右美托咪定通過HIF-1α信號通路對缺氧誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

李興曉 彭會麗 陳祖濤

隨著飲食結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素變化,我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,具有較高的死亡率,嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。缺氧微環(huán)境是維持癌細(xì)胞干性的外在環(huán)境,由于腫瘤細(xì)胞的快速生長,使得血液供應(yīng)難以為繼,使得腫瘤部分區(qū)域氧濃度低于正常組織。而缺氧微環(huán)境是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生耐藥性、血管再生、抑癌基因丟失等的重要因素,同時(shí)也是癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移以及嚴(yán)重不良預(yù)后的重要原因[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),缺氧環(huán)境下,乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程加快[4]。此外,缺氧環(huán)境誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌血管形成,促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[5]。缺氧微環(huán)境下,缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)增加,可促進(jìn)VEGF表達(dá)影響腫瘤血管生成[6]。有研究指出,右美托咪定對結(jié)直腸癌大鼠具有抗癌作用[7]。但是,目前右美托咪定是否對缺氧環(huán)境下結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用仍有待研究,因此本研究探討右美托咪定對缺氧環(huán)境中結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞增殖和侵襲的影響以及對HIF-1α信號通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞購自上海中國科學(xué)研究院細(xì)胞研究所。

1.2 試劑和儀器

右美托咪定購自山東辰熙醫(yī)藥科技有限公司;胎牛血清和培養(yǎng)基購自Gibco公司;Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購自美國Coring公司;HIF-1α引物序列由廣州銳博生物科技有限公司合成;逆轉(zhuǎn)錄以及PCR試劑盒購自Promega公司;兔抗人HIF-1α抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司;CCK8試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;Herocell 180二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購自上海潤度生物科技有限公司;XBL-01低氧培養(yǎng)箱購自杭州艾普儀設(shè)備有限公司;STM6光學(xué)顯微鏡購自奧林巴斯。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中,2 d更換一次培養(yǎng)液,細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時(shí)進(jìn)行消化傳代。取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性

取對數(shù)期細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板,并分成2組,常氧組和缺氧組。常氧組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、20% O2的培養(yǎng)箱中,缺氧組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、1% O2、94% N2的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白孔。分別在12 h、24 h和48 h后每孔加入CCK8工作液10 μL,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,置于酶標(biāo)儀上,測定450 nm波長處吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖活性(%)=(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔/A對照孔-A空白孔)×100%。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

取處于對數(shù)生長期的Caco2細(xì)胞,胰蛋白酶消化,制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液加入到鋪滿基質(zhì)膠的上室中,下室中加入完全培養(yǎng)基600 μL,將小室分別置于常氧和缺氧的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后,取出小室,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 qRT-PCR檢測HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平

將細(xì)胞按照1.4的方法進(jìn)行分組處理,Trizol法提取細(xì)胞中總RNA水平,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,取1 μg cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系設(shè)為20 μL:2 μL cDNA,10 μLSYBR Green Mix,0.4 μL ROX Reference Dye,上下游引物各0.8 μL,6 μL無核酶水。95℃預(yù)變性 5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。2-△△CT法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白印跡法檢測HIF-1α和VEGF 蛋白表達(dá)水平

將細(xì)胞按照1.4的方法進(jìn)行分組處理,RIPA裂解液裂解,離心取上清液,BCA法測定蛋白濃度,蛋白樣品煮沸變性。50 μg蛋白上樣電泳,將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉,4 ℃ HIF-1α和GAPDH抗體孵育過夜,二抗孵育,ECL法顯色,Image J分析條帶灰度值,HIF-1α/VEGF蛋白表達(dá)水平=HIF-1α/VEGF條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.8 右美托咪定對Caco2細(xì)胞增殖、侵襲和HIF-1α及VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

1.8.1 細(xì)胞分組 取對數(shù)期Caco細(xì)胞,制成1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,取100 μL接種于96孔板,將培養(yǎng)板置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長后,換用含不同濃度右美托咪定的培養(yǎng)基(0,5,10,20,40 μmoL)培養(yǎng)24 h。

1.8.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性 取1.8.1中經(jīng)不同濃度右美托咪定培養(yǎng)的細(xì)胞,按照1.4的方法檢測細(xì)胞增殖活性。

1.8.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 取1.8.1中經(jīng)不同濃度右美托咪定培養(yǎng)的細(xì)胞,按照1.5的方法檢測細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8.4 qRT-PCR檢測HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平 取1.8.1中經(jīng)不同濃度右美托咪定培養(yǎng)的細(xì)胞,按照1.6的方法檢測HIF-1α mRNA表達(dá)水平。

1.8.5 蛋白印跡法檢測HIF-1α和VEGF 蛋白表達(dá)水平 取1.8.1中經(jīng)不同濃度右美托咪定培養(yǎng)的細(xì)胞,按照1.6的方法檢測HIF-1α 蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 缺氧條件下細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果

缺氧組細(xì)胞在12 h、24 h和48 h的增殖活性均顯著高于常氧組(P<0.05)。見表2。

表2 細(xì)胞增殖活性比較

2.2 缺氧條件下侵襲細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果

缺氧組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著多于常氧組(P<0.05)。見表3。

表3 侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.3 缺氧條件下HIF-1α 和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果

缺氧組HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于常氧組(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 缺氧條件下細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)水平

表4 HIF-1α 和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平

2.4 右美托咪定對細(xì)胞增殖活性的影響

細(xì)胞增殖活性隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具有濃度依賴性(P<0.05),見表5。

表5 不同濃度右美托咪定對細(xì)胞增殖活性的影響

2.5 右美托咪定對侵襲細(xì)胞數(shù)的影響

侵襲細(xì)胞數(shù)隨右美托咪定濃度的升高逐漸減少,且具有濃度依賴性(P<0.05),見表6。

表6 不同濃度右美托咪定對侵襲細(xì)胞數(shù)的影響

2.6 右美托咪定對HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具有濃度依賴性(P<0.05)。見表7,圖2。

圖2 不同濃度右美托咪定對HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

表7 不同濃度右美托咪定對HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存的內(nèi)環(huán)境,腫瘤生長過程中,腫瘤細(xì)胞的快速增殖超過腫瘤血管的新生速度,腫瘤細(xì)胞周圍毛細(xì)血管內(nèi)氧含量不能滿足腫瘤生長的需求,導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)氧和營養(yǎng)成分供應(yīng)不足,因此形成腫瘤缺氧微環(huán)境[8]。HIF-1α作為低氧適應(yīng)性介導(dǎo)者,通過激活血管形成信號通路相關(guān)基因VEGF,可促進(jìn)腫瘤血管新生,進(jìn)而為腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲提供能量基礎(chǔ)[9]。研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α可促進(jìn)缺氧環(huán)境下胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[10]。Li等研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α和VEGF活化可促進(jìn)血管生成,從而加快肺癌進(jìn)程[11]。miR-148a通過下調(diào)缺氧環(huán)境中HIF-1α和VEGF的高表達(dá)狀態(tài),可抑制血管生成和重塑,誘導(dǎo)結(jié)腸癌凋亡,發(fā)揮抗結(jié)腸癌的作用[12]。本研究將結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞分為常氧組和缺氧組,姐測結(jié)果顯示:缺氧組細(xì)胞在12 h、24 h和48 h的增殖活性均高于常氧組,侵襲細(xì)胞數(shù)少于常氧組,說明缺氧微環(huán)境下結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)。與常氧組比較,缺氧組細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均降低,說明缺氧環(huán)境下,HIF-1α/VEGF信號通路被激活。

右美托咪定在抗腫瘤中的作用以多有報(bào)道,Zhang等[13]研究表明,右美托咪定可抑制食管癌生長和轉(zhuǎn)移。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn),右美托咪定通過誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)揮抗胃癌作用。此外,右美托咪定可抑制缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖活性和血管生成能力[15]。本研究中在缺氧條件下,細(xì)胞增殖活性、侵襲細(xì)胞數(shù)隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具濃度依賴性,說明右美托咪定可抑制缺氧誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。多項(xiàng)研究表明,右美托嘧啶可調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF表達(dá)活性,在糖尿病腎損傷大鼠模型中,右美托咪定可通過下調(diào)HIF-1α表達(dá)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),從而改善肺功能[16]。Wang等[17]研究表明,右美托咪定通過抑制HIF-1α表達(dá)可改善缺血再灌注引起的腦損傷。本研究結(jié)果顯示:HIF-1α和VEGF mRNA水平和蛋白表達(dá)水平隨右美托咪定濃度的升高逐漸降低,且具有濃度依賴性。說明右美托咪定可抑制缺氧條件下結(jié)直腸癌細(xì)胞HIF-1α和VEGF的活性。

綜上所述,右美托咪定可抑制缺氧誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲,其可能是通過下調(diào)癌細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的表達(dá)發(fā)揮作用,為臨床治療結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。但是本研究仍存在不足之處,首先對右美托咪定在缺氧條件下發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的具體機(jī)制研究不夠深入,下一步將探討其是否通過調(diào)節(jié)HIF-1α對血管生成具有影響。其次,本研究僅限于細(xì)胞水平,下一步將從動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。