植物乳桿菌 (LP HMX-3)對(duì)仿刺參生長(zhǎng)、消化、免疫和腸道菌群的影響

王夢(mèng)美，呂成杰，楊頂瓏*，趙建民

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003)

仿刺參(Apostichopus japonicus)隸屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)，具有食用和藥用雙重價(jià)值[1]，是我國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種[2]。近年來(lái)，腐皮綜合征等疾病暴發(fā)嚴(yán)重阻礙了仿刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。一般而言，抗生素和化學(xué)藥物是防控病害的重要手段，但過(guò)度使用抗菌藥物往往導(dǎo)致病原菌的進(jìn)化、藥物殘留以及環(huán)境污染問(wèn)題，大大增加了人類的健康風(fēng)險(xiǎn)[3]。作為病害防控的重要手段，益生菌因其具有無(wú)毒、無(wú)抗藥性、無(wú)殘留等特點(diǎn)，可作為一種環(huán)境友好的飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于仿刺參的養(yǎng)殖業(yè)中。

根據(jù)FAO/WHO 組織的定義，益生菌是一種在合適劑量對(duì)宿主健康有益的活性微生物。其中，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)是一種桿狀、革蘭氏陽(yáng)性、不形成芽孢的兼性厭氧益生菌，能產(chǎn)生一些活性物質(zhì)，從而改善水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[4]。例如，其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等物質(zhì)可抑制病原菌的生長(zhǎng)[5]，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用阻礙病原體在腸上皮上的黏附[6]。目前，已有關(guān)于植物乳桿菌在魚類和甲殼類水產(chǎn)動(dòng)物中的益生作用研究。在細(xì)鱗鮭 (Brachymystax lenok) 中，植物乳桿菌能顯著增加細(xì)鱗鮭的特定生長(zhǎng)率，有效促進(jìn)其生長(zhǎng)[7]；夏雨等[6]通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法、熒光染色法與分光光度法篩選，發(fā)現(xiàn)3 株植物乳桿菌均對(duì)凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei) 的致病菌有抑制作用，并通過(guò)有效黏附于對(duì)蝦腸黏液抑制病原菌的生長(zhǎng)和定殖。此外，植物乳桿菌還能增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫反應(yīng)，并積極調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡。例如，Van Nguyen等[8]將熱滅活的植物乳桿菌菌株 L-137 添加于尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus) 飼料中投喂尼羅羅非魚，發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)頭腎細(xì)胞的吞噬活性和血清中溶菌酶活性顯著提高；Zheng 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌無(wú)細(xì)胞提取物和發(fā)酵上清液能積極調(diào)節(jié)凡納濱對(duì)蝦的腸道微生物菌群，具有較好的益生潛力。上述研究顯示，植物乳桿菌具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高免疫和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較大的應(yīng)用潛力。然而，植物乳桿菌對(duì)仿刺參的益生作用和機(jī)制鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期從仿刺參腸道中分離獲得一株植物乳桿菌，命名為L(zhǎng)P HMX-3。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明其具有一定的抑菌活性和耐鹽性，可在30 的鹽度下生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在飼料中添加不同濃度(105和107CFU/g)的LP HMX-3，研究其對(duì)仿刺參生長(zhǎng)性能、消化酶活性、免疫能力和腸道菌群的影響，以明確植物乳桿菌在仿刺參體內(nèi)的益生效果及較優(yōu)添加量，并為植物乳桿菌在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用仿刺參幼參購(gòu)自煙臺(tái)市牟平區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)開始前，將仿刺參置于(17±2) °C 的海水循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)2 周以適應(yīng)環(huán)境。暫養(yǎng)期間保持溶氧在5 mg/L 以上，每日換水后投喂基礎(chǔ)飼料(煙臺(tái)蓬安源海洋食品有限公司)和海泥，飼料日投喂量為仿刺參體重的2%～3%(不含海泥)。

實(shí)驗(yàn)所用LP HMX-3 為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，從仿刺參腸道中篩選獲得，經(jīng)16SrDNA測(cè)序鑒定其為植物乳桿菌。將保種的LP HMX-3 按2%的比例接種到MRS 培養(yǎng)基中，28 °C 靜置培養(yǎng)24 h后逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。4 °C，4 000 r/min 離心10 min分鐘，收集菌體。用無(wú)菌生理鹽水沖懸，調(diào)整至OD600=1，采用平板計(jì)數(shù)法[9]計(jì)算濃度，逐級(jí)稀釋至107和105CFU/mL 后添加到仿刺參飼料中。含菌餌料現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

仿刺參暫養(yǎng)2 周后，挑選健康、體重差異較小的幼參[(4.22±0.05) g]隨機(jī)分散到9 個(gè)玻璃缸(160 L)中，每缸30 頭。實(shí)驗(yàn)設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組C組(0 CFU/g)和2 個(gè)處理組LL 組(105CFU/g)、LM 組(107CFU/g)，每組3 個(gè)重復(fù)。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行8 周，期間每天換水1 次，每次1/3～1/2 水量，并吸除殘餌和糞便以及記錄仿刺參健康狀況，每2 周測(cè)定仿刺參生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停食 24 h。撈取每缸全部的仿刺參，分別記錄總數(shù)并稱重，計(jì)算增重率(weight gain rate，WGR)、特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR)和存活率(survival rate，SR)等。從C、LL 和LM 組的每個(gè)平行取10 頭仿刺參用于樣品采集。使用無(wú)菌注射器自仿刺參腹腔抽取體腔液10 mL，并經(jīng)雙層300 目篩絹過(guò)濾。其中，2 mL 體腔液于4 °C、800 r/min 下離心10 min 收集體腔細(xì)胞，并加入1 mL RNAiso Plus(TaKaRa，日本)，用于測(cè)定免疫相關(guān)基因表達(dá)量，每組4 個(gè)平行；剩余體腔液用于免疫酶活性測(cè)定，每組6個(gè)平行。此外，收集仿刺參腸道組織，用無(wú)菌PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)沖洗后用濾紙吸干，用于消化酶活測(cè)定，每組6 個(gè)平行。同時(shí)，收集仿刺參腸道，用于腸道菌群的測(cè)定，每組5 個(gè)平行。樣品經(jīng)液氮速凍后，均保存于-80 °C 待測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

生長(zhǎng)性能測(cè)定 存活率(SR，%)=Ni/N0×100%；

增重率(WGR，%)=(Wi-W0)/W0×100%；

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=(LnWi-LnW0)/t×100%。式中，Ni是飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活的仿刺參數(shù)量(頭)，N0是飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中仿刺參的初始數(shù)量；Wi和W0分別為仿刺參的最終體重和初始體重(g)；t為養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的天數(shù)(d)。

酶活性測(cè)定 使用南京建成生物工程研究所的試劑盒(A060-2-2、A059-1-1、A001-1-2、A007-1-1、C016-1-1、A080-2-2 和A054-2-1)分別測(cè)定仿刺參體腔液中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性以及腸道中淀粉酶(AMS)、胰蛋白酶(TRP)和脂肪酶(LPS)的活性；采用碧云天生物技術(shù)有限公司的BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012)測(cè)定蛋白濃度。

免疫相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定 采用TRIzol 法提取仿刺參體腔細(xì)胞的總RNA，用0.1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))檢測(cè)RNA 完整性和純度。以RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；贏BI 7 500 基因定量實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)(Thermo Fisher 公司，美國(guó))，采用SYBR green Ⅰ方法測(cè)定免疫基因Aj-p105、Aj-C3、Aj-catalase 的相對(duì)表達(dá)量(表1)。定量PCR 的反應(yīng)體系為20 μL，其中各0.4 μL 的上下游引物(10 μmol/L)、6 μL 模板、10 μL SYBR MixⅠ和3.2 μL 的DEPC 水。反應(yīng)程序?yàn)?0 °C 20 s，95 °C 7 min；95 °C 變 性10 s，60 °C 退 火30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 內(nèi)參和目的基因定量引物Tab.1 Primers of internal reference and target genes

腸道微生物檢測(cè) 使用FastDNA SPIN Kit for Feces(MP Biomedical)試劑盒提取仿刺參腸道微生物的總DNA。使用引物515F(5′-GTGCCA GCMGCCGCGGTAA-3 ′)和806R(5 ′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增16SrDNA的V4 區(qū)。用1%瓊脂糖凝膠電泳將擴(kuò)增獲得的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)并切膠回收，精確定量后在Novogene 的Illumina MiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序并分析。具體過(guò)程參照唐楊等[10]進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示。通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，當(dāng)不同處理組差異顯著(P<0.05)時(shí)，采用Duncan 氏法作多重比較分析。本研究獲得了寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員嚴(yán)格遵守GBT2018 倫理規(guī)范，并按照寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參生長(zhǎng)性能的影響

飼喂不同濃度的LP HMX-3 對(duì)仿刺參生長(zhǎng)指標(biāo)和存活的影響結(jié)果顯示，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有組的仿刺參存活率沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；LL組和LM 組的終體重、增重率以及特定生長(zhǎng)率均顯著高于C 組(P<0.05)，且LL 組的生長(zhǎng)指標(biāo)高于LM 組，但LL 組和LM 組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(表2)。由結(jié)果可以看出，飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用，添加濃度對(duì)仿刺參生長(zhǎng)影響不大。

表2 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effects of LP HMX-3 supplementation on growth performance of A. japonicus

2.2 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參腸道消化酶活性的影響

LM 組腸道的脂肪酶活性顯著高于LL 組和C 組(P<0.05)；LL 組的淀粉酶活性最高，且顯著高于LM 組和C 組(P<0.05)；各組之間的胰蛋白酶活性沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(表3)。結(jié)果表明，飼料中添加LP HMX-3 有助于提高仿刺參腸道中的消化酶活性。

表3 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參腸道消化酶活性的影響Tab.3 Effects of LP HMX-3 supplementation on digestive enzyme activity of intestine of A. japonicus

2.3 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參體腔液免疫相關(guān)酶活性的影響

飼喂不同濃度的LP HMX-3 可以不同程度的提高仿刺參非特異性免疫酶活性(表4)。LL 組和LM 組體腔液的堿性磷酸酶活性顯著高于C 組(P<0.05)，但LL 組和LM 組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；LM 組的酸性磷酸酶活性顯著高于C 組(P<0.05)，LL 組和LM 組的差異不顯著(P>0.05)；各組的超氧化物歧化酶活性沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；LL 組的過(guò)氧化氫酶活性最高，其次是LM 組，2 組之間差異顯著且均顯著高于C 組(P<0.05)。

表4 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參體腔液免疫酶活性的影響Tab.4 Effects of LP HMX-3 supplementation on immune enzyme activity of coelomic fluid of A. japonicus

2.4 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞中免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

飼料中添加LP HMX-3 可以不同程度的提高仿刺參體腔細(xì)胞中免疫相關(guān)基因表達(dá)量。其中，LL 組和LM 組中體腔細(xì)胞Aj-p105 表達(dá)量顯著高于C 組(P<0.05)，LL 組和LM 組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；LL 組中仿刺參體腔細(xì)胞Aj-catalase基因表達(dá)水平最高，其次是LM 組，2 組之間差異顯著且均顯著高于C 組(P<0.05)。LL 組和LM組中仿刺參體腔細(xì)胞Aj-C3 基因表達(dá)水平高于C 組，且LM 組與C 組差異顯著(P<0.05)(圖1)。

圖1 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響不同處理組間不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig.1 Effects of LP HMX-3 supplementation on the expression of immune-related genes in coelomic cells of A. japonicus Different letters between different treatments indicate significant difference (P<0.05).

2.5 腸道菌群分析

α 多樣性分析 從仿刺參腸道樣本中獲得的有效序列為61 308～69 999 條，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分析，可將其歸為1 649～5 574 個(gè)操作分類單元(OTUs)。仿刺參腸道菌群的α 多樣性以O(shè)bservedspecies、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、PD_whole_tree 方法進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，LL 組和LM 組 的Observed-species、Chao1、ACE 和PD_whole_tree 指數(shù)均顯著高于C 組(P<0.05)，而且LL 組大于LM 組，但2 組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；LL 組 和LM 組 的Shannon、Simpson 指 數(shù)高于C 組，但各組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。α 多樣性結(jié)果表明，LL 和LM 組腸道中的微生物豐富度和均勻度都高于C 組，且LL 組略高于LM 組(表5)。

表5 飼料中添加LP HMX-3 對(duì)仿刺參腸道菌群α 多樣性的影響Tab.5 Effects of LP HMX-3 supplementation on α diversity of intestinal flora of A. japonicus

β 多樣性分析 主坐標(biāo)分析(PCoA)可以用來(lái)指示不同樣本的群落變化?；诩訖?quán)的Unifrac 距離的PCoA 和非加權(quán)的Unifrac 距離的PCoA 表明，LL 組和LM 組的仿刺參腸道菌群相似，均與C 組不同(圖2)。聚類分析也顯示了相似的趨勢(shì)，基于加權(quán)的Unifrac 距離矩陣和非加權(quán)的Unifrac 距離矩陣的UPGMA 聚類分析可以看出，LL 和LM 聚為一個(gè)分支，然后與C 組聚為一支，表明LL 組與LM 組中的細(xì)菌群落相似性高于C組(圖3)。由Veen 圖可知，各組的仿刺參腸道樣本中共有的OTU 有726 個(gè)，LL 組特有的OUT 數(shù)量最多(1 564 個(gè))，其次是LM 組(1 203 個(gè))，最少的為C 組(690 個(gè))。β 多樣性分析結(jié)果顯示，LL組和LM 組的物種組成結(jié)構(gòu)相似且菌群多樣性高于C 組。腸道菌群的多樣性分析表明飼料中添加LP HMX-3 有助于提高仿刺參腸道菌群的菌落多樣性，添加量對(duì)其菌群多樣性和豐富度影響不大。

圖2 仿刺參腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析 (a) 基于加權(quán) Unifrac 距離(b)基于未加權(quán)Unifrac 距離Fig.2 Principal Co-ordinates Analysis (PCoA) of the bacterial community from A. japonicus intestine (a)based on weighted Unifrac diatance (b) based on unweighted Unifrac diatance

圖3 仿刺參腸道細(xì)菌群落的UPGMA 聚類樹 (a) 基于加權(quán)Unifrac 距離 (b) 基于未加權(quán)Unifrac 距離樹枝長(zhǎng)度代表樣本間的距離。Fig.3 UPGMA clustering tree of the bacterial community from A. japonicus intestine (a) based on weighted Unifrac diatance (b) based on unweighted Unifrac diatanceThe branch length represents the distance between samples.

腸道細(xì)菌群落組成 仿刺參腸道微生物可歸于79 個(gè)門 類、151 個(gè) 綱、327 個(gè) 目、498 個(gè)科、1 116 個(gè)屬。門水平上，在所有組中，變形菌門(Proteobacteria) 的豐度最高，其次是厚壁菌門(Firmicutes) 。變形菌門的豐度在C 組最高，其次是LM 組，且C 組與LL 組和LM 組有顯著差異(P<0.05)；厚壁菌門的豐度在LL 組最高，且與C組有顯著差異(P<0.05)，其次是LM 組；而LL 組和LM 組擬桿菌門 (Bacteroidota)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria) 和Campilobacterota 的豐度顯著高于C 組(P<0.05)，但在2 個(gè)處理組中沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。另外，LL 組和LM 組放線菌門(Actinobacteriota) 以及酸桿菌門 (Acidobacteriota)的豐度高于C 組(圖4，表6)。屬水平上，與對(duì)照組相比，LL 組和LM 組中潛在的益生菌相關(guān)屬的豐度增加，包括乳桿菌屬 (Lactobacillus)、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、鏈球菌屬 (Streptococcus)和梭菌屬 (Clostridium_sensu_stricto_1)(圖5)。

圖4 仿刺參腸道中門水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖Fig.4 Column chart of relative species abundance at the phylum level of A. japonicus intestine

圖5 仿刺參腸道中屬水平上的物種豐度熱圖Fig.5 Heatmap analysis of the species abundance at the genus level in the gut of A. japonicus

表6 仿刺參腸道中門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群分布Tab.6 Distribution of dominant microflora at the phylum level of A. japonicus intestine

3 討論

益生菌作為抗生素的替代品被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，其具有改變宿主或相關(guān)環(huán)境微生物群落的潛力，并可通過(guò)提高飼料利用率、生長(zhǎng)、免疫狀態(tài)和存活等方式對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響[11-13]。

在本研究中，飼料中添加105和107CFU/g 的植物乳桿菌LP HMX-3 有助于提高仿刺參的生長(zhǎng)性能，且105CFU/g 的添加量具有更優(yōu)的效果。這一結(jié)果與以往在仿刺參[13]和尼羅羅非魚(O.niloticus)[14-15]中的研究結(jié)果具有一定的差異性。在仿刺參中，Li 等[13]發(fā)現(xiàn)2 株海水魚源乳酸菌可顯著提高海參的生長(zhǎng)性能，其添加量為109CFU/g，研究結(jié)果的差異可能與菌種的來(lái)源、菌的添加量等因素有關(guān)。一般而言，植物乳桿菌可通過(guò)產(chǎn)生氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，作為養(yǎng)殖生物的營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑。另一方面，植物乳桿菌能夠刺激機(jī)體細(xì)胞分泌消化酶類，幫助水產(chǎn)動(dòng)物加強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用[16-18]。本研究顯示，仿刺參飼料中添加LP HMX-3 之后，在一定程度上提高了機(jī)體淀粉酶和脂肪酶的活性，提高了仿刺參對(duì)飼料的消化吸收利用率。

作為海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，仿刺參缺乏獲得性免疫，主要依靠先天免疫系統(tǒng)來(lái)抵御病原侵襲。以往研究表明，AKP、ACP、SOD 和CAT 在棘皮動(dòng)物的免疫防御中起重要作用[19-20]，其中，ACP 和AKP 能殺死和消化微生物和外來(lái)物質(zhì)。在本研究中，投喂了含植物乳桿菌LP HMX-3 的仿刺參AKP 和ACP 活性均有不同程度的提高，這與 Li等[13]、Yang 等[19]和宮魁等[21]對(duì)海參的研究報(bào)道相似。值得注意的是，機(jī)體免疫活性的高低與益生菌的添加水平存在關(guān)聯(lián)性。例如，AKP 活性在105CFU/g 添加組最高，而AKP 活性在107CFU/g添加組最高，這說(shuō)明免疫力的高低與益生菌的種類和添加量密切相關(guān)。此外，SOD 和CAT 是2 種抗氧化酶，是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)重要的組成部分[22-23]，其在防止細(xì)胞損傷和衰老方面亦起著關(guān)鍵作用[19]。在本研究中，仿刺參飼糧中添加植物乳桿菌LP HMX-3 后，CAT 活性顯著升高，SOD水平?jīng)]有顯著變化。這可能是因?yàn)镠2O2作為SOD 的作用產(chǎn)物，其可能會(huì)抑制SOD 水平[24]，而對(duì)CAT 活性有刺激作用[25]。以上結(jié)果可能預(yù)示了LP HMX-3 對(duì)仿刺參具有重要的免疫調(diào)控作用。在仿刺參中，p105[26]、catalase[27]、補(bǔ)體成分3[28]是重要的細(xì)胞免疫因子，在免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。例如，張斯等[29]發(fā)現(xiàn)Aj-C3 在仿刺參體腔細(xì)胞中的表達(dá)量最高，可能是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量較高、較為核心的成員。在本研究中，添加植物乳桿菌后，仿刺參的Aj-p105、Aj-catalase 和Aj-C3 表達(dá)量升高，說(shuō)明LP HMX-3 在一定程度上增強(qiáng)了仿刺參的免疫力。另外，有人認(rèn)為植物乳桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖可能有助于機(jī)體免疫刺激[30]，動(dòng)物腸道中的有益菌群也能刺激免疫細(xì)胞分化，激活免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)宿主的免疫力，促進(jìn)機(jī)體健康生長(zhǎng)[31]。

腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能對(duì)仿刺參生長(zhǎng)具有重要意義，與仿刺參的營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫防御等[32]生理過(guò)程密切相關(guān)。其中，腸道微生物多樣性起著重要作用，多樣性降低表明腸道微生物群落穩(wěn)定性變差，養(yǎng)殖生物患病風(fēng)險(xiǎn)增大，朱文根等[33]研究結(jié)果顯示，草魚(Ctenopharyngodon idella)呼腸孤病毒感染組的Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)以及Pielou 均勻度顯著低于對(duì)照組。黃學(xué)敏等[34]同樣發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦健康苗池的Shannon 指數(shù)和Pielou 均勻度均顯著高于發(fā)病苗池，表明更高的菌群α 多樣性有利于水體環(huán)境穩(wěn)定和蝦幼體健康,反之可能易造成幼體發(fā)病。在本研究中，105CFU/g 組 和107CFU/g 組 的Observed-species、Chao1、ACE 和PD_whole_tree 等α 多樣性指標(biāo)顯著高于對(duì)照組，這表明飼糧中添加植物乳桿菌LP HMX-3 顯著提高了仿刺參腸道菌群的豐富度和均勻度。在仿刺參缺乏特異性免疫的情況下，較高的α 多樣性可能代表著其對(duì)病原菌的高抗性和對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的適應(yīng)性。同時(shí)，β 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌LP HMX-3 添加組的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，這表明添加的益生菌--植物乳桿菌LP HMX-3 是影響腸道菌群的關(guān)鍵因素。添加LP HMX-3 后，105CFU/g 組 和107CFU/g 組的特有OUT 增多，且105CFU/g 組多于107CFU/g 組，該結(jié)果表明，將仿刺參暴露于不同濃度的益生菌會(huì)改變其內(nèi)在的微生物種群結(jié)構(gòu)[35]。其中，最占優(yōu)勢(shì)的門是變形菌門，其次是厚壁菌門，這與Foysal 等[36]的研究結(jié)果相似。眾所周知，變形菌門細(xì)菌廣泛分布于海洋環(huán)境中，但其在腸道中大量出現(xiàn)可反映腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的失調(diào)或不穩(wěn)定，存在誘發(fā)炎癥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)[37]，而厚壁菌門是腸道中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)門，同時(shí)是指示腸道健康的良好指標(biāo)[38]。在添加LP HMX-3 后，仿刺參腸道微生物群中變形菌門的豐度顯著降低，厚壁菌門豐度顯著升高，初步表明植物乳桿菌LP HMX-3 可以積極調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持仿刺參體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。Yang 等[39]通過(guò)分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析也發(fā)現(xiàn)益生菌可以促進(jìn)海參腸道菌群穩(wěn)態(tài)。此外，投喂植物乳桿菌LP HMX-3 飼料的仿刺參體內(nèi)擬桿菌門的豐度顯著高于對(duì)照組。由于擬桿菌門可以參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，產(chǎn)生多種多糖水解酶[40]，說(shuō)明植物乳桿菌LP HMX-3 可能促進(jìn)了仿刺參對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，促進(jìn)了仿刺參的生長(zhǎng)性能。另外，投喂植物乳桿菌飼料的仿刺參腸道內(nèi)放線菌門 以及酸桿菌門的豐度也有所增加。放線菌門在維持和發(fā)展腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)腸道通透性以及免疫系統(tǒng)和代謝中起著關(guān)鍵作用[41]，酸桿菌門的細(xì)菌成員能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，或有利于提高仿刺參的免疫狀態(tài)和抗病能力[42]。

綜上所述，飼糧中添加植物乳桿菌LP HMX-3 可以促進(jìn)仿刺參的生長(zhǎng)，提高體內(nèi)消化酶活性，并積極調(diào)節(jié)仿刺參的免疫機(jī)能與腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。從仿刺參生長(zhǎng)的角度來(lái)講，105CFU/g 的添加濃度具有較優(yōu)的效果。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）