丁香酚對褐菖鲉的麻醉效果

陳欣怡，王好學(xué)，徐開達(dá)，李鵬飛，周永東

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所/2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)村農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)漁場漁業(yè)資源科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022）

褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）隸屬硬骨魚綱（Osteichthyes）鲉科（Scorpaenidae）菖鲉屬（Sebastiscus），俗稱石頭鱸、石九公等[1]，其營養(yǎng)價(jià)值豐富，是沿海重要的經(jīng)濟(jì)魚種[2-3]。近年來由于人類過度捕撈，褐菖鲉資源衰退嚴(yán)重，為補(bǔ)充其資源量，相關(guān)部門已連續(xù)多年開展增殖放流活動(dòng)[4]，有研究表明增殖放流過程中標(biāo)志、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)可能引發(fā)魚體應(yīng)激造成損耗[5]，且褐菖鲉受到外部刺激時(shí)背部硬鰭條會豎起展開，容易使操作人員受傷，不利于相關(guān)生產(chǎn)活動(dòng)和實(shí)驗(yàn)操作開展。楊州等[6-7]指出合理使用麻醉劑可以抑制麻醉對象中樞神經(jīng)，使其在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)入低消耗休眠狀態(tài)，從而在受外界刺激時(shí)減少應(yīng)激反應(yīng)，降低損傷及致死危害，有利于提高魚苗放流的成活率。因此，研究麻醉劑對褐菖鲉的麻醉效果有重要實(shí)際意義。

目前魚用麻醉劑有包括丁香酚、MS-222、苯唑卡因等十幾種[8-9]，其中丁香酚不僅價(jià)廉易得，而且麻醉效率較高，其代謝物能夠快速從血液和組織中排出，不會對海洋生物和人體造成毒害影響[10]，在牙科醫(yī)學(xué)鎮(zhèn)痛及水產(chǎn)動(dòng)物麻醉方面應(yīng)用廣泛[11-12]。丁香酚用于各類魚種的麻醉研究已見諸多報(bào)道，包括大黃魚（Larimichthys crocea）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、大口黑鱸（Micropterus salmoides）、刀鱭（Coilia nasus）、暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）等30 多種[13-23]，上述研究發(fā)現(xiàn)麻醉不同魚種適用的丁香酚質(zhì)量濃度存在較大差異，且丁香酚對褐菖鲉的麻醉效果未見報(bào)道，因此本研究開展褐菖鲉在不同濃度丁香酚作用下的麻醉復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)以及麻醉后不同空氣暴露時(shí)長的影響實(shí)驗(yàn)，以期為進(jìn)一步優(yōu)化褐菖鲉標(biāo)志放流技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

使用樣品為浙江省舟山市西軒漁業(yè)科技島培育的褐菖鲉苗種，體長（88.12 ± 4.87）mm，體質(zhì)量（19.58 ± 3.30）g，實(shí)驗(yàn)用魚達(dá)到標(biāo)志放流標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格[24]，魚體健康，體質(zhì)強(qiáng)健。實(shí)驗(yàn)前15 d分別暫養(yǎng)于15 個(gè)200 L 白色圓形養(yǎng)殖桶，每日上午8 點(diǎn)及下午5 點(diǎn)喂食，實(shí)驗(yàn)前2 d停止投喂。實(shí)驗(yàn)所用為自然海水，海水溫度為（15.7 ± 0.5）℃，經(jīng)過濾處理引入養(yǎng)殖桶。麻醉劑為常熟尚齒齒科材料有限公司生產(chǎn)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%丁香酚，淡黃色油狀液體，難溶于水，需無水乙醇助溶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麻醉劑配制 以丁香酚、無水乙醇按體積比1∶9 的配制母液，隨配隨用。實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)所需濃度在20 L的潔凈塑料盆中用海水稀釋母液。

1.2.2 麻醉/復(fù)蘇階段及行為特征 褐菖鲉麻醉及復(fù)蘇過程參考彭寧東等[25]和劉長琳等[26-27]研究結(jié)果，將麻醉階段分為Ⅰ-Ⅵ期（表1），復(fù)蘇階段分為Ⅰ-Ⅳ期（表2）。在不同質(zhì)量濃度丁香酚溶液中分別浸浴2 尾實(shí)驗(yàn)魚，選擇麻醉行為分期較明顯的質(zhì)量濃度50 mg/L 進(jìn)行褐菖鲉行為特征觀察，實(shí)驗(yàn)魚每組6尾，設(shè)3組平行，一半觀察至Ⅵ期麻醉（魚體死亡），一半達(dá)到Ⅳ期麻醉后立即從丁香酚溶液轉(zhuǎn)移至自然海水復(fù)蘇，重復(fù)3 次，觀察并對褐菖鲉麻醉/復(fù)蘇各階段進(jìn)行行為特征描述（表1、表2），并以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)判斷麻醉與復(fù)蘇階段的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 褐菖鲉麻醉過程分期及行為特征Table 1 Anesthesia stage and behavior characteristics of Sebastiscus marmoratus

表2 褐菖鲉復(fù)蘇過程分期及行為特征Table 2 Stages and behavioral characteristics of recovery process of Sebastiscus marmoratus

1.2.3 最終麻醉程度 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150和180 mg/L 共12 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，各梯度實(shí)驗(yàn)用魚5 尾，設(shè)置3 組平行組，因低質(zhì)量濃度麻醉劑褐菖鲉入麻時(shí)間較長，由此設(shè)定最長浸浴時(shí)間為30 min，并在3、5、10、15、20 和30 min 時(shí)觀測記錄各質(zhì)量濃度下褐菖鲉的麻醉程度。結(jié)果表明丁香酚質(zhì)量濃度低于30 mg/L時(shí)褐菖鲉不能在3 min 內(nèi)入麻，質(zhì)量濃度在50～180 mg/L 時(shí)，30 min 內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的死亡情況。

1.2.4 麻醉、復(fù)蘇時(shí)間測定 預(yù)實(shí)驗(yàn)得出各質(zhì)量濃度組褐菖鲉全部麻醉至多需要4.4 min，全部復(fù)蘇至少需要6.9 min，綜合考慮褐菖鲉復(fù)蘇時(shí)間較其他魚種更長的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定3 min 內(nèi)麻醉，7 min 內(nèi)蘇醒，麻醉15 min 后存活率100%為有效麻醉濃度。結(jié)合實(shí)驗(yàn)1.2.3 的結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)[28]，選取30、40、50、60、70、80 mg/L 共6 個(gè)質(zhì)量濃度的丁香酚溶液分別測定褐菖鲉入麻與復(fù)蘇所需的時(shí)間，各組實(shí)驗(yàn)用魚12尾，設(shè)置3個(gè)平行組。

1.2.5 空氣暴露時(shí)長對褐菖鲉復(fù)蘇的影響 對比上述實(shí)驗(yàn)中褐菖鲉的麻醉/復(fù)蘇時(shí)間，選定麻醉劑質(zhì)量濃度為40 mg/L，以此設(shè)計(jì)空氣暴露實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)得出致死空氣暴露時(shí)間為（49.9 ± 8.1）min，因此設(shè)最長空氣暴露時(shí)間為60 min，實(shí)驗(yàn)魚在40 mg/L 丁香酚溶液中浸浴至Ⅳ期麻醉后撈出置于濕潤毛巾，再覆蓋一層濕毛巾僅使頭部暴露在空氣中。各實(shí)驗(yàn)組分別暴露3、5、10、15、20、30、45、60 min 后放入自然海水觀察復(fù)蘇情況并記錄完全復(fù)蘇所需時(shí)間，另設(shè)置一組實(shí)驗(yàn)魚在進(jìn)入Ⅳ期麻醉后空氣暴露至無生命體征，記錄致死時(shí)間。復(fù)蘇時(shí)間以褐菖鲉出現(xiàn)復(fù)蘇特征（平衡恢復(fù)期）的時(shí)間判斷蘇醒狀況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，復(fù)蘇率為完全復(fù)蘇個(gè)體占實(shí)驗(yàn)個(gè)體總數(shù)的比例。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2016、Origin Pro 2021 和SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及多重比較，描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，顯著性水平α為0.05（差異顯著）和0.01（差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 30 min內(nèi)不同質(zhì)量濃度丁香酚溶液下褐菖鲉的最終麻醉程度

由圖1可知，浸浴時(shí)長為30 min時(shí)，所有組別均能達(dá)到Ⅳ期（麻醉狀態(tài)），10～40 mg/L 最終麻醉程度為Ⅴ期深度麻醉，50 mg/L 及以上質(zhì)量濃度最終麻醉程度能達(dá)到Ⅵ期（魚體死亡）且均為部分實(shí)驗(yàn)魚為Ⅴ期，部分實(shí)驗(yàn)魚為Ⅵ期，其中10、20 mg/L 組部分實(shí)驗(yàn)魚為Ⅳ期，部分實(shí)驗(yàn)魚為Ⅴ期，30 和40 mg/L 組全部實(shí)驗(yàn)魚為Ⅴ期深度麻醉，麻醉程度高的實(shí)驗(yàn)魚占比基本隨麻醉劑濃度升高而增大。

一定質(zhì)量濃度的丁香酚溶液中，浸浴時(shí)間越久麻醉程度越高，致死概率越大。麻醉5 min 內(nèi)僅有180 mg/L 組出現(xiàn)少部分死亡，麻醉30 min 時(shí)50～180 mg/L均出現(xiàn)不同程度死亡，其中120～180 mg/L丁香酚溶液中浸浴30 min 死亡率高達(dá)90%。由結(jié)果得出，若需在短時(shí)間內(nèi)麻醉褐菖鲉可選擇40～150 mg/L 的丁香酚溶液；若需褐菖鲉較長時(shí)間保持麻醉狀態(tài)可選擇10～40 mg/L 的丁香酚溶液，麻醉時(shí)間控制在30 min之內(nèi)較為合適。

2.2 麻醉、復(fù)蘇時(shí)間及有效質(zhì)量濃度的確定

由圖2 可知，褐菖鲉麻醉所需時(shí)間隨丁香酚質(zhì)量濃度上升基本呈減少趨勢，質(zhì)量濃度在40 mg/L時(shí)麻醉所需時(shí)間明顯減少，30 mg/L組麻醉所需時(shí)間與其余組差異極顯著（P＜0.01），40 mg/L 組與60～80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05），50 mg/L 組與70～80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05）；丁香酚質(zhì)量濃度在30～40 mg/L 時(shí)，褐菖鲉復(fù)蘇所需時(shí)間隨丁香酚質(zhì)量濃度上升基本呈減少趨勢，質(zhì)量濃度40～70 mg/L 之間，復(fù)蘇時(shí)間基本呈增加趨勢，質(zhì)量濃度在40 mg/L 和80 mg/L 時(shí)，復(fù)蘇時(shí)間明顯減少，分析得出：40 mg/L 組復(fù)蘇時(shí)間與60～80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05），50 mg/L 與80 mg/L 組差異顯著（P＜0.05），70 mg/L 組復(fù)蘇時(shí)間與其余組差異極顯著（P＜0.01）。

30 mg/L 丁香酚溶液用于麻醉褐菖鲉濃度偏低，無法使其在1.2.4設(shè)定的有效麻醉濃度判定標(biāo)準(zhǔn)（3 min）內(nèi)全部進(jìn)入Ⅳ期麻醉，在30、60～80 mg/L丁香酚溶液中，褐菖鲉無法在7 min 內(nèi)全部復(fù)蘇，且由2.1 可知，只有當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度小于60 mg/L時(shí)，褐菖鲉在麻醉劑中浸浴15 min 后沒有出現(xiàn)死亡，成活率達(dá)到100%，因此，丁香酚麻醉褐菖鲉的適宜濃度范圍為40～50 mg/L。

2.3 空氣暴露時(shí)長對褐菖鲉復(fù)蘇的影響

根據(jù)2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取40 mg/L 的麻醉濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，褐菖鲉在該質(zhì)量濃度丁香酚溶液中浸?。?.90 ± 0.46）min 均能進(jìn)入Ⅳ期麻醉。由圖3 可知：褐菖鲉空氣暴露后復(fù)蘇率自20 min 起呈下降趨勢，空氣暴露30 min 時(shí)，復(fù)蘇率為87.5%；空氣暴露45 min 存活率為83.3%；空氣暴露60 min，實(shí)驗(yàn)魚全部死亡?？諝獗┞?～20 min 內(nèi)，各組復(fù)蘇時(shí)間差異不顯著（P＞0.05），空氣暴露30 min 與5～20 min 組復(fù)蘇時(shí)間差異顯著（P＜0.05），空氣暴露45 min與其余組差異均顯著（P＜0.05）；空氣暴露時(shí)間在15 min以內(nèi)，平均復(fù)蘇時(shí)間隨空氣暴露時(shí)間延長而縮短，最快入水3 s 即可正常游動(dòng)；空氣暴露15～45 min 時(shí)，平均復(fù)蘇時(shí)間隨空氣暴露時(shí)間延長逐步增加，且復(fù)蘇率逐步降低，觀測到最長復(fù)蘇時(shí)間為13.54 min。根據(jù)平均復(fù)蘇時(shí)間變化趨勢推測，空氣暴露15 min 時(shí)褐菖鲉可將麻醉劑基本代謝從而逐漸復(fù)蘇，因此今后若需進(jìn)行離水操作研究，建議將操作時(shí)間控制在15 min 以內(nèi)，避免褐菖鲉應(yīng)激造成損害。

圖3 空氣暴露時(shí)間對褐菖鲉復(fù)蘇時(shí)間及復(fù)蘇率的影響Fig.3 The effect of air exposure time on recovery time and recovery rate of Sebastiscus marmoratus

3 討論

3.1 丁香酚對褐菖鲉的麻醉效果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1和圖2）可以看出，丁香酚質(zhì)量濃度在50 mg/L 時(shí)，褐菖鲉最終麻醉程度能達(dá)到Ⅵ期麻醉，且麻醉時(shí)間隨麻醉劑質(zhì)量濃度逐漸增加而逐漸縮短，復(fù)蘇時(shí)間基本隨麻醉劑質(zhì)量濃度逐漸增加而逐漸增加，這與其他魚類研究結(jié)果相一致[29-30]。但出現(xiàn)質(zhì)量濃度30 mg/L 組實(shí)驗(yàn)魚復(fù)蘇時(shí)間長于40 mg/L組，70 mg/L組實(shí)驗(yàn)魚復(fù)蘇時(shí)間長于80 mg/L組的情況。金元等[31]指出麻醉時(shí)間過長會導(dǎo)致魚體吸收麻醉劑含量超出可承受臨界值而出現(xiàn)毒性致死現(xiàn)象，而麻醉劑質(zhì)量濃度過低時(shí)需耗費(fèi)更長時(shí)間進(jìn)入麻醉狀態(tài)使得更多麻醉劑進(jìn)入魚體各組織，因此30 mg/L 質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)魚需要耗費(fèi)比40 mg/L 組更長時(shí)間代謝麻醉劑，同理80 mg/L 組由于濃度高，實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)入麻醉耗費(fèi)時(shí)間少，吸收的麻醉劑劑量少，因此恢復(fù)得更快。通常來說，麻醉時(shí)間越長麻醉濃度越大，魚體出現(xiàn)死亡可能性越大，但圖1中部分組別如10 min 時(shí)的80、90 mg/L 組，20 min 時(shí)的70、90、120 mg/L 組，30 min 時(shí)的60、90 mg/L 組出現(xiàn)死亡率低于相鄰濃度組，推測其原因?yàn)閷?shí)驗(yàn)魚個(gè)體差異，因此盡量選擇體格相似的同批魚苗以控制實(shí)驗(yàn)變量。

3.2 關(guān)于丁香酚麻醉褐菖鲉的有效質(zhì)量濃度

丁香酚主要是通過鰓絲或體表被魚體吸收進(jìn)入血液循環(huán)，通過抑制腦皮質(zhì)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)致使其觸覺麻痹，再作用于基底神經(jīng)節(jié)和小腦，最后作用于脊髓，使魚體全身麻醉[32-33]。有研究表明硬骨魚類的最適麻醉質(zhì)量濃度基本在20～100 mg/L 之間[26]，本實(shí)驗(yàn)得出丁香酚對于標(biāo)志規(guī)格褐菖鲉的有效麻醉質(zhì)量濃度范圍為40～50 mg/L，研究結(jié)論高于大黃魚5～10 mg/L[14]、錦鯉（Cyprinus carpio）15～20 mg/L[30]、斑馬魚（Danio rerio）20 mg/L[19]等，低于俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）80～100 mg/L[34]，推測由于不同魚種神經(jīng)生理特性存在差異[35]，其機(jī)體內(nèi)部交互信息傳遞有一定區(qū)別導(dǎo)致麻醉劑作用于各部位存在時(shí)間差，使得不同魚種對同種麻醉劑的敏感程度有所區(qū)別[36]。對不同質(zhì)量濃度丁香酚作用下褐菖鲉的麻醉復(fù)蘇時(shí)間進(jìn)行線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)的丁香酚質(zhì)量濃度會對麻醉所需時(shí)間產(chǎn)生極顯著負(fù)向影響關(guān)系（P＜0.01），對復(fù)蘇時(shí)間有極顯著正向影響關(guān)系（P＜0.01），因此需縮短麻醉時(shí)間時(shí)可適度增加丁香酚質(zhì)量濃度。

此外，魚種、魚體規(guī)格、成熟度等都會影響適宜的麻醉質(zhì)量濃度，其中魚體規(guī)格及成熟度影響最為顯著。通常大型魚需要的麻醉濃度高于小型魚，魚齡越大，需要的麻醉劑濃度更高但復(fù)蘇率低[37]。本實(shí)驗(yàn)選取的實(shí)驗(yàn)魚為標(biāo)志放流規(guī)格的褐菖鲉幼魚，平均體長（88.22 ± 5.69）mm，日常增殖放流工作還包括更小規(guī)格的魚苗，因此可增加丁香酚對該魚種更多不同規(guī)格魚苗的麻醉實(shí)驗(yàn)。

3.3 關(guān)于空氣暴露時(shí)間對褐菖鲉復(fù)蘇的影響

在進(jìn)行標(biāo)志取血、測量取樣等研究操作過程中需要魚體短暫離水，未經(jīng)麻醉處理進(jìn)行急性離水操作易造成不同程度的鰓組織永久性損傷、肌肉組織結(jié)構(gòu)改變等[38]，麻醉后進(jìn)行離水操作對其生理影響相對較小[39]。褐菖鲉經(jīng)40 mg/L 的丁香酚麻醉后，隨空氣暴露時(shí)間延長，平均復(fù)蘇時(shí)間呈現(xiàn)先縮短后延長的趨勢：空氣暴露時(shí)間在3～15 min 時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚復(fù)蘇所需時(shí)間隨暴露時(shí)間延長而逐漸縮短；空氣暴露時(shí)間在15～45 min 時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚復(fù)蘇所需時(shí)間隨暴露時(shí)間延長而逐漸延長；空氣暴露60 min 時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚無法復(fù)蘇。由于許多硬骨魚類除鰓呼吸外還可通過皮膚呼吸進(jìn)行部分代謝[40]，推測魚體在空氣中由皮膚代謝了一定量丁香酚使得體內(nèi)麻醉濃度降低，從而逐漸復(fù)蘇，因此在15 min 以內(nèi)，平均復(fù)蘇時(shí)間隨空氣暴露時(shí)間增加而縮短，15 min 之后由于魚體基本達(dá)到復(fù)蘇階段，但長時(shí)間離水導(dǎo)致缺氧或短暫休克，需要一定時(shí)間恢復(fù)正常生理活動(dòng)，因此復(fù)蘇時(shí)間隨之延長。雖然麻醉后褐菖鲉在空氣中耐受時(shí)間較長，但考慮到缺氧會對魚體造成生理損害，且進(jìn)入復(fù)蘇階段魚體逐漸活躍不易于進(jìn)行各種操作，因此今后若進(jìn)行需魚體長時(shí)間離水的實(shí)驗(yàn)研究，建議麻醉后注意把握時(shí)間，盡量將離水過程控制在15 min以內(nèi)。