高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定金銀花中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的殘留量

林俊燕，馬恩耀，2，周勁松，2，孫心恒，羅麗娟，盧敏茹

（1.廣東漢潮中藥科技有限公司/廣東省傳統(tǒng)中藥創(chuàng)新中心，廣州 510000；2.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣州 510360）

由于毒副作用小，符合回歸自然的發(fā)展理念，中藥材越來(lái)越受到人們的歡迎，使得中藥材的生產(chǎn)量和消費(fèi)量不斷增加。中醫(yī)藥事業(yè)在中國(guó)發(fā)展迅速，已經(jīng)形成了基于《中華人民共和國(guó)藥典》藥品標(biāo)準(zhǔn)體系。常用中藥材大部分都是通過(guò)種植獲得。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（Plant growth regulator，PGR）是可以顯著改變植物生長(zhǎng)發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)［1］，根據(jù)不同功效可分為三大類(lèi)：植物生長(zhǎng)抑制劑、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑和植物生長(zhǎng)延緩劑。與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)相比，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有高效、低毒的特性，在促產(chǎn)增量、改質(zhì)抗逆等方面發(fā)揮了重要作用［2］。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑已廣泛應(yīng)用于中藥材的種植栽培，有研究發(fā)現(xiàn)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑已經(jīng)在幾種根及根莖類(lèi)藥材種植過(guò)程中大量使用［3］。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用不合理會(huì)導(dǎo)致其在中藥材中的殘留，存在降低中藥材活性成分含量和危害食用者健康的風(fēng)險(xiǎn)［4-6］。中國(guó)現(xiàn)已制定食品類(lèi)產(chǎn)品中部分植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763—2021）［7］，而中藥材中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的殘留限量與檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)尚不明確，導(dǎo)致中藥材種植中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用日漸增多，嚴(yán)重影響了中藥材的質(zhì)量和安全，造成較大隱患。因此，建立相應(yīng)的檢測(cè)方法是十分必要的。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)分析方法（化學(xué)法、電位滴定法）和色譜法（氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等），其中LCMS/MS 以其可檢測(cè)成分微量、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，已成為檢測(cè)農(nóng)藥殘留的主要方法［8］。本研究針對(duì)實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，金銀花可能使用過(guò)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行栽培，產(chǎn)品存在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留將影響產(chǎn)品的質(zhì)量安全，結(jié)合實(shí)際工作，建立一種快速、簡(jiǎn)單的LC-MS/MS 方法，用于金銀花藥材中8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑農(nóng)藥的殘留量測(cè)定，以滿足日常檢驗(yàn)工作。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

金銀花藥材購(gòu)自藥材市場(chǎng)。

Agilent 1290-6470 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；TDL-400R 型離心機(jī)；ML203T 型天平；EOAA-VM-B型渦旋儀；數(shù)控超聲波清洗器。

苯醚甲環(huán)唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、蕓苔素內(nèi)酯、對(duì)硝基苯酚鈉、脫落酸（純度大于99.0%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆患姿幔ㄉV純），阿拉丁；甲酸銨（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水。

1.2 供試品溶液制備方法

取樣品粉末（過(guò)三號(hào)篩）1.0 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL 離心管中，加入含1%甲酸的乙腈10 mL，渦旋1 min后，超聲提取10 min，10 000 r/min下離心5 min，取1 mL 上清液，加水1 mL，混合液經(jīng)渦旋1 min 后過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

1.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 分別精密稱(chēng)取8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，密封儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。

1.3.2 混合對(duì)照品工作溶液的制備 精密量取苯醚甲環(huán)唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、對(duì)硝基苯酚鈉對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1 mL，蕓苔素內(nèi)酯、脫落酸對(duì)照品溶液0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成苯醚甲環(huán)唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、對(duì)硝基苯酚鈉濃度為10 μg/mL，蕓苔素內(nèi)酯、脫落酸濃度為50 μg/mL 的混合對(duì)照品工作溶液，密封儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取金銀花空白基質(zhì)藥材，按照“1.2”的制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液，使用時(shí)用空白基質(zhì)提取溶液稀釋混合對(duì)照品溶液配成苯醚甲環(huán)唑、多效唑、烯效唑、矮壯素、氯化膽堿、對(duì)硝基苯酚鈉濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L，蕓苔素內(nèi)酯、脫落酸濃度為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜測(cè)定條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相：A 為乙腈；B 為5 mmol/L 甲酸銨含0.1%甲酸水；0～2.5 min，5%A→15%A；2.5～5.0 min，15%A→70%A；5.0～7.0 min，70%A→80%A；7.0～11.0 min，80%A→95%A；11.0～11.5 min，A 為95%；流速為0.30 mL/min；進(jìn)樣量為5.00 μL；柱溫為40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子檢測(cè)模式下，使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行測(cè)定。離子源溫度為250 ℃；鞘氣溫度為350 ℃；干燥溫度為350 ℃；霧化器壓力為60 psi；正離子模式毛細(xì)管電壓為4 000 V；負(fù)離子毛細(xì)管電壓為3 500 V。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 線性和范圍 為減少基質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，采用金銀花空白基質(zhì)提取液加標(biāo)的方式制備系列濃度的混合對(duì)照品溶液，使標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質(zhì)干擾。將不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“1.4”中的分析條件進(jìn)行測(cè)定，以各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度（X）為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線。

獲得由中國(guó)烹飪協(xié)會(huì)頒發(fā)的“2017年度百家中國(guó)好食堂”獎(jiǎng)項(xiàng)；被洪山區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為A級(jí)餐飲服務(wù)食品安全等級(jí)……文華學(xué)院在保障校園食品安全方面落在實(shí)處，科學(xué)管理與人性化服務(wù)相結(jié)合，俘獲了廣大師生的味蕾，讓人贊不絕口。

1.5.2 檢測(cè)限和定量限 取基質(zhì)混合對(duì)照溶液，稀釋后注入儀器進(jìn)行分析，以信噪比（S/N）為3 時(shí)的濃度所對(duì)應(yīng)的含量為檢測(cè)限（LOD），以信噪比（S/N）為10 時(shí)的濃度所對(duì)應(yīng)的含量為定量限（LOQ），確定8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)限和定量限。

1.5.3 重復(fù)性 精密稱(chēng)取同一批金銀花藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）6 份（每份1.0 g），分別添加相同濃度的混合對(duì)照品溶液，按“1.2”的方法制備后按“1.4”的條件分析，計(jì)算6 次結(jié)果的RSD。

1.5.4 加樣回收率 精密稱(chēng)取金銀花空白樣品9 份（每份1.0 g），分別添加低、中、高3 個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，每種濃度各添加3 份，按“1.2”的方法制備后按“1.4”的條件分析，計(jì)算這3 組樣品的加樣回收率，分析其RSD。

1.5.5 樣品測(cè)定 利用建立的方法對(duì)25 批次金銀花藥材樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 對(duì)8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的色譜條件進(jìn)行選擇和優(yōu)化，結(jié)果表明這8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在C18 色譜柱得到很好的保留。以甲醇作為有機(jī)相的流動(dòng)相時(shí)，液相系統(tǒng)壓力較大，色譜峰型較寬，而采用乙腈作為有機(jī)相的流動(dòng)相時(shí)，液相系統(tǒng)壓力合適，色譜峰尖銳對(duì)稱(chēng)。以乙腈+5 mmol/L 甲酸銨含0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，可以達(dá)到滿意的分離效果，8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能與基質(zhì)雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)良好的分離，如圖1 所示。

圖1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑10.0 μg/L 混合對(duì)照品工作溶液MRM 色譜

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 根據(jù)8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)，在ESI 源中將一定濃度的混合對(duì)照品溶液注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，在得到的碎片離子中選取其中2 對(duì)離子作為監(jiān)測(cè)離子對(duì)，優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）離子對(duì)碰撞能和其他質(zhì)譜參數(shù)（表1）。

表1 多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)分析參數(shù)

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性和范圍 以各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度（X）為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線，觀察其線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可以看出，各化合物在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑各化合物的線性回歸方程和范圍

2.2.2 檢測(cè)限和定量限 8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)限（LOD）為0.000 9～0.045 6 mg/kg，定量限（LOQ）為0.001 8～0.152 0 mg/kg，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)限和定量限

2.2.3 重復(fù)性 經(jīng)測(cè)定，結(jié)果顯示6 份同一批金銀花藥材粉末的RSD為1.08%～8.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率 結(jié)果顯示，8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的加標(biāo)回收率在71.45%～120.37%，RSD在2.33%～9.48%。結(jié)果表明，本研究建立的8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留測(cè)定法的加樣回收率良好，可用于金銀花藥材中8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的定量分析。

2.3 樣品測(cè)定

利用建立的方法對(duì)25 批次金銀花藥材樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出情況見(jiàn)表4。由表4 可知，所有批次金銀花藥材未檢出氧化膽堿、蕓苔素內(nèi)脂、對(duì)硝基苯酚鈉。有13 批次的樣品檢出有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留，占總批數(shù)的52%，濃度在3.58～133.59 μg/kg，其中多效唑檢出率最高，其次為烯效唑。雖然這次考察的基數(shù)較小，但是也可以在一定程度上反映金銀花在種植中使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的情況，存在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留，影響產(chǎn)品的質(zhì)量安全。結(jié)果表明，有必要對(duì)已經(jīng)被登記在中藥材種植使用的農(nóng)藥制定相應(yīng)的殘留限量，確保這些藥材的質(zhì)量安全。

表4 金銀花藥材樣品植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的殘留量測(cè)定結(jié)果（單位：μg/kg）

3 討論

金銀花屬于藤本植物，它的孕蕾及開(kāi)花均是通過(guò)生殖生長(zhǎng)來(lái)完成的。土壤環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí)，植物的次生代謝過(guò)程就會(huì)受到促進(jìn)或抑制。作為金銀花的主要有效成分綠原酸，《中華人民共和國(guó)藥典（2020 年版）》［9］對(duì)其含量有規(guī)定，綠原酸屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，其生物合成與積累是金銀花植株長(zhǎng)期適應(yīng)外界環(huán)境條件的結(jié)果。

本研究考察了25 批次的金銀花藥材樣品，有13批次的樣品檢出植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留，檢出率達(dá)52%，其中檢出頻次較高的是多效唑、烯效唑和矮壯素。

多效唑、烯效唑以及矮壯素都具有抑制植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的作用，在金銀花孕蕾期間，噴施一定濃度的多效唑、烯效唑以及矮壯素能抑制金銀花的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)金銀花的生殖生長(zhǎng)。徐迎春等［10］通過(guò)研究金銀花噴施不同濃度的多效唑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多效唑可以抑制花枝的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，增加其葉面積和產(chǎn)量，同時(shí)可以提高金銀花中綠原酸的含量。有研究表明，矮壯素、多效唑等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以提高金銀花的單株產(chǎn)量，且調(diào)節(jié)劑施用的濃度與施用時(shí)間可以改善金銀花的品質(zhì)［11］。

本方法樣品經(jīng)1%甲酸乙腈提取后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分離和測(cè)定植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。方法學(xué)考察及樣品測(cè)定證明，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，并具有良好的精密度與準(zhǔn)確度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求，可用于金銀花藥材中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留的定性和定量分析，為金銀花藥材中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑限量的設(shè)定提供技術(shù)支持。