哈維氏弧菌可視化LAMP快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李 濤，周永燦，曹貞潔，孫 云

（海南大學(xué)海洋生物與水產(chǎn)學(xué)院/海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

石斑魚(yú)（Epinephelus）主要在我國(guó)東南沿海一帶養(yǎng)殖，是我國(guó)南方漁民重要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一[1]。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）是一種廣泛分布于海洋中的嗜鹽性條件致病菌，可嚴(yán)重威脅石斑魚(yú)、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）、矛尾復(fù)蝦虎魚(yú)（Synechogobius hasta）、方斑東風(fēng)螺（Babylonia areolata）等多種水產(chǎn)動(dòng)物的健康[2-5]。由哈維氏弧菌引起的弧菌病被認(rèn)為是石斑魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中主要的疾病之一，流行時(shí)間多處于夏季高溫期，當(dāng)外界條件適宜，哈維氏弧菌大量繁殖，并通過(guò)石斑魚(yú)的傷口、鰓或消化道侵染機(jī)體，導(dǎo)致機(jī)體組織器官發(fā)生病變，最終導(dǎo)致石斑魚(yú)的死亡[6]。隨著水產(chǎn)動(dòng)物病害問(wèn)題的日益突出，“早發(fā)現(xiàn)早治療”變得尤為重要，因此，加強(qiáng)病原早期的快速診斷和篩查，研發(fā)病原的快速檢測(cè)手段迫在眉睫。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技術(shù)是目前等溫?cái)U(kuò)增領(lǐng)域應(yīng)用最多的方法，其具有高特異性、高靈敏度、設(shè)備簡(jiǎn)單（簡(jiǎn)易恒溫裝置即可）、反應(yīng)快速（可在1 h內(nèi)對(duì)靶序列實(shí)現(xiàn)109倍的擴(kuò)增）等諸多優(yōu)勢(shì)[7]。此外，LAMP技術(shù)已實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化，即可通過(guò)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入鈣黃綠素、SYBR Green I、Neutral red、SYTO-9 等染料后直接肉眼觀察顏色變化來(lái)判定反應(yīng)情況，避免通過(guò)電泳檢測(cè)、濁度儀等方法的費(fèi)時(shí)現(xiàn)象，突破了該技術(shù)使用場(chǎng)合的局限性，在病原快速檢測(cè)方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿8]。目前，LAMP技術(shù)已在斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）病毒（CCV）[9]、遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）[10]、鰻弧 菌（Vibrio anguillarum）[11]、柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）[12]以及華支睪吸蟲(chóng)（Clonorchis sinensis）[13]等諸多病原的檢測(cè)上得到廣泛應(yīng)用。Toic是革蘭陰性菌廣泛存在的一種保守蛋白，在細(xì)菌致病性、耐藥性、生物被膜形成以及維持細(xì)菌胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要的作用[14]。為加強(qiáng)對(duì)哈維氏弧菌的早期快速診斷和篩查，本研究以哈維氏弧菌Toic為靶基因，設(shè)計(jì)LAMP 擴(kuò)增引物，以鈣黃綠素染料為擴(kuò)增結(jié)果指示劑，建立一種可視化的哈維氏弧菌LAMP快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：哈維氏弧菌分離自海南某養(yǎng)殖場(chǎng)患病珍珠龍膽石斑魚(yú)（Epinephelus lanceolatus♂×Epinephelus fuscoguttatus♀），經(jīng)16S RNA 測(cè)序鑒定后保存。副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）、阿爾法克弧菌（Vibrio alfacsensis）、坎氏弧菌（Vibrio campbellii）、歐氏弧菌（Vibrio owensii）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由海南大學(xué)海洋生物與水產(chǎn)學(xué)院經(jīng)16S RNA測(cè)序鑒定后保存。

試劑：Bst DNA 聚合酶（大片段，8 U/μL）、MgSO4購(gòu)自New England Biolabs 公司；甜菜堿、鈣黃綠素、MnCl2購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA 聚合酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；dNTPs（10 mmol/L）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。鈣黃綠素混合液母液：將鈣黃綠素溶于二甲基亞砜（DMSO）配制成5 mmol/L 溶液，再加入20 mmol/L MnCl2溶液進(jìn)行淬滅。

儀器與設(shè)備：恒溫水浴鍋（常州越新儀器制造有限公司，中國(guó)）；PCR 擴(kuò)增儀（Bio-red，美國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，中國(guó)）；-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；高速臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；超微量分光光度計(jì)（Biodrop，英國(guó)）；恒溫震蕩搖床、電泳儀（北京六一儀器廠，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取多株哈維氏弧菌及其他多種病原菌的Toic基因序列，基于局部比對(duì)算法搜索工具（BLAST）分析比對(duì)，選取哈維氏弧菌Toic（GenBank 登錄號(hào)：APP06536.1）高度保守的部分，通過(guò)在線程序軟件Primer Explorer version 5.0（http://www.http://primerexplorer.jp）設(shè)計(jì)Toic-1、Toic-2 和Toic-3 共3套特異性引物組，每套引物組中均包括兩個(gè)外引物（F3、B3）和兩個(gè)內(nèi)引物（FIP、BIP），另外再使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)兩個(gè)環(huán)引物L(fēng)F 和LB。引物序列見(jiàn)表1，所有引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

表1 LAMP擴(kuò)增引物及其序列Table 1 Primer sequences used for LAMP

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)和基因組DNA的制備 將哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、阿爾法克弧菌、坎氏弧菌、歐氏弧菌、金黃色葡萄球菌劃線接種于Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基上，金黃色葡萄球菌在溫度37 ℃下，其余弧菌在溫度30 ℃下培養(yǎng)12～16 h 后，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃或30 ℃下震蕩培養(yǎng)至光密度D600nm≈0.8。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株的基因組DNA，作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增反應(yīng)體系中的模板。

1.2.3 LAMP基本擴(kuò)增體系及最佳引物組篩選 以提取的哈維氏弧菌基因組DNA 為模板，將3 套擴(kuò)增引物組分別加入以下LAMP基本擴(kuò)增體系中?；緮U(kuò)增體系總體積為25 μL，其組分包括：10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL，內(nèi)引物FIP、BIP（10 μmol/L）各2 μL，外引物F3、B3（10 μmol/L）各0.5 μL，環(huán)引物L(fēng)F、LB（10 μmol/L）各1.5 μL，Bst DNA聚合酶（8U/μL）1 μL 和基因組DNA 模板（1 ng/μL）1 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。在恒溫水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，程序?yàn)椋?0 ℃，60 min；80 ℃，5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以篩選出最佳引物組。

1.2.4 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化 在使用1.2.3 節(jié)篩選出的最佳引物組的基礎(chǔ)上，采用單一變量法對(duì)LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。固定Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs 濃度為1.4 mmol/L，外內(nèi)引物比例為1∶4，環(huán)引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對(duì)鈣黃綠素混合液濃度（20、50、100、150、200 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，dNTPs 濃度為1.4 mmol/L，外內(nèi)引物比例為1∶4，環(huán)引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對(duì)Mg2+濃度（2、3、4、5、6、7、8 mmol/L）進(jìn)行優(yōu)化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，外內(nèi)引物比例為1∶4，環(huán)引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對(duì)dNTPs 濃度（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L）進(jìn)行優(yōu)化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs濃度為1.4 mmol/L，環(huán)引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對(duì)外內(nèi)引物比例（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8）進(jìn)行優(yōu)化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs濃度為1.4 mmol/L，外內(nèi)引物比例為1∶4，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對(duì)環(huán)引物濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs 濃度為1.4 mmol/L，外內(nèi)引物比例為1∶4，環(huán)引物濃度為0.6 μmol/L，對(duì)甜菜堿濃度（0、2、4、6、8、10、12 mmol/L）進(jìn)行優(yōu)化。在恒溫水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃，60 min；80 ℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物通過(guò)鈣黃綠素?zé)晒怙@色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定：一方面直接通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化來(lái)判斷是否有靶序列進(jìn)行擴(kuò)增（陽(yáng)性為亮綠色，陰性為橙黃色），另一方面用20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后結(jié)合實(shí)際應(yīng)用及后期集成，確定合適的LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系。

1.2.5 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)溫度優(yōu)化 以1.2.4 節(jié)中優(yōu)化的LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)不同的反應(yīng)溫度：58、59、60、61、62、63 ℃，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物參照1.2.4節(jié)通過(guò)鈣黃綠素?zé)晒怙@色法和20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定，最后結(jié)合實(shí)際應(yīng)用及后期集成，確定適宜的LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)溫度。

1.2.6 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 以1.2.4節(jié)與1.2.5節(jié)中優(yōu)化的LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)不同的反應(yīng)時(shí)間：30、35、40、45、50、55、60 min，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物參照1.4.4節(jié)通過(guò)鈣黃綠素?zé)晒怙@色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定，最后結(jié)合實(shí)際應(yīng)用及后期集成，確定最短的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間。

1.2.7 哈維氏弧菌Toic 基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以哈維氏弧菌基因組DNA 為模板，以1.2.3 節(jié)篩選出的最佳引物組中的外引物F3、B3 為引物，進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL，其組分包括：2×Rapid Taq Master Mix 13 μL，引物F3 和引物B3 各1μL，DNA 模板（1 ng/μL）1μL，ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)程序：1）95 ℃預(yù)變性5 min；2）95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共30個(gè)循環(huán)；3）72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物使用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將PCR 擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，并將回收后的Toic目標(biāo)片段連接到pEASY-T1-simple vector 上，構(gòu)建重組質(zhì)粒T1-Toic，并轉(zhuǎn)化至Escherichia coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑取單克隆，經(jīng)PCR 檢測(cè)后送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序成功的陽(yáng)性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.2.8 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)特異性檢測(cè) 以1.2.2 節(jié)中提取的各菌株基因組DNA為模板，同時(shí)設(shè)置哈維氏弧菌Toic基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O 為陰性對(duì)照，按照1.2.4—1.2.6 節(jié)中優(yōu)化的LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)產(chǎn)物參照1.2.4節(jié)通過(guò)鈣黃綠素?zé)晒怙@色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定，以確定LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系的特異性。

1.2.9 LAMP 及常規(guī)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)靈敏度檢測(cè) 采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取培養(yǎng)12 h 的哈維氏弧菌的基因組DNA，測(cè)量濃度后，用ddH2O 稀釋將模板濃度調(diào)整為10、100 fg/μL，1、10、100 pg/μL，1、10、100 ng/μL，作為靈敏度檢測(cè)的模板。按照1.2.4—1.2.6節(jié)中優(yōu)化的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物參照1.2.4節(jié)通過(guò)鈣黃綠素?zé)晒怙@色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定，以確定LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系的靈敏度。

以上述稀釋后的哈維氏弧菌基因組DNA 作為模板，以外引物F3、B3為引物，進(jìn)行常規(guī)PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照1.2.7 節(jié)進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物利用20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確定常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的靈敏度。

1.2.10 LAMP 檢測(cè)方法的驗(yàn)證及在石斑魚(yú)中的初步應(yīng)用 將30 尾健康無(wú)病的珍珠龍膽石斑魚(yú)暫養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，隨機(jī)分為2組（攻毒組和對(duì)照組），每組15 尾。震蕩培養(yǎng)哈維氏弧菌12 h，調(diào)整菌液濃度至1×105CFU/mL，攻毒組的每尾魚(yú)腹腔注射100 μL 哈維氏弧菌懸液。肝臟是哈維氏弧菌侵染魚(yú)體的靶器官之一[15-17]，因此，本研究在攻毒24 h后取肝臟進(jìn)行哈維氏弧菌的檢測(cè)。具體為：無(wú)菌環(huán)境下取魚(yú)體肝臟，加入ddH2O 研磨并煮沸5 min，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心2 min，取上清液并稀釋10倍作為L(zhǎng)AMP 反應(yīng)的模板。同時(shí)，將100 μL 的磷酸緩沖鹽溶液（PBS，濃度10 μmol/L，pH 7.4）腹腔注射入對(duì)照組魚(yú)，24 h 后取肝臟，經(jīng)相同方法處理后作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板。

用建立的LAMP 檢測(cè)方法對(duì)上述30 份石斑魚(yú)肝臟組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置哈維氏弧菌Toic基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O 為陰性對(duì)照，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)鈣黃綠素?zé)晒怙@色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定。同時(shí)參照1.2.9 節(jié)中的常規(guī)PCR擴(kuò)增方法對(duì)30份樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果使用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳引物組篩選

以哈維氏弧菌的基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的3 套引物組進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示Toic-2引物組的擴(kuò)增效果最佳（圖1），因此選擇Toic-2 引物組作為哈維氏弧菌LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的引物。

圖1 不同引物組的哈維氏弧菌LAMP擴(kuò)增反應(yīng)Fig.1 LAMP amplification reaction with different primers

2.2 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

分別對(duì)鈣黃綠素混合液、Mg2+、dNTPs、甜菜堿、環(huán)引物及不同的外內(nèi)引物比例進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增體系的優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)鈣黃綠素混合液濃度為100 μmol/L，Mg2+濃度為4 mmol/L，dNTPs 濃度為1.6 mmol/L，外內(nèi)引物比例為1∶7，環(huán)引物濃度為0.8 μmol/L，甜菜堿濃度為6 mmol/L 時(shí)，特異性梯狀條帶最為清晰，且產(chǎn)物呈現(xiàn)亮綠色（圖2(A～F)）。

圖2 哈維氏弧菌LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化Fig.2 System optimization of LAMP amplification reaction for Vibrio harveyi

2.3 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 設(shè)置不同的反應(yīng)溫度進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，在所有選定的溫度下，均可擴(kuò)增出特異性梯狀條帶，且產(chǎn)物均呈現(xiàn)亮綠色。另外，當(dāng)溫度為62 ℃時(shí)，特異性梯狀條帶最清晰，因此哈維氏弧菌LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的最佳溫度為62 ℃（圖3）。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 設(shè)置不同的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)擴(kuò)增時(shí)間為30 min時(shí)，并未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)；當(dāng)擴(kuò)增時(shí)間為35～60 min時(shí)，產(chǎn)物均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，且呈現(xiàn)亮綠色；且在35 min 時(shí)，即可見(jiàn)LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的特異性產(chǎn)物，當(dāng)擴(kuò)增50～60 min 時(shí)，特異性條帶更加清晰、明亮（圖4），但結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，選擇50 min 為最優(yōu)擴(kuò)增時(shí)間。因此，哈維氏弧菌LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的最短時(shí)間為35 min，而最優(yōu)擴(kuò)增時(shí)間為50 min。

2.4 特異性檢測(cè)

以9 種弧菌屬菌株及1 種金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，用優(yōu)化后的哈維氏弧菌LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，僅哈維氏弧菌和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)清晰的梯狀條帶，其余9種細(xì)菌及陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出條帶，且有梯狀條帶的產(chǎn)物顏色均對(duì)應(yīng)呈現(xiàn)出亮綠色（陽(yáng)性），反之，無(wú)梯狀條帶的產(chǎn)物顏色則對(duì)應(yīng)呈現(xiàn)出橙黃色（陰性），表明本研究建立的哈維氏弧菌LAMP 檢測(cè)方法具有良好的特異性，不與其他8 種弧菌菌株及金黃色葡萄球菌發(fā)生交叉反應(yīng)（圖5）。

圖5 哈維氏弧菌LAMP擴(kuò)增方法特異性檢測(cè)Fig.5 LAMP amplification for specific detection of Vibrio harveyi

2.5 靈敏度檢測(cè)

用梯度稀釋的哈維氏弧菌基因組DNA 作為模板，采用優(yōu)化后的哈維氏弧菌LAMP檢測(cè)方法及常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，LAMP檢測(cè)方法對(duì)哈維氏弧菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)100 fg/μL（圖6(A)）；相比之下，常規(guī)PCR法的檢測(cè)靈敏度為1 pg/μL（圖6(B)）。由此可見(jiàn)，本研究建立的哈維氏弧菌LAMP檢測(cè)方法的靈敏度要比常規(guī)PCR檢測(cè)法高10倍。

圖6 哈維氏弧菌LAMP擴(kuò)增方法及常規(guī)PCR法靈敏度檢測(cè)Fig.6 LAMP amplification and common PCR for sensitivity detection of Vibrio harveyi

2.6 哈維氏弧菌LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

為驗(yàn)證本研究所建立的哈維氏弧菌LAMP檢測(cè)方法的實(shí)用性，本研究使用哈維氏弧菌感染15尾石斑魚(yú)，并應(yīng)用該方法對(duì)采集的感染后的石斑魚(yú)肝臟組織樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，感染的15份樣本均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，且反應(yīng)顏色與電泳檢測(cè)結(jié)果一致，均呈亮綠色（圖7(A)）。另外，檢測(cè)15 份健康未感染的石斑魚(yú)肝臟組織樣品的結(jié)果顯示，所有樣品均未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，且反應(yīng)顏色均呈橙黃色，表明這15份樣品均為陰性，未感染哈維氏弧菌（圖7(B)）。

圖7 哈維氏弧菌LAMP檢測(cè)方法在石斑魚(yú)中的應(yīng)用Fig.7 Application of LAMP amplification method for detecting Vibrio harveyi in grouper

另外，用常規(guī)PCR 方法同樣檢測(cè)上述30 份樣品，結(jié)果顯示，15 份感染的樣品均擴(kuò)增出單一的目的條帶，表明這些樣品均受到哈維氏弧菌的感染；反之，15 份未感染的健康組織樣品全部未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明樣品為陰性。由此可見(jiàn)，LAMP檢測(cè)法和常規(guī)PCR法的檢測(cè)結(jié)果符合率為100%（圖7）。

3 討論

哈維氏弧菌是石斑魚(yú)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的病原菌之一，是引起石斑魚(yú)“爛尾病”的主要致病菌，也可嚴(yán)重威脅卵形鯧鲹、對(duì)蝦等其他重要水產(chǎn)動(dòng)物的健康。鑒于哈維氏弧菌的高致病性、高致死率，加強(qiáng)該病原早期的快速診斷和篩查十分重要。本研究針對(duì)哈維氏弧菌的Toic基因設(shè)計(jì)LAMP 擴(kuò)增引物，通過(guò)優(yōu)化LAMP 擴(kuò)增體系及反應(yīng)時(shí)間、溫度，檢測(cè)優(yōu)化后LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和靈敏度，成功建立一種哈維氏弧菌的可視化LAMP 快速檢測(cè)技術(shù)，并在石斑魚(yú)感染哈維氏弧菌的快速診斷中進(jìn)行應(yīng)用。

張靜等[18]根據(jù)哈維氏弧菌的ToxR基因建立一套針對(duì)哈維氏弧菌的LAMP 技術(shù)，其反應(yīng)靈敏度較高，為1 fg/μL，但檢測(cè)時(shí)間為45 min。該技術(shù)采用的是SYBR Green I 顯色法，需在反應(yīng)結(jié)束后開(kāi)蓋加入SYBR Green I，一定程度上存在氣溶膠污染造成假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。與之相比，本研究引入一對(duì)環(huán)引物，縮短了檢測(cè)時(shí)間，最低檢測(cè)時(shí)間僅為35 min，并且舍棄SYBR Green I，引入鈣黃綠素染料，避免開(kāi)蓋可能產(chǎn)生氣溶膠污染的問(wèn)題，大大降低假陽(yáng)性的可能性。涂志剛等[19]根據(jù)哈維氏弧菌的ToxR基因建立一套針對(duì)哈維氏弧菌的Real-time LAMP 技術(shù)，檢測(cè)靈敏度為100 fg/μL，檢測(cè)時(shí)間為40 min，具備靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但該技術(shù)需要借助熒光檢測(cè)儀器方能進(jìn)行檢測(cè)。相較之下，本研究具有與其相當(dāng)?shù)撵`敏度，更快的檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)且不需要借助復(fù)雜的儀器，僅需一臺(tái)恒溫水浴鍋即可完成檢測(cè)，更適合在生產(chǎn)一線進(jìn)行臨床檢測(cè)。故對(duì)比前人建立針對(duì)哈維氏弧菌的LAMP快速檢測(cè)方法，本研究方法優(yōu)點(diǎn)更為突出。

此外，與常規(guī)PCR 檢測(cè)方法相比，本研究建立的哈維氏弧菌可視化LAMP 快速檢測(cè)技術(shù)也有較多優(yōu)勢(shì)。Pang 等[20]基于哈維氏弧菌toxR基因構(gòu)建常規(guī)PCR快速檢測(cè)方法，從開(kāi)始檢測(cè)到PCR 產(chǎn)物鑒定結(jié)束總時(shí)長(zhǎng)約為2 h。本研究所建立的LAMP 技術(shù)可在簡(jiǎn)單的恒溫水浴鍋中（62 ℃）進(jìn)行反應(yīng)，最快反應(yīng)時(shí)間僅需35 min。因此相較于常規(guī)PCR 法，該方法不僅避免使用昂貴的PCR 儀，還可節(jié)約時(shí)間近1.5 h。另外，在反應(yīng)開(kāi)始前即向反應(yīng)液中加入鈣黃綠素染料，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束即可直接用肉眼對(duì)結(jié)果進(jìn)行快速判定，這樣既可避免反應(yīng)后開(kāi)蓋加入染料導(dǎo)致的氣溶膠污染，大大減少假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，又可代替瓊脂糖凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有較好的簡(jiǎn)便性。同時(shí)，本研究采用LAMP檢測(cè)法對(duì)30份石斑魚(yú)感染哈維氏弧菌的組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果及PCR 檢測(cè)結(jié)果的符合率均為100%。因此，本方法具有耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可視化等諸多優(yōu)點(diǎn)，非常適合在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行哈維氏弧菌的快速檢測(cè)，為進(jìn)一步推廣該技術(shù)在石斑魚(yú)及其他水生動(dòng)物哈維氏弧菌感染監(jiān)測(cè)中的現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模應(yīng)用提供了有用的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究以哈維氏弧菌外膜通道蛋白基因Toic為靶基因，以鈣黃綠素為檢測(cè)結(jié)果指示劑，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，成功建立一種針對(duì)哈維氏弧菌的可視化LAMP 檢測(cè)方法。該方法的檢測(cè)時(shí)間最快為35 min，靈敏度為100 fg/mL，特異性強(qiáng)，與8種弧菌及金黃色葡萄球菌均無(wú)交叉反應(yīng)，可準(zhǔn)確地檢測(cè)到魚(yú)體組織中感染的哈維氏弧菌。綜上所述，本研究建立的LAMP 檢測(cè)方法是一種操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果可視化的檢測(cè)方法，且適用于石斑魚(yú)感染哈維氏弧菌的早期快速診斷。