ℃，保持10 min。離子源溫度為220 ℃。溶劑延遲4 min，采用全掃描質譜模式，范圍在50～800 amu，耗時0.68 s。然后對各峰型進行脂肪酸甲酯的鑒定[22]。

1.3.6 生物柴油性能分析 由巴夫藻的脂肪酸組成，根據公式計算生物柴油的皂化值（SV）、碘值（IV）、十六烷值（CN）、不飽和度（DU）、長鏈不飽和因子（LCSF）、冷濾點（CFPP）[23]。

1.4 數(shù)據分析

本次實驗每處理設置3 個重復，對獲得各數(shù)據使用IBM SPSS 23軟件分析，選用一般線性模型、單因素分析和全模型對光周期、維生素濃度和二者的交互效應進行分析。利用Duncan 法對方差分析結果顯著的因素進行多重比較。各分析指標以P＜0.05 作為判斷標準，并以不同字母表示比較組內差異的顯著性[24]。

2 結果

2.1 光周期和維生素對巴夫藻生長的影響

在培養(yǎng)的14 d 內，巴夫藻在3 種光周期和3 個維生素濃度組成的9 種處理下都能生長（圖1(a)）。2 d后，1V 8 h∶16 h、4V 8 h∶16 h和8V 8 h∶16 h 三個處理的生長速度低于其他處理，其D660一直低于其他組，但這三個組之間差別不大（P＞0.05）。其余各組中，24 h∶0 h 的3 個組培養(yǎng)8 d 后，D660比16 h∶8 h組略低。從培養(yǎng)結束收獲的細胞密度看，細胞密度受光周期顯著影響（P＜0.05），而維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對細胞密度影響不大（P＞0.05）（圖1(b)、表1）。在3 個維生素濃度下，8 h∶16 h 光周期處理的細胞密度都顯著低于其他2個光周期，而16 h∶8 h 和24 h∶0 h 兩個光周期的細胞密度差別不大，其中1V 16 h∶8 h處理的細胞密度為52.19×106mL-1,顯著高于1V 8 h∶16 h 的45.98×106mL-1和1V 24 h∶0 h的49.58×106mL-1。因此，巴夫藻生長主要受光周期影響，短周期8 h∶16 h 不利于巴夫藻生長，長周期16 h∶8 h 和24 h∶0 h 尤其是16 h∶8 h有利于巴夫藻生長。

表1 光周期和維生素濃度對巴夫藻的影響雙因素方差分析Table 1 Two-factor ANOVA analysis of effects of photoperiod and vitamin concentration on Pavlova sp.

圖1 光周期和維生素對巴夫藻生長和收獲時細胞密度的影響Fig.1 Effects of photoperiod and vitamin concentration on growth and cell density of Pavlova sp.

2.2 光周期和維生素對巴夫藻生產能力的影響

由表1 可知，光周期對多糖以外的所有物質產量都有顯著影響（P＜0.05），而維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對生物量干質量和巖藻黃素產量有顯著影響（P＜0.05）。

圖2（a）表示巴夫藻培養(yǎng)14 d 后收獲的生物量干質量情況。雙因素方差分析結果表明，光周期、維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用都對干質量有顯著影響（表1）。在3 種維生素濃度下，24 h∶0 h的干質量在3個光周期處理中都是最小的，其次是8 h∶16 h光周期，16 h∶8 h光周期的干質量是3個光周期中最高的，在3個維生素濃度下分別達到501.50、500.90、497.57 mg·L-1，因此16 h∶8 h 是生物量干質量生產的最佳光周期。在8 h∶16 h 光周期下，維生素濃度升高時干質量降低，從1V 維生素濃度時的450.60 mg·L-1，至8V 維生素濃度時干質量降到最低值419.37 mg·L-1。在16 h∶8 h 光周期下，干質量不隨維生素濃度發(fā)生變化，當光周期為24 h∶0 h 時，也是8V 維生素濃度的干質量最低，只有361.80 mg·L-1。因此，1V 是最佳的維生素濃度，而1V 16 h∶8 h 的干質量又比1V 24 h∶0 h 提高了38.6%，所以生物量干質量生產的最佳條件是1V 16 h∶8 h。

如圖2（b）所示，葉綠素a 含量既受維生素濃度影響，又受光周期影響。“光周期×維生素濃度”交互作用對葉綠素a 含量影響不顯著（表1）。維生素濃度為1V 時，隨光照時間延長，葉綠素a含量增高，最高1.18 mg·L-1出現(xiàn)在1V 24 h∶0 h。而在維生素濃度為4V 和8V 時，16 h∶8 h 光周期下的葉綠素a含量普遍高于8 h∶16 h 光周期下的含量，也高于24 h∶0 h 光周期下的葉綠素a 含量。光周期對葉綠素a含量的影響在維生素為8V時表現(xiàn)突出，16 h∶8 h光周期下葉綠素a 含量高，最高0.10 mg·L-1出現(xiàn)在8V 16 h∶8 h。

光周期、維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對巖藻黃素生產影響顯著（表1）。如圖2（c）所示，在3種維生素濃度下，24 h∶0 h的巖藻黃素含量在3 個光周期中都是最小的，為2.7～3.0 mg·g-1，其次是16 h∶8 h 光周期，含量為3.8～4.2 mg·g-1，8 h∶16 h 光周期的巖藻黃素是3 個光周期中最高的，為5.5～6.2 mg·g-1，因此8 h∶16 h 是巖藻黃素積累的最佳光周期。巖藻黃素產量取決于生物量干質量和巖藻黃素含量，由于8 h∶16 h 光周期下巖藻黃素含量最高，24 h∶0 h 光周期下巖藻黃素最低，巖藻黃素產量同樣也是這樣的規(guī)律（圖2(d)）。在24 h∶0 h 光周期下巖藻黃素產量受維生素濃度影響不顯著（P＞0.05），但在8 h∶16 h 和16 h∶8 h 兩個光周期下，維生素濃度為8V 時的巖藻黃素產量都比維生素濃度為1V 和4V 時高，因此8V 是巖藻黃素生產的最佳維生素濃度。8V 8 h∶16 h 的巖藻黃素產量達到2.60 mg·L-1，是所有處理中最高值，是1V 24 h∶0 h 的2.08倍。因此，巖藻黃素生產的最佳條件是8V 8 h∶16 h。

在脂肪生產方面，雙因素方差分析結果表明，光周期對脂肪占比和脂肪產量有顯著影響（P＜0.05），維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對脂肪占比和脂肪產量影響不大（P＞0.05）（表1）。如圖2（e）所示，在3 種維生素濃度下，24 h∶0 h 的脂肪占比均優(yōu)于其他光周期，最高值為8V 24 h∶0 h，脂肪占比達到30.18%；16 h∶8 h 光周期的脂肪占比也比較高，而8 h∶16 h 光周期的脂肪占比最低。而脂肪產量的高低取決于生物量干質量和脂肪占比的乘積。如圖2（f）所示，在3 種維生素濃度下，8 h∶16 h光周期的脂肪產量在3 個光周期中都是最低的，16 h∶8 h 和24 h∶0 h 兩個光周期下的脂肪產量差別不顯著，但在維生素濃度為8V 時，16 h∶8 h 的脂肪產量顯著高于24 h∶0 h，達到123.87 mg·L-1，是所有處理中的最高值。

雙因素方差分析結果表明，光周期顯著影響蛋白質產量（P＜0.05），維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對蛋白質產量影響不大（P＞0.05）（表1）。如圖2（g）所示，在維生素濃度1V 和4V時，16 h∶8 h 的蛋白質產量均顯著高于其他兩個光周期（P＜0.05）。1V 16 h∶8 h 的蛋白質產量達55.54 mg·L-1，是所有處理中的最高值，比1V 24 h∶0 h提高了30.8%。

巴夫藻多糖產量在17～27 mg·L-1之間，雙因素方差分析結果表明，光周期、維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對多糖產量影響都不顯著（P＞0.05）（表1，圖2(h)）。

2.3 光周期和維生素對巴夫藻脂肪酸組成和生物柴油質量的影響

巴夫藻主要含6種脂肪酸（表2），其中飽和脂肪酸有C14:0、C16:0和C18:0，不飽和脂肪酸有C16:1(n-7)、C18:1(n-9)和C20:5(n-3)（EPA）。含量最高的脂肪酸為C16:0，在總脂肪酸中的質量占比為36%～41%之間；其次是C16:1(n-7)，占比在32%～35%之間；排在第三位的是占比在11%～13%之間的C18:1(n-9)；EPA 作為唯一的多不飽和脂肪酸，占比在5%～15%之間。C14:0 和C18:0 兩種飽和脂肪酸的占比之和不超過6%。雙因素方差分析結果表明，光周期對巴夫藻6 種脂肪酸占比都有顯著影響，維生素濃度對脂肪酸組成影響不大，“光周期×維生素濃度”交互作用只對脂肪酸C14:0占比有顯著影響（表3）。

表2 光周期和維生素濃度對巴夫藻脂肪酸組成的影響Table 2 Effects of photoperiod and vitamin concentration on fatty acid composition of Pavlova sp.%

表3 光周期和維生素濃度對巴夫藻脂肪酸組成的影響雙因素方差分析Table 3 Two-factor ANOVA analysis of photoperiod and vitamin concentration on fatty acid composition of Pavlova sp.

如表2所示，含量最高的飽和脂肪酸C16:0的含量受光周期顯著影響，在3種維生素濃度下，24 h∶0 h的C16:0平均占比為40.66%，顯著高于其他兩個光周期。C16:1(n-7)的含量也受光周期的顯著影響，在3種維生素濃度下，24 h∶0 h和16 h∶8 h光周期下的占比顯著高于8 h∶16 h。在8V維生素濃度下，16 h∶8 h的C18:1(n-9)占比顯著高于8 h∶16 h，但在3 個光周期下變動范圍不足2%。在3 種維生素濃度下，EPA含量都符合8 h∶16 h＞16 h∶8 h＞24 h∶0 h的規(guī)律，且差異顯著，即在8 h∶16 h光周期下最適合EPA積累。1V 8 h∶16 h 的EPA 占比為15.46%，是1V 24 h∶0 h的EPA 占比的2.28 倍。C18:0 含量符合24 h∶0 h＞16 h∶8 h＞8 h∶16 h 的規(guī)律，且差異顯著。光周期對C14:0 占比有顯著影響（P＜0.05），維生素濃度對其占比無顯著影響（P＞0.05），“光周期×維生素濃度”交互作用對其占比有顯著影響（P＜0.05）。

雙因素方差分析結果表明，光周期顯著影響巴夫藻脂質生產的生物柴油性能各指標，維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對生物柴油性能影響不大（表4）。

表4 光周期和維生素濃度對巴夫藻脂質的生物柴油性能的影響雙因素方差分析Table 4 Two-factor ANOVA analysis of effects of photoperiod and vitamin concentration on the biodiesel performance of lipid derived from Pavlova sp.

巴夫藻脂質的生物柴油各指標見表5。生物柴油特性如十六烷值（CN）、運動黏度、氧化穩(wěn)定性等，取決于原料微藻生物柴油生產過程中使用的脂肪酸。不同光周期和維生素濃度條件下培養(yǎng)的巴夫藻生物柴油的CN 值有明顯區(qū)別，CN 值最低為44.55，出現(xiàn)在8 h∶16 h 光周期下，該光周期下的CN值顯著低于其他兩個光周期。而CN 值最高值為53.98，出現(xiàn)在24 h∶0 h 光周期，該光周期下的CN 值普遍高于其他兩個光周期。不飽和度（DU）和碘值（IV）通常用來評價生物柴油的氧化穩(wěn)定性，二者的趨勢往往是一致的，都是其值越低，生物柴油的氧化穩(wěn)定性越高[23]。DU 和IV 的值都符合24 h∶0 h ＜16 h∶8 h ＜8 h∶16 h的規(guī)律，最低值出現(xiàn)在24 h∶0 h光周期，其次是16 h∶8 h光周期，而DU和IV最高值出現(xiàn)在8 h∶16 h。冷濾點（CFPP）通常用于預測生物柴油在低溫下的流動性能[23]。在9 種組合培養(yǎng)條件下的巴夫藻CFPP 都低于5 ℃，其中冷濾點最低值為-0.41 ℃，出現(xiàn)在8 h∶16 h 光周期下，該光周期下的CFPP 值顯著低于其他兩個光周期。16 h∶8 h光周期下CFPP 略高，最高值出現(xiàn)在24 h∶0 h 光周期。4V 24 h∶0 h 條件下生產的巴夫藻生物柴油CN值最高，DU 和IV 最低即氧化穩(wěn)定性最好，但冷濾點略高即低溫流動性相對差一些。

表5 光周期和維生素濃度對巴夫藻脂質的生物柴油性能的影響Table 5 Effects of photoperiod and vitamin concentration on the biodiesel performance of lipid derived from Pavlova sp.

3 討論

3.1 光周期和維生素對巴夫藻生長和生物量積累的影響

微藻光合過程強烈依賴培養(yǎng)體系的光相關變量[13,22]。光合代謝由光期和暗期組成，光期產生的化學能用于暗期碳固定途徑[25,12-13]。研究者們普遍認為光合過程需要光暗反應匹配才能高效形成光合產物[25,13,22]。適當?shù)墓?暗周期可提高光合系統(tǒng)的電子轉移速度，并且在規(guī)?；囵B(yǎng)中有助于調節(jié)微藻培養(yǎng)物的溫度、降低設備運行的能源消耗[12-13,22]。本研究中，生產眾多優(yōu)質物質的巴夫藻，無論在生長還是物質生產能力方面都表現(xiàn)出明顯的光周期效應。16 h∶8 h 處理組在生長方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，培養(yǎng)14 d 結束時得到了最高的細胞密度、干質量、脂肪產量和蛋白質產量，而連續(xù)光照在生長和物質產量方面并沒有優(yōu)勢。實際上，海洋浮游植物對光周期的響應具有很大的物種特異性。已有研究表明，赫氏圓石藻（Emiliania huxleyi）、細孔圓顆石藻（Cyclococcolithus leptoporus）、布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）和斜生四鏈藻（Tetradesmus obliquus）在連續(xù)光照下生長較快，而球等鞭金藻（Isochrysis galbana)、金色藻（Chrysochromulinasp.）和遠洋顆石藻（Coccolithus pelagicus）在連續(xù)光照下生長較差或完全不生長[34-35]；兩株顆石藻(Coccolithus)在14∶10光周期下生長較快，結合新綠藻（Neochloris conjuncta），陸生新綠藻（N.terrestris），德克薩斯新綠藻（N.texensis）在12 h∶12 h 光周期下生長更好，還有的微藻的生長速度受光周期的影響不顯著[27]。造成微藻對光周期響應有差異的原因，可能與藻種的敏感性有關，與藻種自然分布的區(qū)域有關，還可能與微藻的細胞組成有關[26]。四列藻（Tetraselmis tetrathele）在光期為6～20 h 之間時藻細胞密度、葉綠素a和蛋白質含量等指標均達到較高水平，但在光期少于4 h 和超過20 h 時，則生長受到明顯抑制[28]。因此，從種間特異性上看，巴夫藻應屬于中長光照種類，光周期16 h∶8 h較適合巴夫藻生長，并生產較大生物量干質量。維生素供給在微藻規(guī)模培養(yǎng)中起著至關重要作用，然而，關于這些微量營養(yǎng)素對微藻生長、多樣性和生產力的影響的資料很少[14-15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，維生素濃度對于巴夫藻生物量干質量有影響，當維生素濃度為1V 時，能獲得最高的生物量干質量，而且維生素與光周期有交互作用，在1V 和長光照的16 h∶8 h光周期條件下，能使生物量干質量達到最高。

3.2 光周期和維生素對巴夫藻巖藻黃素生產的影響

本研究使用的巴夫藻能產生大量的巖藻黃素，質量分數(shù)可達6.21 mg·g-1，產量能達到2.60 mg·L-1。這與Kanamoto 等[5]篩選得到的最優(yōu)巴夫藻株Pavlovasp.OPMS 30543 在f/2 培養(yǎng)基中獲得的巖藻黃素質量分數(shù)1.48 mg·g-1、產量0.73 mg·L-1相比，分別是其4.20 倍和3.56 倍。造成這兩株巴夫藻產量差距的原因，可能與培養(yǎng)時長不同有關，分別是14 d 和7 d，有可能Pavlovasp.OPMS 30543 巖藻黃素的積累還不夠充分；還與光周期不同有關，分別是8 h∶16 h 和12 h∶12 h，本研究已證明短光照有利于巖藻黃素積累；還與維生素濃度相關，分別是8倍和1 倍濃度，而高濃度維生素有利于巖藻黃素積累；藻株本身的差異也至關重要。因此，本研究的巴夫藻是生產巖藻黃素的優(yōu)質藻株。因為巖藻黃素能夠捕獲光能并保護光合器官，光照條件被認為是影響微藻合成巖藻黃素的最重要因素[25]。然而，光照條件對于巖藻黃素積累的影響研究主要集中在光強和光質方面[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，光周期對巴夫藻的色素組成包括葉綠素a和巖藻黃素含量均有顯著影響。維生素濃度為1V 時，24 h∶0 h 時葉綠素a含量最高；但是當維生素濃度升高時，16 h∶8 h 光周期下葉綠素a 含量最高。巖藻黃素和葉綠素a 共同組成光捕獲復合物，但二者的化學結構不同，吸收的光譜不同，前者吸收藍光和綠光，后者吸收紅光和藍光[29]。巖藻黃素與葉綠素a 對光周期的反應也不同，始終是光照時間最短的8 h∶16 h 光周期下含量最高。維生素濃度對于巴夫藻的巖藻黃素積累有影響，提高維生素濃度至8V 時，能提高巖藻黃素含量。而且維生素與光周期有交互作用，在8V 和短光照的8 h∶16 h 光周期條件下，能使巖藻黃素含量達到最高。因此，8V 8 h∶16 h 是巖藻黃素積累的最佳條件。

3.3 光周期和維生素對巴夫藻脂肪酸組成和生物柴油質量的影響

光周期調控能提高巴夫藻的脂質產量并對脂肪酸組成和生物柴油質量產生影響。巴夫藻脂質含量在光周期24 h∶0 h下最高，能達到30.18%；脂質產量在8V 16 h∶8 h獲得最大值，達到123.87 mg·L-1。巴夫藻中含量最豐富的兩種脂肪酸C16:0 和C16:1(n-7)，在24 h∶0 h光周期下含量都是最高值。脂肪酸組成的變動引起生物柴油質量的變化，高含量的飽和脂肪酸（SFA）導致CN的增加，充足的單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著改善低溫下的流動性能[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，巴夫藻的SFA+MUFA 占總脂肪酸質量分數(shù)為80%～90%，是優(yōu)質的生物柴油燃料生產的原料[30-31]。生物柴油指標中，CN 值越高，生物柴油的點火性能越好，發(fā)動機性能越好[18,31]。歐洲標準EN 14214 和ASTM 美國標準D6751 的生物柴油參考標準分別為CN ＞51 和CN ＞47[18]。反映生物柴油氧化穩(wěn)定性的DU 和IV，均基于單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的比例，DU 和IV 越低則氧化穩(wěn)定性越好[23,32]。本研究中，4V 24 h∶0 h 條件下生產的巴夫藻生物柴油，CN 值最高可達53.98，其CN 值大于51，優(yōu)于歐洲標準EN 14214 和ASTM 美國標準D6751，說明該條件下生產的巴夫藻可以作為生物柴油的直接原料，同時其DU 和IV 最低，即氧化穩(wěn)定性也是最優(yōu)的。另外，大量研究表明Pavlovasp.還可以產生大量的C20:5(n-3)（EPA）[3,6,33]。本研究結果發(fā)現(xiàn)巴夫藻脂肪酸主要由16:0、C16:1(n-7)組成，并含有大量的C20:5(n-3)，這與燕燕等[33]報道的綠色巴夫藻的脂肪酸組成相似。而且光周期會影響EPA 的積累，在8 h∶16 h 光周期下最適合積累EPA，在脂肪酸中占比最高能達到15.46%。與光周期相比，維生素濃度對于巴夫藻的脂肪生產影響不大，脂質含量、脂肪酸組成及EPA 含量均不受維生素濃度影響。

綜上所述，巴夫藻作為巖藻黃素、EPA和優(yōu)質生物柴油的生產者，在規(guī)?；囵B(yǎng)中根據產品應用要求，通過合理調控光周期和維生素濃度，可進一步提高其物質生產效率和產品品質。