發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)、抗氧化能力和腸道微生物群落的影響

姚海行，陳效儒，袁漢文，羅 凱，方 劉，陳 燚，郜衛(wèi)華*，田 娟，劉永勝

(1.長(zhǎng)江大學(xué)，澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 荊州 434024；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；3.通威股份有限公司，水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；4.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264003)

發(fā)酵技術(shù)用于食品加工和保存已有數(shù)千年的歷史[1]。發(fā)酵飼料是以飼料原料或者配合飼料為基礎(chǔ)，在人工控制條件下(含水量一般控制在70%以下)，利用天然或人工添加的益生菌進(jìn)行發(fā)酵，通過益生菌的代謝活動(dòng)生產(chǎn)富含益生菌及其代謝產(chǎn)物的新型飼料總稱[2]。廣泛應(yīng)用于發(fā)酵飼料的益生菌有乳桿菌(Lactobacillus)[3]、芽孢桿菌(Bacillus)[4]、酵母菌(Saccharomyces)[5]、曲霉菌(Aspergillus)[6-7]等。發(fā)酵飼料已廣泛應(yīng)用于飼養(yǎng)畜禽動(dòng)物，相較于傳統(tǒng)飼料，發(fā)酵飼料能夠有效提高飼料適口性、降低抗?fàn)I養(yǎng)因子(ANFs)、改善動(dòng)物腸道形態(tài)并維持腸道菌群平衡、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和消化率，從而提高養(yǎng)殖對(duì)象生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)和免疫能力[8-10]。發(fā)酵飼料在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究相對(duì)滯后，主要集中在發(fā)酵型植物蛋白原料[11-12]以及發(fā)酵原料替代魚粉[13-15]等對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能和飼料利用率等的影響。在甲殼動(dòng)物包括凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[2,13-14]和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[5,16]中的研究發(fā)現(xiàn)，使用不同菌株和發(fā)酵工藝均可提高甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)性能、消化力、免疫力以及改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)，俗稱小龍蝦，隸屬十足目(Decapoda)螯蝦科 (Cambaridae)[17]。2020 年，我國(guó)克氏原螯蝦養(yǎng)殖總面積達(dá)到1 456.42千hm2，養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到239.37 萬 t，位列我國(guó)淡水養(yǎng)殖品種第6 位，同比2019 年分別增長(zhǎng)13.25%和14.55%[18]。然而，克氏原螯蝦面臨著高效養(yǎng)殖技術(shù)缺乏、提質(zhì)增效空間受限、苗種繁育能力滯后、品質(zhì)退化等[19]諸多問題，且“五月瘟”等細(xì)菌性、病毒性疾病流行也給克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)以克氏原螯蝦為研究對(duì)象，旨在評(píng)估發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)、抗氧化能力和腸道微生物的影響，為發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦實(shí)際生產(chǎn)與應(yīng)用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

對(duì)照組飼料(control feed,CON)為煙臺(tái)大樂飼料有限公司生產(chǎn)的克氏原螯蝦全價(jià)配合飼料。發(fā)酵飼料(fermented feed,FF)采用固態(tài)發(fā)酵法，按照酵母菌∶植物乳桿菌∶芽孢桿菌＝1∶1∶1 (單位體積活菌數(shù))接種益生菌，37°C 恒溫發(fā)酵房?jī)?nèi)發(fā)酵15～24 h，發(fā)酵為軟顆粒飼料。發(fā)酵飼料的無氮浸出物含量降低≥ 10%，小肽含量≥ 18%；將發(fā)酵飼料放入活菌專用密封袋包裝，在常溫、避光處可保存6 個(gè)月。主要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)及水解氨基酸含量見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)成分及水解氨基酸含量 (干重)Tab.1 Nutritional composition and hydrolyzed amino acid content of experimental feed (dry matter) %

1.2 養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)蝦苗購(gòu)自荊州市高清水產(chǎn)專業(yè)合作社，暫養(yǎng)在長(zhǎng)江大學(xué)水產(chǎn)基地的半室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)，開始暫養(yǎng)前用聚維酮碘對(duì)養(yǎng)殖桶進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)采用半室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)，設(shè)置對(duì)照組和發(fā)酵組，選擇6 個(gè)底面積為1.8 m2的塑料桶，每個(gè)塑料桶放20 尾克氏原螯蝦，每組3 個(gè)重復(fù)。24 h 饑餓處理后，挑選個(gè)體平均體重 (4.91±0.18) g 的幼蝦隨機(jī)分配到6 個(gè)塑料桶中開展實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行8 周。每個(gè)養(yǎng)殖桶中放入20 根(直徑9 cm，長(zhǎng)20 cm) PVC 水管以及適量塑料仿生水草以供蝦苗攀爬和躲避，水體pH 值控制為7.0±0.5，溶解氧不低于5.0 mg/L，氨氮控制在0.1 mg/L 以下。每2天換水1/2，每天進(jìn)行清污，并記錄當(dāng)天的水溫和氣溫。實(shí)驗(yàn)期間每天飽食投喂2 次，投喂時(shí)間分別為8:00 和17:00。本研究獲得了長(zhǎng)江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》倫理規(guī)范，并按照長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將克氏原螯蝦禁食24 h。將所有蝦撈出，吸干體表水分，稱重并統(tǒng)計(jì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶存活數(shù)量。每桶隨機(jī)取10 尾蝦，測(cè)定體重和肝胰腺重，用于生長(zhǎng)指標(biāo)的分析。用一次性無菌注射器將血液從圍心腔抽出，儲(chǔ)存在1.5 mL 的離心管中，離心(4 °C、14 400 ×g，30 min)取上清液，于-80 °C 保存血清。取腸道組織固定在4%多聚甲醛中，用于制備腸道蘇木精-伊紅(H.E)染色切片。稱取肌肉，于-20 °C 冰箱保存，用于計(jì)算含肉率及測(cè)定水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量。每桶隨機(jī)挑取4 尾蝦，用75%乙醇擦拭蝦體進(jìn)行消毒，再用無菌生理鹽水沖洗2～3 次，在無菌操作條件下取出腸道及內(nèi)容物，將4 尾蝦的腸道組織混合樣本凍于干冰中，用于分析腸道微生物菌群。每桶隨機(jī)挑取2 尾鮮蝦，用于肌肉質(zhì)構(gòu)分析。其余實(shí)驗(yàn)蝦于冰上迅速取出肝胰腺和腸道組織，置于-80 °C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分析方法

飼料水中穩(wěn)定性測(cè)定 準(zhǔn)確稱取各組飼料10 g，放入尼龍過濾網(wǎng)袋(高30 cm，寬20 cm呈長(zhǎng)方形，孔徑0.25 mm)，將網(wǎng)袋置于恒溫水浴鍋中，水溫在25～28 °C，浸泡一定時(shí)間后取出網(wǎng)袋，將網(wǎng)袋內(nèi)飼料置于105 °C 烘箱烘干至恒重(W，g)，另測(cè)定未浸泡的飼料水分含量(X，%)。每組飼料設(shè)3 個(gè)重復(fù)，水中穩(wěn)定性用溶失率C 表示。

C(%)=[G(1-X)-W]/G(1-X)×100%式中，C為溶失率(%)；X為試樣含水率(%)；G為試樣質(zhì)量(g)；W為烘干后網(wǎng)袋內(nèi)試樣質(zhì)量(g)。

生長(zhǎng)性能測(cè)定 計(jì)算公式

增重率 (weight gain rate，WGR，%)=(Wt-W0)/W0×100%

存活率 (survival rate，SR，%)=Nt/N0×100%

特定生長(zhǎng)率 (specific growth rate，SGR，%/d)=(lnWt-lnW0)/t×100%

飼料系數(shù) (feed conversion ratio，F(xiàn)CR)=Wf/(WtNt-W0N0+Wd)

肝體比 (hepatosomatic index，HSI，%)=Wh/Wt×100%

含肉率 (flesh content，F(xiàn)C，%)=Wm/Wt×100%式中，Wt為終末體重 (g)；W0為初始體重 (g)；Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)；Wf為飼料攝入量(g)；Wd為死亡總重(g)；Wh為肝胰腺重(g)；Wm為蝦尾部肌肉重(g)。

基本營(yíng)養(yǎng)成分分析 飼料中的水分含量采用105 °C 直接干燥法(GB/T 5009.3—2010)；肌肉水分采用冷凍干燥法(SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機(jī))測(cè)定；粗蛋白采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2016)；粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T 5009.6—2016)；灰分采用灼燒稱重法(GB/T 5009.4—2016)。

腸道組織切片測(cè)定 腸道組織標(biāo)本固定后，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、連續(xù)切片后，H.E 染色，使用DM2500 (Leica，德國(guó))對(duì)染色切片進(jìn)行觀察及拍照，運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0)對(duì)H.E 染色結(jié)果進(jìn)行分析。

腸道消化酶活性測(cè)定 準(zhǔn)確稱取新鮮肝胰臟和腸道組織(約0.8 g)，放入10 mL 勻漿管中，加入9 倍體積的去離子水，用玻璃勻漿器進(jìn)行冰浴勻漿，離心(3 000 ×g，10 min，4 °C)，取上清液待測(cè)。使用福林酚試劑法測(cè)定胰蛋白酶(TPS)活性，使用甲基試鹵靈底物法測(cè)定脂肪酶(LPS)活性，以及采用淀粉-碘比色法測(cè)定淀粉酶(AMS)活性。所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

血清、肝胰腺抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 使用磷酸苯二鈉法測(cè)定酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP) 活性，其活性單位定義為，100 mL 血清或每克組織蛋白在37 °C 與基質(zhì)作用30 min 產(chǎn)生 1 mg 酚為1 個(gè)活性單位；采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，其活性單位定義為，在本反應(yīng)體系中 SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD 活性單位(U)；采用ABTS 法測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)；采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法進(jìn)行測(cè)定丙二醛(MDA)含量。所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

肌肉質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定 解剖取新鮮腹部第三節(jié)肌肉，使用TMC-Pro 質(zhì)構(gòu)儀(FTC 公司，美國(guó))，以質(zhì)構(gòu)剖面分析(texture profile analysis，TPA)方法測(cè)定肌肉的硬度、彈性、內(nèi)聚性、黏附性、膠黏性和咀嚼性等指標(biāo)。具體參數(shù)：P/50 柱形探頭，感應(yīng)量程1 000 N，上升高度20 mm，形變量70%，檢測(cè)速度60 mm/min，起始力1 N，間隔時(shí)間5 s。每尾平行測(cè)定3 次，以平均值作為該樣品的質(zhì)構(gòu)特性值。

肌肉氨基酸測(cè)定 新鮮的肌肉樣品經(jīng)冷凍干燥，粉碎之后，取0.1 g 肌肉凍干樣(精確到4位小數(shù))采用鹽酸水解法(色氨酸除外)測(cè)定結(jié)合氨基酸含量。具體操作：將樣品放入安瓿瓶中，加入6 mol/L 優(yōu)級(jí)純鹽酸，經(jīng)超聲和抽真空后封口，110 °C 烘箱內(nèi)水解14 h，靜置30 min，取上清液l mL，放在小瓶子內(nèi)真空干燥，加入2 mL 0.1 mol/L的鹽酸回溶，之后用注射器取1 mL 用0.22 μm 濾膜過濾，上樣，采用氨基酸自動(dòng)分析儀(L-8900,日立)測(cè)定。

腸道微生物菌群分析 每組取3 個(gè)樣品進(jìn)行腸道微生物多樣性測(cè)序。取約0.6 g 腸道內(nèi)容物與黏膜混合樣品，采用16SrRNA基因測(cè)序并分析腸道微生物。在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序工作，通過Illumina Miseq 平臺(tái)進(jìn)行高通量雙末端測(cè)序。測(cè)序后使用UPARSE 軟件(V 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行分類操作單元(OTU)聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋。比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。具體測(cè)定方法和分析方法參照Yu 等[21]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD) 表示，應(yīng)用SPSS 26.0 軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料水中穩(wěn)定性

隨著在水中浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，飼料的溶失率逐漸增大。在浸泡1 h 時(shí)兩組間無顯著性差異(P>0.05)，在分別浸泡2、4、12 h 時(shí)，F(xiàn)F 組飼料溶失率均顯著低于CON 組(P<0.05) (表2)。

表2 浸泡不同時(shí)間對(duì)飼料溶失率的影響Tab.2 Effect of different feeding time on feed dissolution rate

2.2 生長(zhǎng)性能

由表3 可知，F(xiàn)F 組的增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于CON 組(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著低于CON組(P<0.05)，肝體比、含肉率兩組間無顯著性差異(P>0.05)。

MCV-B161S（T）超凈工作臺(tái)（Sanyo公司）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司）；BS124S型電子天平（Sartorius公司）；3K15低溫離心機(jī)（Sigma公司）；1510酶標(biāo)儀（Thermo公司）；043BR42402垂直電泳儀、ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

表3 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響Tab.3 Effect of fermented feed on growth performance of P. clarkii

2.3 肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分和質(zhì)構(gòu)特性分析

由表4 可知，F(xiàn)F 組肌肉中粗蛋白、粗脂肪和灰分均高于CON 組，但無顯著性差異(P>0.05)；FF 組的硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性顯著高于CON 組，黏附性顯著低于CON(P<0.05)，而內(nèi)聚性兩組間無顯著性差異(P>0.05) (表5)。

表4 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉體成分的影響(濕重)Tab.4 Effect of fermented feed on body composition in muscle of P. clarkii (wet mass) %

表5 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦質(zhì)構(gòu)特性的影響Tab.5 Effect of fermented feed on flesh texture properties of P. clarkii

2.4 肌肉氨基酸

克氏原螯蝦肌肉中檢測(cè)出了17 種氨基酸(表6)，不同處理下克氏原螯蝦肌肉氨基酸含量存在一定差異：其中FF 組異亮氨酸含量顯著低于CON 組(P<0.05)；FF 組絲氨酸含量顯著高于CON組(P<0.05)；其他氨基酸含量?jī)山M間無顯著性差異(P>0.05)。

表6 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉氨基酸組成的影響 (濕重)Tab.6 Effect of fermented feed on muscle amino acid composition of P. clarkii (wet mass) %

2.5 消化酶活性

發(fā)酵飼料可顯著提高克氏原螯蝦肝胰腺和腸道胰蛋白酶、脂肪酶活性(P<0.05)，淀粉酶相較于CON 組均無顯著性差異(P>0.05) (表7)。

表7 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦腸道和肝胰腺消化酶活性影響Tab.7 Effects of fermented feed on digestive enzyme activities in intestine and hepatopancreas of P. clarkii

2.6 抗氧化能力指標(biāo)

發(fā)酵飼料顯著升高了血清和肝胰腺中SOD、AKP 和ACP 活性，顯著降低了MDA 含量(P<0.05)。T-AOC 活性在肝胰腺中顯著升高 (P<0.05)，而在血清中無顯著性差異(P>0.05) (表8)。

2.7 腸道組織切片

對(duì)照組克氏原螯蝦的絨毛長(zhǎng)度和寬度分別為(352.21±15.31) μm 和 (256.73±10.71) μm，發(fā)酵飼料組較對(duì)照組分別顯著提高24.14%和32.65%(P<0.05)。

2.8 腸道微生物菌群

圖1 克氏原螯蝦腸道微生物組成Venn 圖(OUT 水平)Fig.1 Venn diagram of intestinal microbial composition of P. clarkii (OUT level)

Alpha 多樣性 對(duì)克氏原螯蝦腸道微生物Alpha 多樣性進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示，各樣本文庫(kù)覆蓋率(coverage)均超過 99.9%，其中FF 組的Simpson 指數(shù)顯著低于CON 組(P<0.05)，Chao1指數(shù)、ACE 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05) (圖2)。

圖2 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦Alpha 多樣性的影響1.Chao 1 指數(shù)；2.ACE 指數(shù)；3.Simpson 指數(shù)；4.Shannon 指數(shù)；5.覆蓋率；圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同。Fig.2 Effect of fermented feed on Alpha diversity of P. clarkii1.Chao 1 index;2.ACE index;3.Simpson index;4.Shannon index;5.coverage index;different letters indicate a significant difference(P<0.05);the same below.

腸道微生物群落組成 在門水平上，CON 組和FF 組樣品的腸道優(yōu)勢(shì)菌群組成相似，其中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)在各樣本中變化較大，相對(duì)豐度最高的是厚壁菌門，之后依次是變形菌門、放線菌門和擬桿菌門(Bacteroidota)，這4 類優(yōu)勢(shì)菌群占腸道菌群的90%，排名前6 的細(xì)菌豐度之和占比超過98%(圖3-a,b)。在屬水平上將相對(duì)豐度最高的10 個(gè)屬列出，其中相對(duì)豐度較高的主要有Candidatus bacilloplasma、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、希瓦氏菌屬 (Shewanella)、弧菌屬(Vibrio)等(圖3-c,d)。FF 組厚壁菌門和放線菌門相對(duì)豐度顯著高于CON 組(P<0.05)。在屬水平上，F(xiàn)F 組C.bacilloplasma相對(duì)豐度顯著低于CON 組(P<0.05) (圖4)。

圖3 克氏原螯蝦腸道微生物在門水平(a)、(b)和屬水平上(c)、(d)的群落組成Fig.3 Community composition of intestinal microorganisms in P. clarkii at phylum level (a),(b) and genus level (c),(d)

圖4 克氏原螯蝦腸道微生物在門水平和屬水平差異菌群分析1.厚壁菌門；2.放線菌門；3.C. bacilloplasma。Fig.4 Analysis of the difference flora of intestinal microbes in P. clarkii at the phylum level and the genus level1.Firmicutes ;2.Actinobacteria ;3.C. bacilloplasma.

腸道微生物功能預(yù)測(cè) 基于腸道微生物測(cè)序結(jié)果和COG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)克氏原螯蝦腸道微生物群落功能進(jìn)行PICRUSt 預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，在兩組克氏原螯蝦中，能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運(yùn)輸和代謝和無機(jī)離子的運(yùn)輸和代謝等功能占比較高。FF 組包括核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝和復(fù)制、重組和修復(fù)等在內(nèi)的16 種功能相較CON 組豐度增加(圖5)。

圖5 克氏原螯蝦腸道微生物功能預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of intestinal microbial functions of P. clarkii

3 討論

3.1 發(fā)酵處理對(duì)飼料水穩(wěn)定性的影響

顆粒飼料水中穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)水產(chǎn)飼料物理質(zhì)量的參數(shù)之一[22]。飼料制粒加工條件、飼料配方和黏合劑類型均會(huì)影響飼料水穩(wěn)定性，其中可控的加工條件如飼料水分、溫度、螺桿速度和模具直徑可直接影響飼料的物理性狀，一般認(rèn)為較高水分和較小粒徑的飼料顆粒具有更好的水穩(wěn)定性[23]。穩(wěn)定性差的飼料顆粒會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)快速流失，從而導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)不良、飼料系數(shù)增加和水質(zhì)惡化等[24]。在甲殼類動(dòng)物的養(yǎng)殖過程中，因其相對(duì)緩慢和間歇性的攝食，以及在攝食時(shí)需通過口器和附足來獲取食物等特殊的攝食行為[25]，對(duì)飼料顆粒在水中穩(wěn)定性有更高的要求。因此，優(yōu)質(zhì)的甲殼動(dòng)物飼料顆粒應(yīng)在最初的3 h 內(nèi)具有良好的水穩(wěn)定性[26]。本實(shí)驗(yàn)中，飼料經(jīng)發(fā)酵處理后溶失率顯著降低，說明發(fā)酵有利于提高飼料顆粒水穩(wěn)定性。究其原因，可能是飼料在發(fā)酵過程中益生菌產(chǎn)生分解纖維的酶類將植物細(xì)胞壁中的纖維降解為水溶性碳水化合物[27]以及增加飼料小肽含量，增加了飼料中結(jié)合水的含量，改變了原有飼料的物理性狀，從而增加飼料顆粒在水中穩(wěn)定性，其具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響

本研究中，發(fā)酵飼料有效提高了克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能，這與在革胡子鲇(Clarias gariepinus)[28]、凡納濱對(duì)蝦[2,13-14]、大口黑鱸(Micropterus salmoides)[3]、中華絨螯蟹[5]、真鯛 (Pagrus major)[7,15]等研究中有相似結(jié)果。這可能是經(jīng)益生菌發(fā)酵處理后，飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(ANF)被有效降解，所包含的大分子物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為更容易消化吸收的小肽和有機(jī)酸，增加了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并提高飼料利用率，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[3,10]。此外，生長(zhǎng)性能和飼料效率的增強(qiáng)還可能與消化酶活性的提高有關(guān)。消化酶的活性可反映機(jī)體對(duì)飼料的消化利用程度，消化酶活性越高，意味著機(jī)體對(duì)飼料的利用越充分[29]。本研究中發(fā)酵飼料顯著提高了克氏原螯蝦胰蛋白酶和脂肪酶的活性，進(jìn)而提高了生長(zhǎng)性能和飼料效率。

3.3 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響

本研究結(jié)果表明，投喂發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分均無顯著性影響，這與發(fā)酵飼料在大口黑鱸[3]、斑馬魚(Danio rerio)[30]、真鯛[15]等物種中的研究結(jié)果一致。然而，Xu 等[5]使用嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)發(fā)酵豆粕后替代部分魚粉飼喂中華絨螯蟹，顯著提高了粗蛋白含量。造成這一差異的結(jié)果可能與菌株發(fā)酵、食物組成、動(dòng)物種類和發(fā)育階段有關(guān)。

水產(chǎn)品是人體獲得必需氨基酸(EAA)的重要來源之一，因此，EAA 的含量及比例是決定食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[31]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)所提出的理想氨基酸模式，EAA 總量占氨基酸總量的百分比(EAA/AA)約為0.40，(EAA/NEAA) 在 0.60 以上則被認(rèn)為是質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)[32]。本實(shí)驗(yàn)中，克氏原螯蝦肌肉中EAA/AA (0.50～0.51)和EAA/NEAA (1.00～1.04)均超過標(biāo)準(zhǔn)，表明克氏原螯蝦肌肉必需氨基酸滿足率較高，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的水產(chǎn)動(dòng)物。

水產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性決定了其在食用時(shí)的口感，日益受到消費(fèi)者的重視[33]。模擬魚肉在口腔中的行為，彈性越大，咀嚼性越好，肉質(zhì)越爽脆[34]。在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)F 組克氏原螯蝦肌肉的硬度、彈性、咀嚼性較CON 組顯著上升，說明投喂發(fā)酵飼料使得克氏原螯蝦肌肉在被咀嚼時(shí)口感更佳。這可能與飼料經(jīng)發(fā)酵處理后產(chǎn)生的小肽、氨基酸、核苷酸、殼聚糖和消化酶等營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)[35]。

3.4 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦抗氧化能力的影響

非特異性免疫是甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)病菌的主要抵抗方式，非特異性免疫酶活性的變化是衡量甲殼動(dòng)物免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，主要包括抗氧化酶系和非抗氧化酶系[36]。抗氧化系統(tǒng)與水生動(dòng)物的健康狀況和免疫系統(tǒng)相關(guān)[12]，包括TAOC 和SOD[2]。另外MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，是內(nèi)源性氧化損傷的重要生物標(biāo)志物[11]。此外，磷酸酶被認(rèn)為是探索細(xì)胞對(duì)有毒污染物應(yīng)激反應(yīng)的多功能酶生物標(biāo)志物[37]。AKP 的活性與環(huán)境密切相關(guān)，在甲殼動(dòng)物的防御機(jī)制中直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，具有防御的功能[30]。ACP 是機(jī)體巨噬細(xì)胞溶酶體的一種符號(hào)酶，主要參與細(xì)胞的吞噬、解體與吸收等過程，反映了巨噬細(xì)胞的激活程度[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，投喂發(fā)酵飼料顯著提高了血清和肝胰腺SOD、ACP 和AKP活性，顯著降低了MDA 的含量，顯著提高肝胰腺T-AOC 活性，有效改善克氏原螯蝦的抗氧化功能，緩解克氏原螯蝦的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)了機(jī)體非特異性免疫能力。這與凡納濱對(duì)蝦[13]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[6]、真鯛幼魚[15]研究結(jié)果類似。

3.5 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦 腸道組織結(jié) 構(gòu)的影響

腸道是水產(chǎn)動(dòng)物重要的消化場(chǎng)所，腸道組織的完整性是行使消化功能的前提[38]。蝦類腸道中段上皮細(xì)胞游離面具有發(fā)達(dá)的微絨毛，大大增加了消化和吸收的面積，結(jié)締組織和肌肉束中含有血竇可以進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存和運(yùn)輸[38-39]。腸道組織絨毛高度、寬度、數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)在一定程度上反映腸道消化吸收能力的強(qiáng)弱[40]。肌肉層與水產(chǎn)動(dòng)物腸道節(jié)律性蠕動(dòng)相關(guān)，其肌肉層完整度可反映腸道機(jī)械消化能力[41-42]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于CON 組，F(xiàn)F 組腸道絨毛長(zhǎng)度和寬度均顯著高于CON 組。究其原因可能是飼料經(jīng)發(fā)酵處理后所包含的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小肽[3]，而小肽對(duì)腸道組織中刷狀緣酶活性有一定的刺激作用，并且可以加速腸道絨毛增長(zhǎng)[43-44]。這與發(fā)酵飼料在大口黑鱸[3]、美國(guó)牛蛙(Lithobates catesbeianus)[10]、大菱鲆[6,11]等物種中的研究結(jié)果一致。總體來說，消化酶活性越高，意味著機(jī)體對(duì)飼料的利用越充分[29]，而腸道組織結(jié)構(gòu)完整、功能完善及腸道菌群組成的改變均會(huì)影響消化酶活性[45]。

3.6 發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦腸道菌群的影響

腸道微生物的結(jié)構(gòu)和組成影響著宿主的免疫應(yīng)答、營(yíng)養(yǎng)吸收和能量平衡[29]。同時(shí)，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與功能緊密關(guān)聯(lián)，可以指示微生物評(píng)估宿主健康狀況。水生動(dòng)物腸道微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)平衡受到許多因素的影響，如自身的生理狀態(tài)、飼料組成、外界壓力和水環(huán)境等[46]。有研究表明，益生菌可以與宿主微生物競(jìng)爭(zhēng)受體和結(jié)合位點(diǎn)，超過其他微生物的生長(zhǎng)從而影響宿主微生物區(qū)系，促進(jìn)宿主生理，包括消化、免疫和維生素的合成[2,10]。本研究在門水平上，兩組腸道優(yōu)勢(shì)菌群均為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門。變形菌門是對(duì)攝入飲食表現(xiàn)敏感的一個(gè)門,種類包括很多病原菌[47]，如大腸桿菌(Escherichia coli)和霍亂弧菌(V.cholerae)，已被認(rèn)為是生物失調(diào)和疾病風(fēng)險(xiǎn)的潛在標(biāo)志[46,48-49]。厚壁菌門部分細(xì)菌將未消化的碳水化合物和氨基酸降解成短鏈脂肪酸，促進(jìn)克氏原螯蝦的代謝功能[50-51]。擬桿菌門對(duì)人體膳食纖維的降解起著重要作用[14]。通過與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，它還可以調(diào)節(jié)環(huán)境，從而影響某些細(xì)菌的生長(zhǎng)。此外，放線菌門在維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[50]。本實(shí)驗(yàn)中，投喂發(fā)酵飼料后克氏原螯蝦腸道變形菌門豐度下降，厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門豐度上升。在屬水平上，兩組克氏原螯蝦腸道菌群大多數(shù)沒有明確分類，其中發(fā)現(xiàn)攝食發(fā)酵飼料后顯著下降了腸道中C.bacilloplasma豐度，而檸檬酸桿菌屬、希瓦氏菌屬、弧菌屬等條件致病菌豐度有所上升。有研究表明，腸道菌群的生態(tài)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致宿主暴發(fā)疾病[51]，Huang 等[52]在研究腸道菌群的生態(tài)失調(diào)在凡納濱對(duì)蝦白便綜合癥(WFS)的致病作用中發(fā)現(xiàn)病蝦腸道菌群多富集弧菌屬、C.bacilloplasma和氣單胞菌屬(Aeromonas)，而檬酸桿菌屬、希瓦氏菌屬、氣單胞菌和弧菌屬在病變的腸道中占主導(dǎo)地位[2,46,50]。在本實(shí)驗(yàn)中，雖然顯著降低了C.bacilloplasma豐度，但檬酸桿菌屬、希瓦氏菌屬、弧菌屬等條件致病菌豐度均有所上升，最終并沒有引起克氏原螯蝦暴發(fā)疾病，分析可能因?yàn)榘l(fā)酵飼料促進(jìn)有益菌門在腸道內(nèi)定植進(jìn)而穩(wěn)定了腸道菌群生態(tài)平衡，其具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

在腸道微生物區(qū)系的預(yù)測(cè)功能分析中，結(jié)果顯示，克氏原螯蝦腸道菌群主要的功能與新陳代謝類功能有關(guān)，包括能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、無機(jī)離子的運(yùn)輸和代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝等功能，表明腸道菌群參與了機(jī)體代謝過程。在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門較對(duì)照組豐度上升。厚壁菌門部分細(xì)菌參與將未消化的碳水化合物和氨基酸降解成短鏈脂肪酸，促進(jìn)克氏原螯蝦的代謝功能[47-48]，說明克氏原螯蝦腸道內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門可能在機(jī)體新陳代謝中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但其具體作用機(jī)理，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼料經(jīng)發(fā)酵處理后可以增強(qiáng)飼料水中穩(wěn)定性，有效提高克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)、消化力、抗氧化能力，改善腸道組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)改變了克氏原螯蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)，提升了群落的多樣性，促進(jìn)其他益生菌的生長(zhǎng)，發(fā)揮益生作用。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）