CO2麻醉對(duì)大口黑鱸?；钅M運(yùn)輸效果的影響

王肇鼎，李 寧，白 嬋，王炬光，柴 毅，熊光權(quán)

（1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434023；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；3.洪湖市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 荊州 4 332003；4.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北 武漢 430064）

大口黑鱸（Micropterus salmoides）是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一[1]，其無(wú)棘間刺、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高并且抗病能力強(qiáng)[2]，在我國(guó)廣東、浙江、江蘇等地廣泛養(yǎng)殖，2022年產(chǎn)量超過(guò)80萬(wàn)t[3]。鮮活大口黑鱸的市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)，目前長(zhǎng)時(shí)間遠(yuǎn)距離運(yùn)輸市場(chǎng)需求量大。

在活魚(yú)的運(yùn)輸過(guò)程中，高密度運(yùn)輸[4]、裝卸[5]、捕撈[6]及運(yùn)輸過(guò)程中氨的積累[7]等會(huì)造成應(yīng)激反應(yīng)，影響運(yùn)輸后水產(chǎn)動(dòng)物的存活率。采取麻醉后進(jìn)行?；钸\(yùn)輸可以減輕魚(yú)的應(yīng)激反應(yīng)，使魚(yú)平靜，減少運(yùn)動(dòng)，降低運(yùn)輸中的壓力和疼痛[8]。目前國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)用于食用魚(yú)的麻醉藥物數(shù)量有限且具有特殊預(yù)防措施[9]，如美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)唯一魚(yú)類麻醉藥MS-222 使用后需要經(jīng)過(guò)21 d 休藥期才能食用[10]，而苯佐卡因和丁香酚等新型麻醉劑由于藥物消退期問(wèn)題也存在爭(zhēng)議[11]。CO2從1943年起就被認(rèn)為是魚(yú)體有效麻醉劑[12]，作為公認(rèn)的安全（GRAS）食品成分[8]，CO2麻醉后運(yùn)輸?shù)聂~(yú)不存在食品安全方面問(wèn)題。

CO2麻醉作為麻醉劑在廣泛溫度范圍內(nèi)均有效，但長(zhǎng)時(shí)間CO2麻醉會(huì)減弱呼吸頻率，使魚(yú)體內(nèi)有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧呼吸，可能導(dǎo)致魚(yú)類呼吸衰竭致死，因此其毒性在很大程度上與水溫和使用時(shí)長(zhǎng)有關(guān)[13-15]。目前關(guān)于CO2麻醉運(yùn)輸大口黑鱸相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳運(yùn)輸水溫和CO2麻醉濃度，在最佳條件下探究CO2麻醉處理對(duì)保活運(yùn)輸過(guò)程中大口黑鱸血清中皮質(zhì)醇、葡萄糖含量，乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性等的影響，肌肉中蛋白質(zhì)、乳酸、糖原含量等指標(biāo)的影響，以達(dá)到提高大口黑鱸運(yùn)輸后存活率和運(yùn)輸效果的目的，同時(shí)為CO2麻醉使用安全提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大口黑鱸（M.salmoides）購(gòu)自湖北省嘉魚(yú)縣三湖漁業(yè)有限責(zé)任公司，用裝滿充氧淡水的1 t運(yùn)輸罐將健康無(wú)病、生長(zhǎng)趨勢(shì)良好的大口黑鱸迅速運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，運(yùn)輸罐上覆蓋黑色塑料布以減少運(yùn)輸途中產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前，將大口黑鱸放置在直徑100 cm、高90 cm 的圓柱形循環(huán)缸（水溫12～15 ℃，pH 7.3±0.1，溶氧量5.5～7.5 mg/L）中暫養(yǎng)大口黑鱸以確保狀態(tài)穩(wěn)定。暫養(yǎng)時(shí)每天投喂一次通威加州鱸膨化配合飼料，實(shí)驗(yàn)前停飼24 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)，大口黑鱸的平均體質(zhì)量為（509.0 ± 26.8）g，平均體長(zhǎng)為（32.95±1.65）cm。

納氏試劑購(gòu)自平根科技檢測(cè)技術(shù)服務(wù)中心；酒石酸鉀鈉溶液購(gòu)自江標(biāo)檢測(cè)科技有限公司。皮質(zhì)醇（Cortisol，COR）試劑盒購(gòu)買自武漢純度生物科技有限公司；葡萄糖（Glucose，GLU）、肌酐（Creatinine，CR）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine amiotransferase，ALT）、乳酸脫氫酶（Lactate sehydrogenase，LDH）、乳酸（Lactic acid，LD）、糖原（Glycogen，GLY）含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)買自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；HITACH UH5300 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本HITACHI 公司）；多功能酶標(biāo)儀SPARK（瑞士Tecan儀器公司）；BT25S 電子分析天平（精度0.001 g，德國(guó)Sartorius 公司）；HQ40 哈希HACH 便攜式雙路輸入多參數(shù)數(shù)字化分析儀（上海哈希水質(zhì)分析儀器有限公司）；便攜式氨氮測(cè)定儀（杭州齊威儀器有限公司）；FE28 pH 計(jì)（瑞士梅特勒-托利多國(guó)際有限公司）；全自動(dòng)凱氏定氮儀（海能儀器）。

1.3 CO2麻醉和?；钸\(yùn)輸大口黑鱸的條件確定

1.3.1 大口黑鱸麻醉和復(fù)蘇時(shí)間測(cè)定 從暫養(yǎng)水箱中隨機(jī)網(wǎng)取20 尾大口黑鱸放入裝有15 L 曝氣后實(shí)驗(yàn)用水的玻璃魚(yú)缸中，分別在7 ℃和14 ℃時(shí)通入V（CO2）∶V（O2）=1∶1（流速為0.1 L/ min）的混合氣體，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)平行組（n=3）。參照Holloway 等[15]的分期標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)觀察大口黑鱸行為判斷麻醉階段，用秒表記錄進(jìn)入各麻醉階段的時(shí)間，用CO2測(cè)定儀測(cè)定水體CO2含量，并根據(jù)鰓蓋運(yùn)動(dòng)以確定各階段的呼吸頻率[16]。當(dāng)大口黑鱸處于不同麻醉狀態(tài)時(shí)，將大口黑鱸轉(zhuǎn)入相同水溫裝有15 L曝氣后實(shí)驗(yàn)用水的玻璃魚(yú)缸中進(jìn)行復(fù)蘇，通過(guò)觀察大口黑鱸的行為判斷大口黑鱸復(fù)蘇狀態(tài)，用秒表記錄魚(yú)體平衡可以自由游動(dòng)，反應(yīng)恢復(fù)靈敏階段（R4）的時(shí)間。采取同一觀察者進(jìn)行大口黑鱸行為特征的觀察、麻醉和復(fù)蘇階段的判斷并進(jìn)行時(shí)間記錄。

1.3.2 麻醉時(shí)水溫的測(cè)定 從暫養(yǎng)水箱中隨機(jī)網(wǎng)取20尾大口黑鱸，放置在裝有15 L曝氣后實(shí)驗(yàn)用水的玻璃魚(yú)缸中模擬?；?，分別在水溫5、10、15、20 和25 ℃時(shí)通入V（CO2）∶V（O2）=1∶1（流速為0.1 L/min，CO2質(zhì)量濃度為1.8 g/L）的混合氣體，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)平行組（n=3）。在模擬?；畹?2、24、36 和48 h進(jìn)行復(fù)蘇，記錄大口黑鱸死亡數(shù)，計(jì)算平均存活率，篩選最佳的麻醉時(shí)水溫。

1.3.3 麻醉時(shí)CO2濃度的測(cè)定 從暫養(yǎng)水箱中隨機(jī)網(wǎng)取20 尾大口黑鱸放置在裝有15 L 曝氣后的實(shí)驗(yàn)用水的玻璃魚(yú)缸中，水溫控制在15 ℃，然后分別通入V（CO2）∶V（O2）=1∶1（流速為0.1 L/min）的混合氣體3、4、6、8 min，靜置8 min。用CO2測(cè)定儀測(cè)量玻璃水缸中CO2質(zhì)量濃度分別為1.8、4.8、6.8 和9.8 g/L。在上述四種CO2濃度下對(duì)魚(yú)進(jìn)行?；钅M運(yùn)輸，以不添加CO2的組作為對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行組（n=3）。在?；钅M運(yùn)輸?shù)?4、48、72和96 h 記錄大口黑鱸的死亡數(shù)，計(jì)算平均存活率，篩選最佳的麻醉時(shí)CO2濃度。

1.3.4 模擬運(yùn)輸 從暫養(yǎng)水箱中隨機(jī)網(wǎng)取20尾大口黑鱸放入裝有15 L 曝氣后實(shí)驗(yàn)用水的玻璃魚(yú)缸中，根據(jù)1.3.3和1.3.4節(jié)的結(jié)果選取水溫15 ℃和CO2質(zhì)量濃度6.8 g/L 為CO2處理組，以不添加CO2的組作為對(duì)照組，在黑暗中進(jìn)行模擬運(yùn)輸。其間每0.5 h振蕩3 次，震蕩條件為90 次/min，振蕩5 min。分別在保活模擬運(yùn)輸?shù)?、12、24、36 和48 h 隨機(jī)選擇5 尾魚(yú)，擦拭干凈魚(yú)表皮黏液，用注射器從尾部血管采集1.5 mL 血液，單尾魚(yú)只采樣一次。然后迅速解剖魚(yú)體，收集肝臟和每尾魚(yú)同側(cè)面?zhèn)染€上頭部到背鰭之間魚(yú)背肌肉（長(zhǎng)、寬、高為3、1、1 cm）組織，用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH：7.4）清洗后,放置于無(wú)菌無(wú)酶的10 mL 離心管中用液氮迅速冷凍后，保存于-80 ℃冰箱待用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 水中氨氮的測(cè)定 在1.3.4的?；钅M運(yùn)輸?shù)?、24、48 和72 h 分別取水樣，參照HJ 535—2009《水質(zhì)氨氮的測(cè)定納氏試劑分光光度法》[17]進(jìn)行水中總氨氮濃度的測(cè)定。

1.4.2 生化指標(biāo)測(cè)定 全血樣品在4 ℃下靜置4 h，待血液分層后在4 000 r/min 條件下離心10 min，小心吸取上層血清置于10 mL 離心管，保存于-80 ℃冰箱。保存過(guò)程中如若出現(xiàn)沉淀則同樣條件再次離心。吸取上層血清分裝于離心管，冰水浴中解凍血清樣本，然后根據(jù)檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，）操作步驟測(cè)定GLU、CR、BUN、AST、ALT、LDH和LD等指標(biāo)。

1.4.3 肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 稱取1 g 左右凍存魚(yú)肉，按照質(zhì)量∶體積=1 g∶9 mL 的比例加入4 ℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.65%生理鹽水，在冰水浴中勻漿，然后在4 ℃、2 500 r/min 條件下離心20 min，仔細(xì)收集質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的組織勻漿上清液，保存于-80 ℃冰箱備用。根據(jù)檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定大口黑鱸組織的GLY、LD 等指標(biāo)。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016）[18]進(jìn)行。水分含量的測(cè)定采用直接干燥法（GB 5009.3—2016）[18]進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為各測(cè)定值的平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差。用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），顯著性差異檢驗(yàn)采用Duncan's 檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05，用Graphpad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬?；钸\(yùn)輸水溫對(duì)大口黑鱸麻醉和復(fù)蘇時(shí)間的影響

參照Summerfelt[19]和Prince 等[20]對(duì)麻醉有效階段的定義、Holloway 等的分類標(biāo)準(zhǔn)[15]，結(jié)合大口黑鱸的實(shí)際情況，麻醉階段和復(fù)蘇階段分期及相應(yīng)時(shí)間記錄如表1。大口黑鱸達(dá)到失去平衡、喪失肌肉張力的A4 階段，在7 ℃下需要15.23 min，而在14 ℃下僅需10.33 min。達(dá)到魚(yú)體恢復(fù)平衡可以自由游動(dòng)、反應(yīng)恢復(fù)靈敏的R4 階段，在水溫為7 ℃時(shí)需要10.20 min，14 ℃時(shí)僅需要3.53 min。復(fù)蘇24 h后大口黑鱸的存活率隨著溫度的上升而提高，當(dāng)水溫為7 ℃時(shí)，60%的魚(yú)能存活24 h。當(dāng)溫度為14 ℃時(shí)，大口黑鱸存活率可達(dá)100%。結(jié)果表明，水溫較低時(shí)，大口黑鱸進(jìn)入麻醉期的時(shí)間和麻醉之后的復(fù)蘇時(shí)間延長(zhǎng)，并且影響麻醉后的存活率。這可能是因?yàn)闇囟仍降停珻O2通過(guò)魚(yú)鰓進(jìn)入體內(nèi)的滲透速率減慢，魚(yú)體的代謝速率低、能量消耗減少，導(dǎo)致麻醉時(shí)間和復(fù)蘇時(shí)間都增加[13]。根據(jù)Marking 等研究[10]，理想麻醉劑的誘導(dǎo)時(shí)間應(yīng)該在3 min 以內(nèi)，恢復(fù)時(shí)間在5 min以內(nèi)，并且根據(jù)Summerfelt等[21]列出的理想麻醉劑應(yīng)有特征，本研究中所使用的的CO2是大口黑鱸的理想麻醉劑。

表1 水溫對(duì)大口黑鱸麻醉和復(fù)蘇時(shí)間的影響Table 1 Effect of water temperature on anesthesia and resuscitation of largemouth bass(Lepomis macrochirus)

2.2 運(yùn)輸水溫和CO2濃度對(duì)大口黑鱸存活率的影響

由圖1(a)可得，隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，各溫度組大口黑鱸存活率逐漸下降。5 ℃組的大口黑鱸在運(yùn)輸24 h 出現(xiàn)死亡，10 和20 ℃組在運(yùn)輸36 h 出現(xiàn)死亡，15 ℃組在運(yùn)輸48 h 出現(xiàn)死亡，25 ℃組在運(yùn)輸12 h 出現(xiàn)死亡。運(yùn)輸48 h，水溫10 ℃和15 ℃下大口黑鱸存活率較高，為90.00%和86.67%。由此可知，在本研究條件下對(duì)大口黑鱸進(jìn)行保活運(yùn)輸時(shí)，運(yùn)輸最佳水溫為15 ℃。由于魚(yú)類的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能只能在特定的溫度范圍內(nèi)保持，所以溫度變化會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類應(yīng)激致死[22]。當(dāng)水溫較低時(shí)，大口黑鱸存活率下降，可能是低溫應(yīng)激導(dǎo)致魚(yú)類細(xì)胞功能障礙并且刺激了相關(guān)凋亡基因的表達(dá)[21]。而在水溫較高時(shí)，CO2通過(guò)滲透調(diào)節(jié)方面具有重要作用的鰓[23]進(jìn)入魚(yú)體的滲透速率加快，雖然麻醉作用下鰓蓋運(yùn)動(dòng)減少導(dǎo)致大口黑鱸通氣量減少，但這并不阻礙CO2進(jìn)入血流[15]，此時(shí)CO2大量累積在血液中，導(dǎo)致大口黑鱸在運(yùn)輸過(guò)程中麻醉致死。因此CO2麻醉大口黑鱸進(jìn)行?；钸\(yùn)輸時(shí)，適宜選取水溫為15 ℃。這與Tan 等[22]認(rèn)為低溫結(jié)合CO2麻醉可有效延長(zhǎng)大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）存活率結(jié)果相似。

圖1 不同水溫和CO2質(zhì)量濃度對(duì)模擬保活運(yùn)輸大口黑鱸存活率的影響Fig.1 Effects of water temperature and CO2 concentration on the survival rate of largemouth bass(Lepomis macrochirus)

由圖1(b)可知，隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，各CO2處理組大口黑鱸存活率逐漸下降。在水溫為15 ℃、CO2質(zhì)量濃度為4.8、6.8 g/L 時(shí)，大口黑鱸模擬?；钸\(yùn)輸96 h后存活率仍為100%，此時(shí)CO2質(zhì)量濃度為1.8 g/L 和9.8 g/L 組大口黑鱸全部死亡，對(duì)照組存活率為50.67 %。模擬運(yùn)輸24 h，CO2質(zhì)量濃度為9.8 g/L 組存活率為50.67%，其余組為100%。模擬運(yùn)輸48 h，對(duì)照組、1.8 g/L 組和9.8 g/L 組存活率分別為83.67%、60.67%和20.67%。模擬運(yùn)輸72 h，對(duì)照組和1.8 g/L 組存活率為66.33%和30.33%，而9.8 g/L 組魚(yú)全部死亡。以上結(jié)果表明，使用CO2進(jìn)行麻醉時(shí)，濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于魚(yú)類存活，本研究條件下CO2最佳麻醉質(zhì)量濃度為4.8、6.8 g/L。低濃度CO2會(huì)導(dǎo)致麻醉過(guò)程不能達(dá)到魚(yú)類麻醉標(biāo)準(zhǔn)[15]，使大口黑鱸未處于低代謝、低能量消耗狀態(tài)，導(dǎo)致麻醉后魚(yú)體提前復(fù)蘇，產(chǎn)生急性應(yīng)激反應(yīng)，并且麻醉本身會(huì)導(dǎo)致輕度或中度應(yīng)激反應(yīng)[24]。隨著CO2濃度的增加和運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，大口黑鱸體內(nèi)的CO2含量也不斷累計(jì)，高CO2含量會(huì)影響魚(yú)類體內(nèi)的酸堿平衡[25]，從而影響CO2麻醉后魚(yú)類的存活率。

2.3 不同CO2濃度對(duì)模擬?；钸\(yùn)輸水中氨氮含量的影響

由圖2可知，隨著模擬運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組及各CO2濃度組水中氨氮含量均有一定增加，但相較于對(duì)照組增加較少。同一運(yùn)輸時(shí)間下，CO2濃度增加，水中氨氮的含量反而逐漸減少。這表明通入CO2可一定程度抑制水中氨氮含量的上升。但經(jīng)9.8 g/L CO2麻醉的大口黑鱸模擬運(yùn)輸組率先出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，這可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中排泄的CO2、氨積累及不良的水交換使水質(zhì)降低[7]，同時(shí)魚(yú)被CO2過(guò)度麻醉造成高碳酸血癥導(dǎo)致的[8]，同時(shí)CO2濃度的增加會(huì)導(dǎo)致血液和組織呼吸色素酸化，使氧氣攝入和輸送的減少[26]。Rimmer 等[27]也認(rèn)為運(yùn)輸過(guò)程中的封閉水體水質(zhì)的變化主要受CO2的影響，與本研究結(jié)果相似。

圖2 不同CO2濃度對(duì)模擬運(yùn)輸過(guò)程中氨氮濃度的影響Fig.2 Effect of different CO2 concentrations on ammonianitrogen concentration during simulated transport

2.4 CO2麻醉對(duì)模擬?；钸\(yùn)輸大口黑鱸血清生化指標(biāo)的影響

如圖3(a)所示，在模擬保活運(yùn)輸過(guò)程中，6.8 g/L CO2麻醉處理組血清中COR 質(zhì)量濃度低于對(duì)照組，且CO2處理組在各運(yùn)輸時(shí)間點(diǎn)之間具有顯著差異（P＜0.05），對(duì)照組在運(yùn)輸12、36 h 血清中COR 質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加，CO2處理組血清中COR 含量呈現(xiàn)先降低（0～12 h）后升高（12～48 h）的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镃O2麻醉降低了魚(yú)類的新陳代謝并補(bǔ)償了溫度變化引起的應(yīng)激[22]，而隨著運(yùn)輸時(shí)間增長(zhǎng)，應(yīng)激導(dǎo)致促腎上腺皮質(zhì)激素釋放，從而引起COR 合成和分泌，導(dǎo)致COR在運(yùn)輸后期出現(xiàn)峰值[28-29]。

圖3 CO2麻醉對(duì)模擬?；钸\(yùn)輸大口黑鱸血清中皮質(zhì)醇、葡萄糖和乳酸脫氫酶的影響Fig.3 Effects of CO2 anesthesia on COR(a),GLU(b),and LDH(c)in the serum of simulated live-transported largemouth bass(Lepomis macrochirus)

如圖3(b)所示，在保活模擬運(yùn)輸過(guò)程中，大口黑鱸血清中GLU 含量在0～36 h 呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，之后下降。各運(yùn)輸時(shí)間之間具有顯著差異（P＜0.05），且對(duì)照組血清中的GLU 含量顯著高于CO2處理組（P＜0.05）。可能是因?yàn)檫\(yùn)輸前期血液中COR 含量增加導(dǎo)致糖原分解、糖異生作用加強(qiáng)[16]，另外此時(shí)麻醉的魚(yú)呼吸頻率減緩，血液中會(huì)釋放相對(duì)較高的兒茶酚胺，也會(huì)引起GLU 升高[30]。但后期模擬運(yùn)輸時(shí)間增加，長(zhǎng)期饑餓使糖原脫支酶被抑制，糖原分解減少，GLU含量減少[31]。

LDH 可反映糖原分解產(chǎn)生乳酸的程度和葡萄糖厭氧代謝的程度。如圖3(c)所示，在進(jìn)行?；钅M運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加，大口黑鱸LDH 摩爾濃度不斷增加，且對(duì)照組和CO2處理組之間均具有顯著差異（P＜0.05），運(yùn)輸12～48 h 間對(duì)照組中LDH 摩爾濃度顯著高于CO2處理組（P＜0.05），可能是因?yàn)檫\(yùn)輸前期血液中GLU 含量上升，為處于應(yīng)激狀態(tài)下的需氧組織（心臟或鰓）提供能量[29]，但CO2處理組麻醉時(shí)鰓蓋運(yùn)動(dòng)、通氣頻率、通氣量減少[28]，組織氧供應(yīng)減少?gòu)男柩醮x轉(zhuǎn)換為無(wú)氧代謝[32]，相較于對(duì)照組消耗了更少的能量，有更多的能量供給應(yīng)激狀態(tài)下的需氧組織（心臟或鰓），從而減少了由于魚(yú)類應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞的破損，降低了心肌細(xì)胞中LDH 的流出，從而CO2處理組血清中LDH 摩爾濃度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），表明經(jīng)CO2麻醉處理之后進(jìn)行保活模擬運(yùn)輸可以減輕因應(yīng)激導(dǎo)致的心肌損傷。

由圖4(a、b)可知，AST 活性在CO2處理組和對(duì)照組的各模擬運(yùn)輸時(shí)間之間均有顯著差異（P＜0.05），且同一時(shí)間下對(duì)照組AST 活性顯著高于CO2處理組（P＜0.05）。隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，AST活性也增加，在模擬運(yùn)輸48 h 時(shí)，AST 活性達(dá)到最高，為（26.85± 1.93）U/L。CO2處理組ALT 活性在各模擬運(yùn)輸時(shí)間之間存在顯著差異（P＜0.05），對(duì)照組在運(yùn)輸0～12 h不具有顯著差異（P＞0.05），隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，ALT活性增加，CO2處理組ALT活性在模擬運(yùn)輸48 h 時(shí)達(dá)到最高，為（43.00 ± 1.93）U/L。AST 作為生物體內(nèi)作用于氨代謝的酶，在心肌中廣泛分布[33]。ALT可以協(xié)助糖異生產(chǎn)生葡萄糖和氨基酸代謝，并作為應(yīng)激中肝臟受損的主要指標(biāo)[13]。在?；钅M運(yùn)輸過(guò)程中，大口黑鱸產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞損傷、凋亡基因表達(dá)，AST 和ALT 作為細(xì)胞損傷和死亡的標(biāo)志物在血流中釋放，引起血清中AST和ALT質(zhì)量濃度上升[16]。

圖4 CO2麻醉對(duì)模擬?；钸\(yùn)輸大口黑鱸血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和肌酐的影響Fig.4 Effects of CO2 anesthesia on AST(a),ALT(b),BUN(c)and CR(d)in the serum of simulated live-transported largemouth bass(Lepomis macrochirus)

BUN 作為魚(yú)體內(nèi)除氨外的重要含氮排泄物，經(jīng)常被用作腎損傷指標(biāo)[34]。CR 水平升高說(shuō)明結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致腎功能障礙[35]、腎小球?yàn)V過(guò)率能力降低和血液中產(chǎn)生許多不會(huì)被清除的廢物[36]。由圖4(c、d)可知，CO2處理組的BUN 和CR 濃度在各模擬運(yùn)輸時(shí)間均差異顯著（P＜0.05），并且隨著運(yùn)輸時(shí)間不斷增加，對(duì)照組BUN和CR濃度均大于CO2處理組，說(shuō)明對(duì)照組大口黑鱸在模擬運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生了腎功能損害，CO2處理減輕了大口黑鱸的應(yīng)激反應(yīng)、新陳代謝水平和呼吸頻率，使血液中BUN、CR 的流入量減少。

2.5 CO2麻醉對(duì)模擬?；钸\(yùn)輸大口黑鱸肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由圖5(a)可知，隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加，魚(yú)背肌肉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體呈下降趨勢(shì)，CO2處理組在12～48 h 之間蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著運(yùn)輸時(shí)間的增長(zhǎng)，魚(yú)背肌肉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，一方面是因?yàn)轸~(yú)類在運(yùn)輸過(guò)程中降解一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（糖原、蛋白質(zhì)等）為生物體提供營(yíng)養(yǎng)并使其保持活力[37]，另一方面，不利的環(huán)境因素（運(yùn)輸過(guò)程中的振動(dòng)）不斷刺激魚(yú)體消耗能量，從而促進(jìn)能量供應(yīng)物質(zhì)的分解[38]，并且隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加，機(jī)體pH 降低酸化也會(huì)抑制蛋白質(zhì)的生物合成[39]。

圖5 CO2麻醉對(duì)模擬保活運(yùn)輸大口黑鱸肌肉蛋白質(zhì)、pH值、糖原和乳酸的影響Fig.5 Effect of CO2 anesthesia on protein(a),pH(b),GLY(c)and LD(d)in the muscle of simulated live-transported largemouth bass(Lepomis macrochirus)

由圖5(b-d)可知，隨著運(yùn)輸時(shí)間延長(zhǎng)，pH 在運(yùn)輸中呈現(xiàn)先降低（0～12 h）后升高（12～48 h）的趨勢(shì)，但CO2處理組和對(duì)照組的pH 差異不顯著（P＞0.05）。在運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)照組乳酸質(zhì)量摩爾濃度顯著高于CO2處理組（P＜0.05），隨著運(yùn)輸時(shí)間延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在運(yùn)輸24 h 最高，此時(shí)CO2處理組和對(duì)照組乳酸質(zhì)量摩爾濃度分別為（0.82 ± 0.07）和（1.12 ± 0.03）mmol/g。糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)在模擬運(yùn)輸過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且0～36 h 間變化顯著（P＜0.05），CO2處理組在運(yùn)輸過(guò)程中糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間模擬運(yùn)輸，血液中CO2濃度增加，CO2分壓增大使魚(yú)類呼吸性酸中毒導(dǎo)致高碳酸血癥[40]，而高碳酸血癥會(huì)導(dǎo)致組織產(chǎn)生大量乳酸[41]，并且模擬運(yùn)輸過(guò)程中低溫缺氧也會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)乳酸積累，同時(shí)糖原會(huì)被分解產(chǎn)生乳酸，糖酵解途徑轉(zhuǎn)變?yōu)橹痉纸獯x[42]，因此糖原含量隨模擬運(yùn)輸時(shí)間的增長(zhǎng)而下降，乳酸含量隨模擬運(yùn)輸時(shí)間的增長(zhǎng)而上升。運(yùn)輸早期糖原被分解產(chǎn)生乳酸會(huì)降低pH，在機(jī)體酸化和pH 降低的情況下，魚(yú)體通過(guò)兒茶酚胺蛋白進(jìn)行離子交換來(lái)提高pH[43]，并且蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的堿性物質(zhì)也會(huì)導(dǎo)致pH 上升[44]，所以模擬運(yùn)輸過(guò)程中pH 呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，7 ℃相較于14 ℃大口黑鱸進(jìn)入麻醉和恢復(fù)階段需要更長(zhǎng)的時(shí)間，并且恢復(fù)24 h 后14 ℃組存活率為100%，7 ℃組存活率僅為60%，說(shuō)明麻醉溫度會(huì)影響大口黑鱸體內(nèi)代謝速率和存活率。隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加，水中氨氮濃度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其中CO2處理組水中氨氮濃度低于對(duì)照組，表明通入CO2可一定程度抑制水中氨氮含量的上升，延緩水質(zhì)惡化速度。確定大口黑鱸進(jìn)行模擬保活運(yùn)輸采用15 ℃水溫，6.8 g/L CO2麻醉時(shí)運(yùn)輸效果最佳，此條件可以減輕大口黑鱸在模擬運(yùn)輸過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)，使COR、GLU、LDH、AST、ALT、BUN和CR 等指標(biāo)隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，其在體內(nèi)增加的水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），可以減少運(yùn)輸過(guò)程中肌肉乳酸的產(chǎn)生量，減緩運(yùn)輸過(guò)程中肌肉蛋白質(zhì)及糖原的流失速率，但同時(shí)也減弱了大口黑鱸的呼吸頻率，使大口黑鱸體內(nèi)有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧呼吸，導(dǎo)致體內(nèi)肝腎受損，進(jìn)而影響存活率。因此，建議采用水溫為15 ℃，CO2質(zhì)量濃度為6.8 g/L ?；钸\(yùn)輸大口黑鱸時(shí)運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)不宜超過(guò)36 h。