飼料磷脂水平對烏鱧幼魚生長性能、抗氧化能力及脂肪沉積的影響

張 玉，龔 埜，李文飛，王振杰，陳乃松,2，李松林,2

（1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306）

磷脂（Phospholipid,PL）是魚類體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)和功能分子，參與細(xì)胞膜合成、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程，可通過促進(jìn)脂肪酸運(yùn)轉(zhuǎn)、增強(qiáng)脂肪酸氧化并抑制脂質(zhì)生成等方式降低肝臟脂肪含量[1-2]。在飼料中添加適量磷脂可促進(jìn)魚類的生長、存活、抗氧化和骨骼發(fā)育等方面的表現(xiàn)[3-5]。魚類對磷脂的需求量和利用效率會因不同發(fā)育階段和不同物種而變化。對于仔稚魚，由于其合成磷脂的能力有限，在其飼料中補(bǔ)充磷脂十分必要[6]，添加適宜的磷脂可促進(jìn)仔稚魚生長發(fā)育、提高存活率并降低骨骼畸形率[7-10]。而高水平的脂質(zhì)攝入可能會導(dǎo)致魚類肝臟中脂質(zhì)過度沉積[11]，影響肝功能和其健康狀況[12-15]。飼料中添加磷脂可降低大黃魚（Larimichthys crocea）[16-17]、雜交鱧（Channa argus×Channa maculata）[18]和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[19]的肝臟脂肪含量。飼料中添加磷脂會顯著提高杜氏（Serioladumerili）[20]和斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[21]肝臟中的脂質(zhì)積累。飼料磷脂的增加減少了脂肪酸氧化，增加了雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）肝臟脂質(zhì)的積累[22]。因此，探討磷脂對魚類脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，優(yōu)化魚類飼料中磷脂的添加水平和比例，對于提高水產(chǎn)養(yǎng)殖效率有著重要意義。

烏鱧（Channa argus）是中國北方廣泛養(yǎng)殖的肉食性魚類之一，有很高的市場價(jià)值和需求[23]，但在烏鱧的集約化養(yǎng)殖中，時(shí)常出現(xiàn)營養(yǎng)性代謝疾病，不利于烏鱧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化健康發(fā)展[24-25]。目前，有關(guān)烏鱧幼魚的營養(yǎng)需求和生理代謝研究較多[18,26-28]，但烏鱧幼魚的磷脂需求及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究探討飼料中添加磷脂對烏鱧幼魚的生長、抗氧化以及脂質(zhì)代謝的影響，分析烏鱧幼魚對磷脂的需求，旨在為烏鱧的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

在基礎(chǔ)配合飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、2%、4%、6%和8%的磷脂（各組飼料中磷脂水平實(shí)測值分別為1.37%、3.22%、5.36%、7.23%和9.15%），通過調(diào)整大豆油水平來維持脂肪含量的穩(wěn)定，配制成5 種等氮等脂飼料，分別記為PL0、PL2、PL4、PL6 和PL8（表1）。實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸組成見表2。固體原料粉碎，過孔徑180 μm的篩，逐級混勻，與磷脂充分混合后再與魚油和豆油的混合物充分混勻。將混合的原料加水充分混勻后擠壓制粒，在60 ℃下烘干、密封，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)組成（干物質(zhì)）Table 1 Formulation and chemical composition of experimental diets(dry matter) %

1.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在上海海洋大學(xué)和上海農(nóng)好飼料股份有限公司聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)魚用商品飼料（浙江欣欣天恩水產(chǎn)飼料有限公司）馴化2 周，停飼24 h，挑選規(guī)格相似、體格健壯的烏鱧幼魚[初始體質(zhì)量（3.99 ± 0.01）g]隨機(jī)均分到15 個容量為800 L 的養(yǎng)殖桶中，每個養(yǎng)殖桶45 尾。各組每天6:00、10:00、14:00 和17:00 進(jìn)行表觀飽食投喂，為期43 d。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)海綿和珊瑚砂過濾，并用紫外線消毒24 h，幼魚攝食后吸底和排污。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間采用自然光照周期，水溫（26 ±1）℃，溶解氧大于6.2 mg/L，pH 為7.2 ± 0.2，氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度均≤0.1 mg/L。

1.3 幼魚生長性能統(tǒng)計(jì)及樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，幼魚停飼24 h，用丁香酚麻醉，計(jì)數(shù)，稱總質(zhì)量，計(jì)算生長性能指標(biāo)：

存活率（SR，%）=終末數(shù)量/初始數(shù)量；

增重率（WGR）=（末均體質(zhì)量-初均體質(zhì)量）/初均體質(zhì)量；

特定生長率（SGR）=（ln 末均體質(zhì)量-ln 初均體質(zhì)量）/養(yǎng)殖周期；

飼料系數(shù)（FCR）=攝食飼料質(zhì)量/（末均體質(zhì)量-初均體質(zhì)量）；

日攝食率（FI）=攝食飼料質(zhì)量/[(初體質(zhì)量+末體質(zhì)量)/(2×養(yǎng)殖周期)]；

臟體比（VSI）=內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量/末體質(zhì)量；

肝體比（HSI）=肝臟質(zhì)量/末體質(zhì)量。

每桶隨機(jī)取魚20 尾，6 尾保存在-20 ℃用于體成分分析。剩余14 尾魚中，6 尾用于測量肝體比和臟體比，8 尾剖取肝臟和腸道用于采集生化分析和基因檢測，所有樣品采集后于液氮中速凍，于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品分析

1.4.1 樣品及實(shí)驗(yàn)飼料常規(guī)指標(biāo)分析 實(shí)驗(yàn)飼料和樣品（包括全魚、肌肉和肝臟）的水分含量采用105 ℃恒溫干燥法（GB/T6435—2014）測定，烘干樣用于測定粗脂肪、粗蛋白及粗灰分；粗脂肪含量采用氯仿-甲醇萃取法測定[29]；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮儀（OPSIS，瑞典）測定（GB/T5009.124—2016）；灰分含量通過將樣品在550 ℃馬弗爐中燃燒至恒重后測定（GB/T6438—2007）。磷脂含量通過鉬藍(lán)法測定[30]。脂肪酸相對含量（占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)）用HP6890 氣相色譜儀（Agilents Technologies,Santa-Clara,CA,USA）測定，用于脂肪酸檢測的飼料、肌肉和肝臟樣品經(jīng)過前處理變成的甲酯得到。

1.4.2 生化指標(biāo)測定 取適量-80 ℃保存的肝臟樣品于離心管，加入生理鹽水，研磨，離心，取上清液，根據(jù)南京建成試劑盒說明書測定總蛋白（TP）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力、過氧化氫酶（CAT）活力和總抗氧化能力（T-AOC）指標(biāo)。

1.4.3 RNA 提取和實(shí)時(shí)定量PCR 使用TransZolUp（TransGen）提取肝臟樣品的總RNA，用PrimeScript?RT 試劑盒（Takara）將其逆轉(zhuǎn)錄成第1 鏈cDNA。用TransStart?TopGreenqPCR SuperMix（TransGen）在定量熱循環(huán)儀（Mastercycler EP Realplex，Eppendorf）中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。通過Primer Premier5.0設(shè)計(jì)特異性引物（表3），以經(jīng)過驗(yàn)證穩(wěn)定的β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對表達(dá)量[28]。

表3 引物序列Table 3 Sequence of primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤。使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)差異顯著時(shí)，采用Duncan's多重檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，顯著水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚生長性能與飼料利用的影響

由表4 可知，在飼料中添加磷脂對烏鱧幼魚的終末體質(zhì)量（FBW）和SGR 有顯著影響，其中PL4組和PL6組均顯著高于PL0組（對照）（P＜0.05），但對幼魚SR影響不顯著（P＞0.05）。隨飼料中磷脂水平的升高，幼魚HSI 無顯著差異（P＞0.05），PL8 組幼魚VSI 顯著小于其他組（P＜0.05）；FI 和FCR 先降低后升高，PL2 和PL4 組FI 顯著低于PL0 組（P＜0.05），PL2組、PL4組和PL6組FCR 顯著低于PL0組（P＜0.05）。

表4 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚的生長性能與飼料利用情況的影響Table 4 Effects of dietary phospholipids on growth performance and feed utilization of juvenile snakehead

2.2 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚的魚體、肝臟、肌肉營養(yǎng)成分的影響

由表5可知：隨著飼料中磷脂添加量的增加，魚體的粗脂肪含量呈下降趨勢，PL6 組和PL8 組顯著低于PL0 組（P＜0.05），魚體水分含量則呈上升趨勢，PL6 組和PL8 組顯著高于PL0 組（P＜0.05）；肌肉粗蛋白含量呈下降趨勢，PL8 組肌肉蛋白含量顯著低于PL0組（P＜0.05）；肌肉水分呈先降后升變化趨勢，PL2 組和PL4 組顯著低于PL0 組，PL8 組升至PL0 組水平（P＜0.05）。磷脂水平的提高，對幼魚肝臟組織中的蛋白含量無顯著影響（P＞0.05），肝臟粗脂肪含量呈降低趨勢，PL0 組肝臟脂肪含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）；肝臟水分含量則呈升高趨勢，PL6組、PL8組顯著高于PL0組（P＜0.05）。

表5 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚魚體、肌肉和肝臟成分的影響（濕基）Table 5 Effects of dietary phospholipids on composition of whole fish body,muscle and liver of juvenile snakehead(wet basis) %

2.3 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚肝臟抗氧化酶活力的影響

由表6可知：隨著磷脂含量的升高，烏鱧幼魚肝臟MDA 含量呈降低趨勢，PL6和PL8組顯著低于其他組（P＜0.05）；肝臟SOD 活力呈升高趨勢，PL6 和PL8 組顯著高于PL0 組（P＜0.05），PL8 組升至最高（P＜0.05）；T-AOC 則呈先升后降趨勢，PL2 組最高（P＜0.05），PL8 組降至對照組水平。飼料中磷脂含量變化對CAT活力無顯著影響（P＞0.05）。

表6 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚肝臟抗氧化酶活力的影響Table 6 Effects of dietary phospholipids on hepatic antioxidant capacity of juvenile snakehead

2.4 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚肝臟、肌肉脂肪酸組成的影響

由表7可知：隨著飼料中磷脂含量的升高，烏鱧幼魚肝臟組織脂肪酸C14:0、C18:0、C16:1n7、C18:1n9和單不飽和脂肪酸（MUFA）相對含量無顯著變化（P＞0.05）；C16:0、飽和脂肪酸（SFA）、C20:1n9、C20:4n-6、C20:5n-3、C22:6n-3、n-3 多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）相對含量顯著升高（P＜0.05），且PL8組最高；C18:2n-6c、n-6 PUFA 和C18:3n-3 相對含量則顯著降低（P＜0.05），且PL8組最低。

表7 各組烏鱧幼魚肝臟脂肪酸占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 7 Mass fraction of fatty acid to total fatty acid in liver of juvenile snakehead in different groups %

由表8 可知：在肌肉組織中，隨著飼料中磷脂含量的升高，C14:0、C18:1n9、C20:1n9 相對含量無顯著變化（P＞0.05）；但C16:0、C18:0、SFA、C20:4n-6、C20:5n-3、C22:6n-3、n-3 PUFA 相對含量值顯著升高（P＜0.05），且PL8 組最高；C16:1n7、MUFA、C18:2n-6c、n-6 PUFA 和C18:3n-3 相對含量顯著降低（P＜0.05），且PL8組最低。

表8 不同飼料組烏鱧幼魚肌肉脂肪酸占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 8 Mass fraction of fatty acid to total fatty acids in muscle of juvenile snakehead in different groups %

2.5 飼料磷脂水平對烏鱧幼魚肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

在脂肪生成相關(guān)基因中，飼料中磷脂水平的升高對fasn表達(dá)量無顯著影響（P＞0.05）；但顯著降低acc1的表達(dá)量，PL8 組顯著低于PL0 組（P＜0.05）（圖1(a-b)）。在脂肪分解相關(guān)基因中，PL4 組atgl基因表達(dá)量顯著高于其他組（P＜0.05），PL0組mgl的表達(dá)量顯著低于除PL2 組外的各組（P＜0.05），PL6 組的hsl表達(dá)量顯著高于其他組（P＜0.05）（圖1(c-e)）。在脂肪酸氧化相關(guān)基因中，PL6 組的aco表達(dá)量顯著高于PL0 組（P＜0.05），同時(shí)，PL6 組cpt1和pparα的表達(dá)量顯著高于其他組（P＜0.05）（圖1(f-h)）。

圖1 飼料磷脂水平對烏鱧肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of dietary phospholipids on relative expression of lipid metabolism related genes in liver of juvenile snakehead

3 討論

3.1 飼料磷脂對烏鱧幼魚生長的影響

磷脂是一種重要的結(jié)構(gòu)性和功能性脂質(zhì)[3]。魚類在幼體階段內(nèi)源性磷脂合成能力有限[5]，主要是腸上皮細(xì)胞的磷脂生物合成能力低，導(dǎo)致其對外源性磷脂的依賴性高[31]。磷脂可以增強(qiáng)腸道健康狀態(tài)，促進(jìn)脂質(zhì)從腸道轉(zhuǎn)運(yùn)到身體其他部位，從而增加生長所需能量和促進(jìn)脂肪酸的合成和沉積[32]。隨著魚類生長和發(fā)育，其對磷脂的需求量逐漸減少[4]。飼料磷脂對生長性能的影響在魚類生長早期階段更為明顯[17,33]，為探究磷脂對烏鱧幼魚生長性能的影響，本研究實(shí)驗(yàn)周期選擇為43 d。

在飼料中添加磷脂不會對大西洋鮭（Salmo salar）幼魚產(chǎn)生影響[34]，大豆卵磷脂也不影響斑點(diǎn)叉尾鮰幼魚的生存和生長[20]。本研究中，隨著飼料中外源性磷脂含量的提高，烏鱧幼魚FBW 和SGR 顯著升高，F(xiàn)CR 顯著降低，可見添加適量的磷脂可增強(qiáng)烏鱧幼魚的食欲和飼料利用率，促進(jìn)其生長發(fā)育。在牙鲆（Paralichthys olivaceus）[35]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[33]、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）[36]和軍曹魚（Rachycentron canadum）[37]幼魚中也有類似結(jié)果。然而，當(dāng)飼料中磷脂水平高于5.36%時(shí)，烏鱧幼魚生長性能開始下降，大黃魚[17]和雜交鱧[18]有類似結(jié)果，可能歸因于過量的磷脂造成營養(yǎng)失衡或者消化吸收障礙。

3.2 飼料磷脂對烏鱧幼魚脂質(zhì)代謝的影響

在哺乳動物中，磷脂可通過減少脂肪酸的合成、促進(jìn)脂肪酸氧化來減少肝臟脂肪的沉積[1]。在團(tuán)頭魴[12]和大黃魚[38]等硬骨魚的研究中可證明脂質(zhì)代謝相關(guān)基因在調(diào)節(jié)脂肪沉積中的作用。磷脂會通過抑制脂肪酸的合成，并促進(jìn)脂肪酸氧化，來抑制某些魚類的脂質(zhì)積累，如大黃魚幼魚[16]和雜交鱧[18]。本研究中，隨著飼料中大豆磷脂添加量的增加，烏鱧幼魚魚體和肝臟脂質(zhì)含量顯著降低，說明磷脂可減少肝臟的脂肪沉積，在大口黑鱸（Micropterus salmoides）幼魚[39]中有相同結(jié)果。同時(shí)全魚和肝臟的水分含量顯著升高，魚的體脂百分比與體水分之間呈現(xiàn)很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，并且不受進(jìn)食、生長和性腺發(fā)育的影響[40]，在羅非魚[19]和牙鲆[20]中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。此外，本研究檢測了烏鱧幼魚肝臟與脂肪生成（acc1、fasn）、脂肪分解（agt1、mgl和hsl）及脂肪氧化（aco、pparα和cpt1）相關(guān)的基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，隨著飼料中磷脂水平的增加，acc1基因的表達(dá)量顯著下降，而agt1、mgl、hsl、aco、pparα和cpt1基因的表達(dá)量均有不同程度的上升，表明磷脂能夠抑制烏鱧幼魚肝臟中脂肪生成途徑的活性，同時(shí)激活其脂肪分解或氧化途徑的活性，從而減少體內(nèi)脂肪的積累。

3.3 飼料磷脂對烏鱧幼魚抗氧化能力的影響

過多的肝臟脂質(zhì)沉積通常會對魚類抗氧化能力產(chǎn)生負(fù)面影響[13,41]。在草魚[1]、大黃魚[17]、團(tuán)頭魴[36]等硬骨魚中，磷脂可以提高抗氧化能力。本研究中，飼料中添加磷脂顯著降低了烏鱧幼魚肝臟中MDA 的含量，提高了總抗氧化能力及SOD 的活力，減輕了幼魚肝臟的氧化損傷，說明飼料中補(bǔ)充磷脂有助于增強(qiáng)烏鱧幼魚抗氧化能力，減少了脂質(zhì)過氧化。

3.4 飼料磷脂對烏鱧幼魚肝臟、肌肉脂肪酸組成的影響

通常養(yǎng)殖魚類的脂肪酸組成通常與實(shí)驗(yàn)飼料中的脂肪酸組成有關(guān)。在本研究中，肝臟和肌肉中C18:2n-6、C18:3n-3 和EPA（百分比脂肪酸）的濃度相對低于實(shí)驗(yàn)飼料，而樣品中的DHA 濃度顯著高于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)飼料中的DHA。淡水和鮭科魚類可有效地將C18 PUFA 轉(zhuǎn)化為長鏈PUFA[42]。本研究中，魚類樣品和實(shí)驗(yàn)飼料中脂肪酸含量的分析結(jié)果比較說明烏鱧具有長鏈PUFA 生物合成能力，并可進(jìn)行EPA 與DHA 的轉(zhuǎn)換，在之前的一些研究中也有類似的結(jié)果[14,39]。同時(shí)，本研究中飼料磷脂含量顯著提高了EPA 和DHA 等長鏈PUFA 的濃度，但降低了C18 PUFA 濃度，這表明高濃度磷脂促進(jìn)了C18 PUFA 向長鏈PUFA 轉(zhuǎn)化。值得注意的是，已證實(shí)n-3 長鏈PUFA 在緩解草魚[43]和大西洋鮭[44]等魚類脂質(zhì)沉積方面的潛在作用，本研究n-3 長鏈PUFA 濃度的增加部分說明了磷脂對脂質(zhì)積累的緩解作用。

4 結(jié)論

在飼料中補(bǔ)充大豆磷脂可提高烏鱧幼魚的生長性能，減少體內(nèi)脂肪沉積，增強(qiáng)魚體抗氧化能力，并通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)，抑制脂肪酸合成并促進(jìn)脂肪氧化分解緩解肝臟脂肪積累?；谏L指標(biāo)，本研究中烏鱧幼魚飼料適宜磷脂添加水平為5.36%。