日本鰻鱺TBK1 基因的克隆與免疫功能分析

徐元凱，彭欣慰，林 鵬，王藝?yán)?，馮建軍*

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.寧波海洋研究院，浙江 寧波 315832；3.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

TANK 結(jié)合激酶1 (TANK binding kinase 1，TBK1)也稱NAK 或T2K，是IκB 激酶 (IKK)家族重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于非經(jīng)典IκB 激酶。TBK1 結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的IκB 激酶IKKα、IKKβ 相似，含有N 端激酶結(jié)構(gòu)域 (KD)、泛素化結(jié)構(gòu)域 (ULD)、二聚化支架結(jié)構(gòu)域 (SDD)，以及C 端結(jié)構(gòu)域(CTD)，其中CTD 結(jié)構(gòu)域替代了IKKα 與IKKβ C端的NEMO 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (NBD)[1]。研究發(fā)現(xiàn)TBK1 中KD、ULD 和SDD 等3 個結(jié)構(gòu)域間存在相互作用，KD 對TBK1 的激活至關(guān)重要，ULD和SDD 主要與IFN-β 的誘導(dǎo)表達(dá)密切相關(guān)，而CTD 則可促進(jìn)TBK1 與TANK 和其他適配子的相互作用[2-3]。

哺乳動物中的研究表明，TBK1 可被Toll 樣受體、RIG-1 以及MDA5 等模式識別受體激活，激活的TBK1 通過使IRF3、IRF7 磷酸化入核，誘導(dǎo)I 型干擾素IFN-α、IFN-β 等細(xì)胞因子的表達(dá)，在抗病毒免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。小鼠 (Mus musculus)TBK1 能夠增強(qiáng)HEK293 細(xì)胞抵御水泡性口炎病毒 (vesicular stomatitis virus)感染的能力，而TBK1 基因敲除的小鼠易受到鼠γ 皰疹病毒68(murine gammaherpes virus 68)感染，且發(fā)現(xiàn)該小鼠細(xì)胞在刺激物刺激下表現(xiàn)出明顯的IFN-β 產(chǎn)生缺陷[6-8]。此外，TBK1 可以磷酸化IKKβ 和IκBα，進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB 亞基RelA (p65)的核易位，或是同TANK 和TRAF2 形成三元復(fù)合物激活NF-κB，參與對NF-κB 信號通路的調(diào)控[9-11]。

迄今為止，TBK1 同源基因已在一些硬骨魚類中被克隆報道，包括大西洋鱈 (Gadus morhua)[12]、青魚 (Mylopharyngodon piceus)[13]、草魚 (Ctenopharyngodon idella)[14]、大黃魚 (Larimichthys crocea)[15]、斑馬魚 (Danio rerio)[16]、斜帶石斑魚 (Epinephelus coioides)[17]及鯉 (Cyprinus carpio)[18]等。當(dāng)魚體受到不同病毒刺激后TBK1 基因表達(dá)水平顯著升高，表明TBK1 在機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答中扮演重要角色[13,19-21]，因此有關(guān)魚類TBK1 抗病毒免疫功能的研究備受關(guān)注。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青魚TBK1 能強(qiáng)烈誘導(dǎo)IFN1 活性[19]，草魚TBK1 可以激活并促進(jìn)IRF7 的核易位誘導(dǎo)I 型IFN 和PKR基因的表達(dá)[22]，而斑馬魚TBK1 則可通過磷酸化STING 和IRF3 來激活I(lǐng) 型IFN 的表達(dá)[23]。雖然以上研究表明TBK1 對于IRF3/IRF7 介導(dǎo)的I 型干擾素信號通路具有重要的調(diào)控作用，但魚類TBK1對細(xì)菌免疫應(yīng)答密切相關(guān)的NF-κB 及MAPK 信號通路是否也具有調(diào)控作用還未見報道，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌刺激魚體TBK1 基因水平變化的研究僅在大黃魚中有所報道[15]。因此，研究在體和離體狀態(tài)下主要病原模式分子和病原菌刺激后的魚類TBK1 基因的表達(dá)變化規(guī)律、以及魚類TBK1過表達(dá)對于不同免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控作用將有助于對硬骨魚類TBK1 的功能深入了解，為魚類免疫應(yīng)答機(jī)制的闡明提供參考資料。

日本鰻鱺 (Anguilla japonica)，俗稱白鱔、青鱔、鰻魚。其味道鮮美、營養(yǎng)價值高，被譽為“水中人參”，在我國已形成了集養(yǎng)殖、加工、銷售為一體，年產(chǎn)值達(dá)百億元的大產(chǎn)業(yè)，主要集中在福建、廣東、浙江三地[24]。但目前大規(guī)模、集約化的養(yǎng)殖模式帶來了鰻魚病害的頻發(fā)和流行，造成巨額經(jīng)濟(jì)損失[25]。與其他經(jīng)濟(jì)魚類相比，有關(guān)日本鰻鱺免疫學(xué)基礎(chǔ)研究十分薄弱，制約了鰻鱺產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本實驗首次克隆了日本鰻鱺TBK1 基因 (命名為AjTBK1)全長cDNA，利用實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測了不同病原體相關(guān)分子模式以及鰻鱺主要病原菌嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)刺激后的日本鰻鱺主要免疫組織器官以及體外培養(yǎng)的日本鰻鱺肝臟細(xì)胞TBK1 基因表達(dá)變化，并通過綠色熒光亞細(xì)胞定位和雙熒光素酶技術(shù)對TBK1 蛋白分子的免疫功能進(jìn)行了研究分析，以期為日本鰻鱺抗細(xì)菌、病毒免疫應(yīng)答機(jī)制的闡明奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：日本鰻鱺，體重為45～50 g，購自福建福清鰻魚養(yǎng)殖場，在實驗室于25 °C，1 000 L 循環(huán)水中飼養(yǎng)1 周后備用。

細(xì)胞：人體腎臟細(xì)胞系 (HEK293 細(xì)胞)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液中，于37 °C，CO2含量5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；日本鰻鱺肝臟細(xì)胞為實驗室所有，于27 °C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究獲得了集美大學(xué)科技倫理委員會(編號：JMU202203022)批準(zhǔn)，實驗過程中操作人員嚴(yán)格遵守集美大學(xué)科技倫理委員會倫理規(guī)范，并按照集美大學(xué)科技倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 實驗試劑

DNA 凝膠回收試劑盒購自TaKaRa 公司 (日本)，E.Z.N.A.TM Total RNA KitⅠⅠ、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega 公司 (美國)，胎牛血清購自PAN-Biotech 公司 (德國)，DMEM 高糖培養(yǎng)液、胰蛋白胨、Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基 (1×)購自Gibco 公司 (美國)，qPCR SYBR?Green Master Mix 購自Vazyme 公司 (中國)，Lipofectamine? 3 000購自Invitrogen 公司 (美國)，Dual-Glo luciferase assay system 購自Promega 公司 (美國)。

1.3 組織采集與在體實驗免疫刺激

日本鰻鱺于實驗室暫養(yǎng)1 周后進(jìn)行實驗，浸入含有1×102mg/L 丁香酚的水中 (中國上海第二試劑廠)麻醉后，解剖取日本鰻鱺各組織樣品，包括肝臟、脾臟、鰓、腎臟、腸、心臟、皮膚和肌肉，用于RNA 提取。

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)為本實驗室所有[26]，將其接種于胰蛋白胨大豆肉湯 (TSB)中，28 °C 振蕩培養(yǎng)24 h。收集細(xì)菌，并于0.01 mmol/ L 磷酸鹽緩沖鹽溶液 (PBS，pH=7.4)中稀釋至4×104CFU/ mL。LPS 和poly I:C (Sigma 公司，美國)用PBS 溶解稀釋至終濃度分別為4 和2 mg/mL。將日本鰻鱺分成4 組，實驗組分別腹腔注射250 μL LPS、250 μL poly I:C 和250 μL 4×104CFU/mL 嗜水氣單胞菌液，對照組注射250 μL 滅菌PBS。于免疫后0、6、12、24、48 和72 h 每組隨機(jī)選取4 尾的肝臟、脾臟和腎臟3 種組織器官，保存用于后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及免疫刺激

離體實驗中，按照實驗室已有研究進(jìn)行日本鰻鱺肝臟細(xì)胞系培養(yǎng)[27]。實驗組細(xì)胞分別用30 μg/mL LPS、50 μg/mL poly I:C、30 μg/mL CpGDNA (Sangon Biotech，中 國)、30 μg/mL 肽聚糖(PGN,Sigma，美國) 或3 種不同濃度的嗜水氣單胞菌 (1×106、1×107和 1×108CFU/mL)處理細(xì)胞，對照組用等劑量滅菌PBS 處理，每組在不同時相取4 個平行樣品。按照說明書，使用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II 試劑盒在細(xì)胞處理后0、3、6、12、24 和48 h，從細(xì)胞中分離提取總RNA。

1.5 AjTBK1 全長cDNA 的克隆

按照說明書指示，使用TRIzol 試劑 (Invitrogen，美國)從日本鰻鱺組織中分離總RNA。使用肝臟RNA，用SMART RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa，日本)合成用于RACE 反應(yīng)的cDNA 第一條鏈?；趯嶒炇艺莆盏娜毡决狑~轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的TBK1 部分序列，使用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行特異性引物設(shè)計 (表1)，進(jìn)行PCR 以擴(kuò)增AjTBK1 的部分cDNA 序列。將純化的PCR 產(chǎn)物插入pMD19-T (Simple)載體 (TaKaRa，日本)并轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽性克隆所得質(zhì)粒由生工生物工程 (上海)股份有限公司進(jìn)行DNA 測序。根據(jù)克隆的TBK1 部分基因序列，進(jìn)一步設(shè)計特異性引物 (表1)，使用5′和3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(TaKaRa，日本)進(jìn)行RACE PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，克隆至pMD19-T (simple)載體，并按上述方法測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

BLAST 程序 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列相似性分析；ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析AjTBK1 的全長cDNA 序列；ExPASy (http://www.us.expasy.org/tools/)分析推導(dǎo)的氨基酸序列；CLUSTALW 程序(http://www.ebi.ac.uk/clustaw/)進(jìn)行多序列比對；NCBI CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特征；MEGA 5 軟件基于Neighbor-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 基于qRT-PCR 的AjTBK1 表達(dá)分析

使用PrimeScript? RT 試劑盒和gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara，日本)從總RNA 合成cDNA 第一條鏈。在該反應(yīng)中，由試劑盒提供的gDNA Eraser (具有高效DNAase 活性)進(jìn)行基因組DNA 的去除。

將合成的cDNA 用無核酸酶水稀釋10 倍，于-20 °C 儲存。使用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計AjTBK1 與β-actin(內(nèi)參基因)的引物 (表1)，進(jìn)行預(yù)實驗以確保沒有引物二聚體的單個離散帶的擴(kuò)增，并對產(chǎn)物進(jìn)行測序以驗證RT-PCR 的特異性。qRT-PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，包含10 μL 2×AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix、1 μL 稀釋 的cDNA、正 反引物 各0.5 μL (10 μmol/L)和8 μL 無核酸酶水。于Roche Light Cycler 480 機(jī)器(Roche，英國)上進(jìn)行擴(kuò)增，qRT-PCR 條件：95 °C孵育1 min，隨后進(jìn)行40 個循環(huán) (95 °C，15 s，60 °C，1 min)。在每個qRT-PCR 反應(yīng)結(jié)束時進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的解離分析，以確認(rèn)只有一個PCR 產(chǎn)物被擴(kuò)增和檢測到。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線評估目標(biāo)基因和參考基因的相對定量。根據(jù)實驗室已有研究[27]，使用比較CT法 (即2-△△CT方法)用于確定AjTBK1的mRNA 相對表達(dá)水平。基因表達(dá)水平通過平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差標(biāo)識，有3 個樣品重復(fù)。

1.8 亞細(xì)胞定位

將AjTBK1 的ORF 克隆并使用相應(yīng)引物插入pEGFP-N1 載體中 (表1)，構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過測序確認(rèn)。將HEK-293 細(xì)胞接種在6 孔板中，使用Lipofectamine 3 000 試劑 (Invitrogen，美國)轉(zhuǎn)染純化后的質(zhì)粒。用轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 空載體的細(xì)胞作為對照。轉(zhuǎn)染12 h 后，細(xì)胞用30 μg/mL LPS 或50 μg/mL poly I:C 處理，用 PBS 處理的細(xì)胞作為載體對照。處理 24 h 后，用PBS 洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，并用6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)(1 mg/mL)染色，具體方法參考文獻(xiàn)[28]所述，在共聚焦熒光顯微鏡 (Leica TCS SP8)下觀察細(xì)胞。

1.9 雙熒光素酶活性測定

為了研究AjTBK1 對NF-κB、I 型IFN 和AP-1 啟動子活性的調(diào)控作用，以pRL-TK 載體 (表達(dá)海腎熒光素酶)作為轉(zhuǎn)染效率標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參對照，使用Dual-Glo 熒光素酶測定系統(tǒng) (Promega，美國)進(jìn)行熒光素酶測定。使用相應(yīng)的引物將AjTBK1 的ORF 克隆并插入表達(dá)載體pCMV-CHis 中 (Beyotime Biotechnology 公司)。HEK293 細(xì)胞在48 孔板中以每孔 1×105個細(xì)胞培養(yǎng)，使用Lipofectamine 3 000 試劑，轉(zhuǎn)染20 ng pRL-TK 內(nèi)參質(zhì) 粒、100～300 ng pCMV-TBK1 和80 ng NF-κBluc 熒光素酶報告質(zhì)粒 (Genomeditech，中國)或pAP1-luc (Beyotime Biotechnology，中國)或 IFN-βluc (Beijing Qualityard Biotechnology，中 國)。用pCMV-C-His 空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。對于每次轉(zhuǎn)染，每孔DNA 總量控制在400 ng，并用空載體進(jìn)行平衡。在轉(zhuǎn)染后6、12 和24 h 收獲細(xì)胞并通過Promega GloMax?20/20 光度計 (Promega，美國)測量熒光素酶活性，并計算與對應(yīng)的海腎熒光素酶的活性比值得出轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光素酶的相對活性，進(jìn)而獲得實驗組與對照組熒光素酶相對活性的倍數(shù)變化[29]。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 15.0 對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中僅兩組數(shù)據(jù)間的比較使用成組T-檢驗分析，多組數(shù)據(jù)間的比較使用單因素方差分析及Duncan 多重比較。并用P<0.05 表示存在顯著性差異，P<0.01 則表示存在極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 AjTBK1 基因全長克隆及序列分析

日本鰻鱺AjTBK1 (GenBank 登錄號：MK 681481)的cDNA 全長為3 018 bp，其中開放閱讀框 (ORF)為2 196 bp，5′非編碼區(qū) (UTR)為70 bp，3′非編碼區(qū)為752 bp (圖1)。ORF 編碼731 個氨基酸 (aa)，預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為83.98 ku，理論等電點為6.27。SMART 程序預(yù)測AjTBK1 具有保守的結(jié)構(gòu)域，包括N 端的激酶結(jié)構(gòu)域 (KD，1～308 aa)，泛素樣結(jié)構(gòu)域 (ULD，309～387 aa)，二聚化支架結(jié)構(gòu)域 (SDD，388～657 aa)和C 端結(jié)構(gòu)域(CTD，658～731aa)。

圖1 日本鰻鱺AjTBK1 cDNA 及推導(dǎo)的氨基酸序列圖大寫字母分別代表5′和3′非編碼區(qū)序列，小寫字母代表編碼區(qū)序列；上面為核苷酸序列，對應(yīng)下面為編碼的氨基酸序列；起始密碼子(atg)以加粗及單下劃線標(biāo)示，終止密碼子(tga)以加粗標(biāo)示，多腺苷酸化信號(ATTAAA)以雙下劃線標(biāo)示；激酶結(jié)構(gòu)域(KD)灰色標(biāo)示，泛素樣結(jié)構(gòu)域(ULD)為加粗斜體標(biāo)示，二聚化支架結(jié)構(gòu)域(SDD)用單線標(biāo)示，C 端結(jié)構(gòu)域(CTD)用方框標(biāo)示。Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequence of AjTBK1 gene from A. japonicaCapital letters represent the sequence of 5' and 3' untranslated region separately.Lowercase letters represent the coding sequence,with nucleotide sequence above and coded amino sequence below.The start codon (ATG) was underlined in bold,and the stop codon (TAA) was marked with an asterisk in bold.The polyadenylation signal (ATTAAA) is double-underlined.The kinase domain (KD) was shaded in grey.The ubiquitin-like domain (ULD)was italic in bold.The scaffold dimerization domain (SDD) was underlined.The C-terminal domain (CTD) was boxed.

2.2 AjTBK1 蛋白的結(jié)構(gòu)分析

氨基酸多重比較圖顯示，日本鰻鱺AjTBK1與斑馬魚、非洲爪蟾 (Xenopus laevis)、綠頭鴨(Anas platyrhynchos)、小鼠、智人 (Homo sapiens)等其他物種TBK1 氨基酸序列一樣，含有保守的激酶結(jié)構(gòu)域、泛素樣結(jié)構(gòu)域、二聚化支架結(jié)構(gòu)域以及C 端結(jié)構(gòu)域。激酶結(jié)構(gòu)域中的ATP 結(jié)合位點“LGQGATANV”用方框標(biāo)記，而與TBK1 自磷酸化密切相關(guān)的絲氨酸殘基Ser172 高度保守。同源性分析顯示，AjTBK1 與其他物種TBK1 氨基酸序列一致性高達(dá)66%～87% (圖2)。

(圖2 Fig.2)

采用SWISS-MODEL 軟件 (http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模，以人TBK1 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)為模板 (PDB 編號：4imo.1.A)預(yù)測日本鰻鱺AjTBK1 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。預(yù)測所得的AjTBK1三維結(jié)構(gòu)由19 個α 螺旋和13 個β 折疊組成，并且與人TBK1 的三維結(jié)構(gòu)高度相似 (圖3)。

圖3 AjTBK1 與人類TBK1 空間結(jié)構(gòu)的比較(a)AjTBK1 三維結(jié)構(gòu)圖；(b)人TBK1 三維結(jié)構(gòu)圖；(c)日本鰻鱺與人TBK1 疊合的三維結(jié)構(gòu)圖。Fig.3 TBK1 three-dimensional structure comparison between A. japonica and H. sapiens(a) the predicted three-dimensional structure of AjTBK1;(b) the predicted three-dimensional structure of human TBK1;(c) the predicted three-dimensional structure of AjTBK1 overlapped with human TBK1.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Mega 5.0 中的Neighbor-Joining 方法構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖4)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，日本鰻鱺AjTBK1 與亞洲龍魚 (Scleropages formosus)鄰近，并與其他硬骨魚類TBK1 聚為一個分支，而哺乳類、鳥類及兩棲類TBK1 則各聚為一支。

圖4 日本鰻鱺AjTBK1 與其他物種TBK1 氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(AjTBK1 用▲)Fig.4 Phylogenetic tree of the TBK1 amino acid sequences between A. japonica and other species(AjTBK1 was marked with ▲)

2.4 AjTBK1 基因在日本鰻鱺不同組織中的表達(dá)

AjTBK1 在日本鰻鱺肝臟、腸、腮、脾臟、皮膚、腎臟、心臟和肌肉中均有表達(dá)，其中在肝臟中表達(dá)量最高，腸、鰓和脾臟中表達(dá)量也較高，而心臟和肌肉中的表達(dá)量相對較低 (圖5)。

圖5 健康日本鰻鱺不同組織中AjTBK1 的相對表達(dá)量1.肝臟，2.腸，3.鰓，4.脾臟，5.皮膚，6.腎臟，7.心臟，8.肌肉；不同的字母表示不同組織AjTBK1 基因表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.05)。Fig.5 Relative expression levels of AjTBK1 transcripts in different tissues of healthy A. japonica1.liver,2.intestine,3.gills,4.spleen,5.skin,6.kidney,7.heart,8.muscle;different letters indicated a significant difference of AjTBK1 gene expression among tissues (P<0.05).

2.5 免疫刺激對肝臟、腎臟和脾臟中AjTBK1基因表達(dá)的影響

為了研究AjTBK1 在抗細(xì)菌和抗病毒免疫應(yīng)答中的作用，我們通過qRT-PCR 分別檢測了經(jīng)LPS，poly I:C 和嗜水氣單胞菌刺激日本鰻鱺0、6、12、24、48 和72 h 后，日本鰻鱺肝臟、腎臟和脾臟中AjTBK1 基因表達(dá)水平。

LPS 刺激后，日本鰻鱺肝臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在6 h 顯著上升至峰值 (1.8 倍，P<0.01)，而在24 h 表達(dá)量顯著降低 (0.71 倍，P<0.05)；腎臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在48 h (0.61 倍，P<0.05)和72 h (0.51 倍，P<0.05)均顯著降低；脾臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在6 h (0.65 倍，P<0.01)和12 h (0.72 倍，P<0.01)顯著降低 (圖6-a)。

圖6 LPS、poly I:C 及嗜水氣單胞菌對日本鰻鱺肝臟、腎臟及脾臟AjTBK1 基因表達(dá)水平的影響(a) LPS 刺激對日本鰻鱺肝臟、腎臟及脾臟AjTBK1 基因表達(dá)水平的影響；(b) poly I:C 刺激對日本鰻鱺肝臟、腎臟及脾臟AjTBK1 基因表達(dá)水平的影響；(c) A. hydrophila 刺激對日本鰻鱺肝臟、腎臟及脾臟AjTBK1 基因表達(dá)水平的影響；各圖橫坐標(biāo)中1，2 和3 分別代表日本鰻鱺肝臟，腎臟和脾臟；“*”表示相同時相實驗組與對照組之間存在顯著差異(P<0.05)，“**”表示極顯著差異(P<0.01)。Fig.6 Effect of LPS,poly I:C,or A. hydrophila on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica(a) Effect of LPS on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica;(b) effect of poly I:C on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica;(c) effect of A. hydrophila on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica;1,2 and 3 on the abscissa represent liver,kidney and spleen respectively;statistical differences between the expression level of each sample and that of the PBS control at the same sampling time are indicated with asterisks (*,P<0.05;**,P<0.01).

poly I:C 免疫后，日本鰻鱺肝臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在6 h 顯著升高并達(dá)到峰值 (1.8 倍，P<0.01)；腎臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在48 h (0.56倍，P<0.01)和72 h (0.62 倍，P<0.05)顯著降低；脾臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在24 h (1.4 倍，P<0.01)顯著提高，在6 h (0.82 倍，P<0.05)和72 h(0.81 倍，P<0.05)顯著降低 (圖6-b)。

嗜水氣單胞菌感染后，日本鰻鱺肝臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在48 h (1.9 倍，P<0.01)和到72 h (1.6 倍P<0.01)顯著上升；腎臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在12 h (1.9 倍，P<0.05)和24 h (1.6 倍，P<0.01)表達(dá)量顯著上調(diào)；脾臟AjTBK1 基因表達(dá)水平在24 h (1.2 倍，P<0.05)出現(xiàn)顯著上升，但在6 h (0.87 倍，P<0.01)和72 h (0.66 倍，P<0.01)顯著降低 (圖6-c)。

2.6 不同PAMPs 及嗜水氣單胞菌對日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTBK1 基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究離體狀態(tài)下不同病原體相關(guān)分子模式 (PAMPs)及魚類病原菌對TBK1 基因表達(dá)的影響，我們用LPS、poly I:C、CpG-DNA、PGN 以及不同濃度的嗜水氣單胞菌刺激日本鰻鱺肝臟細(xì)胞系，在0、3、6、12 h、24 和48 h 通過qRTPCR 檢測AjTBK1 基因表達(dá)水平變化。

日本鰻鱺肝臟細(xì)胞系經(jīng)LPS 刺激后，AjTBK1 基因表達(dá)水平在6 h 表達(dá)顯著下降 (0.55 倍，P<0.05)，在12 h (15.3 倍，P<0.01)和48 h (1.9 倍，P<0.05)顯著升高；poly I:C 處理后，AjTBK1 基因表達(dá)量在12 h (5.8 倍，P<0.05)顯著提高；PGN刺激后的AjTBK1 mRNA 表達(dá)水平在3 h (0.58 倍，P<0.05)顯著降低，在6 h (9.3 倍，P<0.01)，12 h(4.8 倍，P<0.01)，24 h (1.4 倍，P<0.05)和48 h(1.7 倍，P<0.01)均顯著升高；而CpG-DNA 刺激下的基因表達(dá)水平在各時相均無顯著變化 (P>0.05) (圖7-a)。

圖7 不同PAMPs 及不同濃度嗜水氣單胞菌刺激對日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTBK1 基因表達(dá)水平的影響(a) 不同PAMPs 刺激對日本鰻鱺肝臟細(xì)胞內(nèi)AjTBK1 基因表達(dá)水平的影響；(b) 不同濃度嗜水氣單胞菌刺激對日本鰻鱺肝臟細(xì)胞內(nèi)AjTBK1基因表達(dá)水平的影響；“*”表示相同時相實驗組與對照組之間存在顯著差異(P<0.05)，“**”表示極顯著差異(P<0.01)。Fig.7 Effect of different PAMPs,or different concentrations of A. hydrophila on AjTBK1 gene expression of A. japonica liver cells(a) Effect of different PAMPs on AjTBK1 gene expression of A. japonica liver cells;(b) effect of different concentrations of A. hydrophila on AjTBK1 gene expression of A. japonica liver cells;statistical differences between the expression level of each sample and that of the PBS control at the same sampling time are indicated with asterisks (*,P<0.05;**,P<0.01).

日本鰻鱺肝臟細(xì)胞系經(jīng)濃度為1×106CFU/mL嗜水氣單胞菌刺激后，AjTBK1 基因表達(dá)水平在24 h (2.7 倍，P<0.05)和48 h (4.7 倍，P<0.01)顯著上調(diào)；當(dāng)嗜水氣單胞菌濃度調(diào)整為1×107CFU/mL 后，AjTBK1 基因表達(dá)水平在6 h (0.74 倍，P<0.05)和12 h (0.50 倍，P<0.01)顯著下降，但在48 h (2.1 倍，P<0.01)顯著提高；濃度為1×108CFU/mL 嗜水氣單胞菌刺激后，AjTBK1 基因表達(dá)水平48 h (1.6 倍，P<0.01)顯著升高 (圖7-b)。

2.7 AjTBK1 在HEK293 細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建綠色熒光蛋白pEGFP-TBK1 重組質(zhì)粒，以pEGFP-N1 空載體為對照，將其轉(zhuǎn)染人類HEK293細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。天然狀態(tài)下，AjTBK1 在細(xì)胞質(zhì)中均勻分布，在細(xì)胞核中未見分布。LPS 和poly I:C 刺激下，AjTBK1 在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)聚集、并呈點狀分布 (圖版)。

圖版 AjTBK1 在HEK293 中的亞細(xì)胞定位1～3.天然狀態(tài)下綠色熒光蛋白亞細(xì)胞定位；4～6.天然狀態(tài)下AjTBK1 綠色熒光融合蛋白亞細(xì)胞定位；7～9.LPS 刺激后AjTBK1 綠色熒光融合蛋白亞細(xì)胞定位；10～12.polyI:C 刺激后AjTBK1 綠色熒光融合蛋白亞細(xì)胞定位；藍(lán)色部分為DAPI 染色，示細(xì)胞核；綠色部分為綠色熒光蛋白，示EGFP 或EGFP-AjTBK1 在細(xì)胞中的位置；3、6、9 和12 分別為1 和2、4 和5、7 和8、9 和10 的合并圖像。Plate Subcellular localization of AjTBK1 intransfected HEK293 cells1-3.subcellular localization of EGFP protein in the natural state;4-6.subcellular localization of EGFP-AjTBK1 fusion protein in the natural state;7-9.subcellular localization of EGFP-AjTBK1 fusion protein after LPS stimulation;10-12.subcellular localization of EGFP-AjTBK1 fusion protein after poly I:C stimulation;nucleus were stained with DAPI,were shown in blue;the green part shows the location of EGFP or EGFP-AjTBK1 in cells;3,6,9 and 12 are the merged images of 1 and 2,4 and 5,7 and 8,9 and 10 respectively.

2.8 AjTBK1 過表達(dá)對 NF-κB、IFN1 和 AP1啟動子活性的影響

為研究AjTBK1 對NF-κB、AP-1 和I 型IFN信號通路的調(diào)控作用，我們構(gòu)建了AjTBK1 的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-TBK1，同時以pCMV-C-His 為對照質(zhì)粒，pRL-TK 為內(nèi)參質(zhì)粒，將pCMV-TBK1分別與NF-κB，AP-1 或IFN-β 啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293 細(xì)胞。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)的AjTBK1 對NF-κB、AP-1、IFNβ 啟動子活性具有激活作用并呈劑量依賴性 (圖8)。

圖8 過表達(dá)AjTBK1 對NF-κB，AP-1 和IFN-β 的激活作用(a) 不同時相下AjTBK1 對NF-κB 的激活；(b)不同轉(zhuǎn)染劑量的AjTBK1 轉(zhuǎn)染24 h 對NF-κB 的激活；(c)不同時相下AjTBK1 對AP-1 的激活；(d)不同轉(zhuǎn)染劑量的AjTBK1 轉(zhuǎn)染12 h 對AP-1 的激活；(e)不同時相下AjTBK1 對IFN-β 的激活；(f)不同轉(zhuǎn)染劑量的AjTBK1 轉(zhuǎn)染24 h 對IFN-β 的激活。圖(b)、(d)、(f)中的1、2、3、4 分別代表轉(zhuǎn)染pCMV 300 ng、轉(zhuǎn)染pCMV 200 ng 和pCMV-TBK1 100 ng、轉(zhuǎn)染pCMV 100 ng 和pCMV-TBK1 200 ng、轉(zhuǎn)染pCMV-TBK1 300 ng。“*”表示相同時相下實驗組與對照組之間存在顯著差異(P<0.05)，“**”表示極顯著差異(P<0.01)；“＃”表示不同轉(zhuǎn)染劑量的實驗組之間存在顯著差異(P<0.05)，而“##”表示極顯著差異(P<0.01)。Fig.8 Activation of NF-κB,AP-1,and IFN-β response by AjTBK1 overexpression(a) activation of NF-κB by AjTBK1 in different phases;(b) activation of NF-κB by different doses of AjTBK1 after 24 h transfection;(c) activation of AP-1 by AjTBK1 in different phases;(d) activation of AP-1 by different doses of AjTBK1 after 12 h transfection;(e) activation of IFN-β by AjTBK1 in different phases;(f) activation of IFN-β by different doses of AjTBK1 after 24 h transfection;1,2,3,4 in Fig B,D,F are referred to the plasmid transfection of 300 ng pCMV,200 ng pCMV and 100 ng pCMV-TBK1,100 ng pCMV and 200 ng pCMV-TBK1,and pCMV-TBK1 300 ng,respectively;statistical differences between the expression level of each sample and that of the pCMV control are indicated with asterisks (*,P<0.05;**,P<0.01);hashtags indicate statistically significant differences between two transfection doses of AjTBK1 as specified in the figure (#,P<0.05;##,P<0.01).

過表達(dá)的AjTBK1 分別在6 h (1.7 倍，P<0.01)、12 h (1.6 倍，P<0.01)和24 h (1.8 倍，P<0.01)顯著增強(qiáng)了NF-κB 啟動子熒光素酶活性 (圖8-a)；選取24 h 作為轉(zhuǎn)染時間，將NF-κB 報告質(zhì)粒與不同劑量的pCMV-TBK1 質(zhì)粒 (100 ng、200 ng 和300 ng)共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)NF-κB 啟動子的熒光素酶活性分別提高了1.5 倍 (P<0.01)，1.7 倍 (P<0.01)和2.4倍 (P<0.01) (圖8-b)。

過表達(dá)的AjTBK1 在6 h 對AP-1 啟動子無顯著誘導(dǎo) (P>0.05)，而在12 h (1.2 倍，P<0.01)和24 h (1.1 倍，P<0.01)均能誘導(dǎo)AP-1 啟動子熒光素酶活性 (圖8-c)；當(dāng)與不同劑量的pCMV-TBK1質(zhì)粒 (100 ng 和300 ng)共轉(zhuǎn)染時，AP-1 啟動子的熒光素酶活性在12 h 分別提高了1.03 倍 (P<0.01)和1.13 倍 (P<0.01)，而在200 ng 劑量下無顯著誘導(dǎo)效果 (P>0.01) (圖8-d)。

過表達(dá)的AjTBK1 在6 h (1.4 倍，P<0.01)，12 h (1.91 倍，P<0.01)和24 h (1.92 倍，P<0.01)顯著誘導(dǎo)IFN-β 啟動子熒光素酶活性 (圖8-e)；選取24 h 作為轉(zhuǎn)染時間，將報告質(zhì)粒IFN-β 與不同劑量的pCMV-TBK1 質(zhì)粒 (100 ng、200 ng 和300 ng)共轉(zhuǎn)染時，IFN-β 啟動子的熒光素酶活性分別提高了1.46 倍 (P<0.01)，1.47 倍 (P<0.01)和1.48倍 (P<0.01) (圖8-f)。

3 討論

哺乳動物TBK1 作為非經(jīng)典IκB激酶，在激活NF-κB、I 型IFN 信號通路中起著關(guān)鍵作用[30]。目前的研究表明，魚類TBK1 在IRF3/IRF7 介導(dǎo)的I 型干擾素信號通路具有重要的調(diào)控作用，但有關(guān)魚類TBK1 對細(xì)菌免疫應(yīng)答密切相關(guān)的NFκB 及MAPK 信號通路調(diào)控作用的研究還未見報道。為了深入了解TBK1 在硬骨魚類免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制，本研究從日本鰻鱺中克隆了AjTBK1 cDNA 全長，探究了在體和離體狀態(tài)下主要病原模式分子和魚類病原菌刺激后的AjTBK1 基因表達(dá)的變化，以及AjTBK1 過表達(dá)對于不同免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控作用。

AjTBK1 編碼了731 個氨基酸，與斑點叉尾鮰、斑馬魚、大西洋鱈、虹鱒等TBK1 氨基酸相似度高達(dá)84%～87%，具有TBK1 蛋白家族典型的激酶結(jié)構(gòu)域 (KD)、泛素樣結(jié)構(gòu)域 (ULD)、二聚化支架結(jié)構(gòu)域 (SDD)以及C 端結(jié)構(gòu)域 (CTD)[1,31]。AjTBK1 的激酶結(jié)構(gòu)域中含有保守的ATP 結(jié)合位點“LGQGATANV”，以及與TBK1 自磷酸化密切相關(guān)的絲氨酸殘基Ser172。此外，日本鰻鱺AjTBK1 空間結(jié)構(gòu)與人類TBK1 蛋白質(zhì)在三維結(jié)構(gòu)上高度相似，并與其他魚類TBK1 在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支，反映出TBK1 在進(jìn)化過程中相對保守，預(yù)示該分子具有類似于哺乳動物TBK1 的免疫調(diào)節(jié)方面的功能。

AjTBK1 基因在日本鰻鱺各組織中廣泛表達(dá)，這種組成型基因表達(dá)模式也出現(xiàn)在大西洋鱈[12]、青魚[13]、草魚[14]、大黃魚[15]、斜帶石斑魚[17]和鯉[18]中。AjTBK1 基因在肝臟、腸、鰓、脾臟等免疫相關(guān)組織中有較高表達(dá)，與大西洋鱈[12]、草魚[14]和鯉[18]的研究結(jié)果一致。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大黃魚TBK1 基因表達(dá)水平在腦、肌肉和心臟中較高[15]，而斜帶石斑魚心臟TBK1 表達(dá)量明顯高于肝臟、脾臟、頭腎等免疫器官[17]，提示TBK1 在硬骨魚類中的表達(dá)模式具有種屬特異性，其免疫功能也可能存在差異。

硬骨魚類TBK1 在抗病毒免疫功能中的研究已有不少報道。例如鯉春病毒血癥病毒 (SVCV)、草魚呼腸孤病毒 (GCRV)可誘導(dǎo)青魚肝臟、脾臟、腎臟以及青魚鰭細(xì)胞中TBK1基因表達(dá)水平顯著提高[13]，GCRV 感染草魚后，其脾臟、頭腎以及腎臟細(xì)胞中TBK1 表達(dá)量顯著上升[14]，而赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒 (RGNNV)和新加坡石斑魚虹彩病毒 (SGIV)感染后可使斜帶石斑魚脾臟細(xì)胞中TBK1 表達(dá)量顯著升高[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)poly I:C可誘導(dǎo)日本鰻鱺肝臟、脾臟以及日本鰻鱺肝臟細(xì)胞中AjTBK1 表達(dá)水平顯著提高，表明AjTBK1 參與日本鰻鱺抗病毒免疫應(yīng)答，但其免疫調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

目前，有關(guān)魚類TBK1 參與抗病原菌感染的研究僅在大黃魚中有所報道，其結(jié)果顯示，滅活的副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)可以誘導(dǎo)大黃魚免疫相關(guān)組織中TBK1 的表達(dá)水平提高[15]。我們發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖鰻鱺主要病原菌嗜水氣單胞菌能夠誘導(dǎo)日本鰻鱺肝臟、脾臟、腎臟以及日本鰻鱺肝臟細(xì)胞TBK1基因表達(dá)水平顯著升高，從在體和離體兩個方面支持了魚類TBK1 在抗細(xì)菌免疫應(yīng)答反應(yīng)中的重要作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的主要病原模式分子LPS 和PGN均能引起日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTBK1 的表達(dá)水平提高，與草魚腎臟細(xì)胞的研究結(jié)果相符[14]。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青魚鰭細(xì)胞TBK1 的表達(dá)水平經(jīng)LPS刺激后卻無顯著變化[13-14]，提示不同魚類細(xì)胞對于不同的主要病原模式分子刺激后的免疫應(yīng)答機(jī)制有所不同。

亞細(xì)胞定位對于蛋白質(zhì)功能的深入研究具有重要意義。天然狀態(tài)下AjTBK1 主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，與青魚[13]、斜帶石斑魚[17]的研究結(jié)果相一致。目前，尚未有研究表明病原體相關(guān)分子模式能夠引起TBK1 在細(xì)胞中的定位變化，而本研究證實了LPS 和poly I:C 能夠引起AjTBK1 在細(xì)胞質(zhì)中聚集表達(dá)，與日本鰻鱺AjIKKα 的文獻(xiàn)報道一致[32]，提示AjTBK1 對抗病原微生物免疫應(yīng)答的調(diào)控作用主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。哺乳動物中的研究表明，IKKα/β 可以通過磷酸化對TBK1/IKKε 進(jìn)行活化以完成抗病毒信號的進(jìn)一步傳遞[33]，日本鰻鱺AjTBK1 與AjIKKα 在抗細(xì)菌和抗病毒先天免疫應(yīng)答中是否也存在類似的相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

TBK1 是調(diào)節(jié)IFN-β 表達(dá)的重要激酶，在介導(dǎo)人類先天免疫中具有不可替代的作用[34]。與人類TBK1 功能相似，草魚[14]、青魚[19]以及斑馬魚[16]等硬骨魚類的TBK1 過表達(dá)后也能激活自身I 型IFN 的表達(dá)。此外，硬骨魚類TBK1 也被證明與IRF 家族中多個轉(zhuǎn)錄因子如IRF3、IRF5、IRF6、IRF7 之間存在相互作用，并可通過這些相互作用參與調(diào)節(jié)I 型IFN 信號通路[19-20,35-37]。本實驗中AjTBK1 過表達(dá)顯著激活I(lǐng)FN-β 的啟動子活性，并呈劑量依賴性進(jìn)一步證明魚類TBK1 在抗病毒免疫功能方面的保守性。此外，在綠頭鴨和原雞中的研究發(fā)現(xiàn)缺失KD 或ULD 的TBK1 的突變體喪失了對IFN-β 的激活能力[38-39]，而缺失KD 的斜帶石斑魚TBK1 的突變體也缺乏對IRF3、IRF7 啟動子活性的激活能力[17]，因此，進(jìn)一步通過構(gòu)建日本鰻鱺TBK1 不同結(jié)構(gòu)域突變體，研究其對IFNβ 的啟動子活性的影響，將有助于深入了解TBK1所介導(dǎo)的抗病毒調(diào)控機(jī)制。

NF-κB 是細(xì)胞中的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種免疫和炎癥反應(yīng)。雖然人類TBK1 和綠頭鴨TBK1 的過表達(dá)可激活NF-κB 的啟動子活性[10,38]，但硬骨魚類TBK1 是否參與調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路尚未見報道。本實驗通過雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)，AjTBK1 過表達(dá)顯著增強(qiáng)了NFκB 啟動子熒光素酶活性，并呈現(xiàn)劑量依賴性，表明魚類TBK1 也參與了細(xì)胞內(nèi)NF-κB 信號通路的激活，但其調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

AP-1 屬于MAPK 信號通路中的重要細(xì)胞因子，其轉(zhuǎn)錄活性在細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥及遷移等過程中發(fā)揮復(fù)雜而又重要的作用，且受JNK、ERK、p38 MAPK、PI3K/AKT 的調(diào)控[40]。早期的研究表明，哺乳動物中AKT 可調(diào)控MAPK 信號通路下游因子AP-1，TBK1 可通過激活P13K 實現(xiàn)對AKT 的磷酸化[40-41]。我們首先在日本鰻鱺中觀察到TBK1 能夠?qū)P-1 啟動子熒光素酶活性有一定的增強(qiáng)作用，提示硬骨魚TBK1 很可能也參與了對MAPK 信號通路的調(diào)控作用，但尚需在其他魚類中進(jìn)一步證實。

本實驗從日本鰻鱺克隆鑒定出AjTBK1 基因的cDNA 全長，qRT-PCR 顯示嗜水氣單胞菌和poly I:C 能夠誘導(dǎo)日本鰻鱺肝臟、脾臟以及日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTBK1 基因水平顯著提高，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 和poly I:C 刺激后AjTBK1在細(xì)胞質(zhì)中呈聚集點狀分布，雙熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的AjTBK1 可激活NF-κB、AP-1 和IFN-β 啟動子，以上結(jié)果表明，AjTBK1 是激活NF-κB、I 型IFN 和MAPK 信號通路中的正調(diào)節(jié)劑，在機(jī)體抗細(xì)菌和抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）