不同鹽度低滲脅迫處理對龍須菜切段再生能力及光合生理的影響

佘婷婷，鐘晨輝，林 琪*，唐隆晨，宦忠艷，周文發(fā)

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；3.莆田市正洋水產(chǎn)發(fā)展有限公司，福建 莆田 351100)

鹽度是調控海藻生長發(fā)育的重要生態(tài)因子之一，也決定著海藻的自然分布[1]。相關研究發(fā)現(xiàn)，河海交匯區(qū)鹽度變化對腸滸苔(Enteromorpha intestinalis)的分布和生長速率產(chǎn)生了顯著影響[2]。高鹽脅迫下鼠尾藻(Sargassum thunbergii)的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)顯著降低，但轉移至正常鹽度海水中培養(yǎng)后又可迅速恢復至正常水平[3]。一定范圍內鹽度的增加可以促進條斑紫菜(Pyropiayezoensis)葉狀體的甘露醇積累[4]。低滲處理羊棲菜(Sargassum fusiforme)不會降低其光合生理指標，且經(jīng)過短時淡水處理后不僅可以清除養(yǎng)殖網(wǎng)簾上的雜藻，還將增強羊棲菜的光合活性[5]。值得注意的是，一些潮間帶的產(chǎn)膠藻類時常經(jīng)歷陸源徑流的淡水匯入、退潮干出后的突發(fā)降雨及漲潮后的復水等鹽度變化過程，表現(xiàn)出了對短時低滲脅迫的適應性。相關研究表明，壇紫菜(P.haitanensis)在鹽度5 的低滲脅迫下可以維持較高的K+水平，進而維持較高的K+/Na+，保證了光合作用的正常進行[6]。過低的鹽度也可維持細基江蘺繁枝變型(Gracilaria tenuistipitatavar.liui)的瓊膠合成[7]。在正常鹽度26 和低鹽16 的環(huán)境下栽培提克江蘺(G.tikvahiae)，二者的生長速率也不存在差異[8]。其次，由于河水的注入，生長在河口區(qū)的真江蘺(G.vermiculophylla)經(jīng)常遭遇低滲脅迫，雖然其最適生長鹽度為15～30，但是在鹽度0.5 條件下仍可以存活數(shù)周[9-10]。

龍須菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是一種生長在潮間帶的產(chǎn)膠紅藻，也是在我國南北方海區(qū)被廣泛栽培的一種重要的大型經(jīng)濟藻類。目前龍須菜的人工栽培主要依靠營養(yǎng)繁殖的方式來進行。營養(yǎng)體繁殖雖然生長快，栽培過程操作簡單，但是我國南方夏季高溫期漫長，適宜的藻體生長期偏短，難以進行龍須菜的周年化栽培。如何在有限的適養(yǎng)時間里，通過優(yōu)化苗種擴繁方式，加快龍須菜的營養(yǎng)生長，提高龍須菜產(chǎn)量具有重要的產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義。在生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，利用淡水沖洗或短時間浸泡龍須菜可以加快藻體的生長，縮短單茬養(yǎng)殖時間，提高經(jīng)濟效益[11]。然而這一操作過程中低滲脅迫處理對藻體的促生長效應和生理適應策略仍不清楚。鑒于此，本研究以福建海區(qū)主要栽培的龍須菜新品種“魯龍1 號”(品種登記號：GS-04-001-2014)作為實驗材料[12]，在室內培養(yǎng)條件下，探究了龍須菜藻體切段在不同鹽度和不同處理時間下的出芽生長和光合生理指標的變化情況，以期篩選出最適的低滲處理方式，為建立龍須菜苗種的快速擴繁技術提供新參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用龍須菜為“魯龍1 號”新品種，采自福建省莆田市南日島的人工栽培海域，在低溫避光條件下運回實驗室。將新鮮的龍須菜置于滅菌海水中，用軟毛刷反復刷洗以清除表面附著雜藻，清理完畢后置于滅菌海水中培養(yǎng)2 周。培養(yǎng)條件：溫度 (22.0±0.5) °C，光照強度15 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，鹽度26.000，培養(yǎng)液為Provasoli’s Enriched Seawater (PES)[13]，每3 天更換1 次。

1.2 實驗方法

藻段制備 選擇完整、健康的龍須菜藻體，再次用滅菌海水清洗以去除附生雜藻。用消毒刀片切取藻體的主枝部分，且剔除側枝，切成長度為1.5 cm 的藻段。

低滲培養(yǎng)液配置 以龍須菜養(yǎng)殖海區(qū)的海水鹽度26.000 作為正常鹽度，取用PES 培養(yǎng)基(對照，鹽度 26.000)加入無菌蒸餾水(鹽度0.000)，二者分別按3∶1、1∶1 和1∶3 的比例，將培養(yǎng)液鹽度稀釋至 19.500、13.000 和6.500。鹽度0.000的淡水為滅菌超純水。

脅迫設計 將預先制備的藻段按同等數(shù)量和重量[20 根，總重量(0.465±0.010) g]分別轉入含有150 mL PES 培養(yǎng)液的燒杯中，依次進行低鹽脅迫(鹽度 0.000、6.500、13.000 和19.500)處理，處理時間分別設置為1、3、6、12 和20 h，脅迫結束后立即轉移至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)(鹽度26.000)。未進行鹽度脅迫的實驗組為對照組(鹽度26.000)，每個處理組設置3 個生物學重復。后續(xù)培養(yǎng)期間的培養(yǎng)條件：溫度 (22±0.5) °C，光照強度30 μmol/(m2·s)，光照周期12 L︰12 D，每3 天更換1 次PES 培養(yǎng)液。

生長指標測定 低滲脅迫處理后恢復正常鹽度培養(yǎng)，每隔3 天測定1 次藻段的生長指標，包括總出芽數(shù)(TB)和鮮重(FW)，并記錄藻段的生長情況，培養(yǎng)周期為28 d。測定龍須菜藻段在恢復正常鹽度培養(yǎng)過程中的生物量變化，以評估其生長。相對生長速率(RGR)的計算公式：

式中，W0為實驗開始時藻段的鮮重(g)；Wt為實驗結束時藻段的鮮重(g)；t為實驗天數(shù)(d)。

光系統(tǒng) PSⅡ最大光化學效率測定 分別測定了淡水(鹽度 0.000)脅迫1、3 和20 h 后恢復正常鹽度(鹽度 26.000)培養(yǎng)的實驗組和對照組(鹽度 26.000)的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)，各組均隨機測量7 根藻段。利用超便攜式調制葉綠素熒光儀MINI-PAM-Ⅱ(德國 WALZ 公司)測定藻段未脅迫前(OS)、脅迫結束時(ST)、恢復至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d (R2)、恢復至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d (R6)、恢復至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)11 d (R11)、恢復至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 d(R16)以及恢復至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)21d(R21)時的Fv/Fm。

主要光合色素含量測定 分別對淡水(鹽度 0.000)脅迫3 和20 h 和對照組(鹽度 26.000)的藻段進行取樣，測定ST、R2、R6 和R11 組藻段的光合色素含量。具體操作流程參考Sampath-Wiley 等[14]的方法。精確稱取0.1 g 藻段放入研缽中，在液氮下充分研磨至細粉狀。用1.5 mL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 6.8)分3 次沖洗細粉狀樣本，將沖洗液充分收集后裝入2.0 mL 聚丙烯離心管中，在4 °C 下，以11 000 r/min 轉速離心30 min。離心結束，將上清液轉移到新的離心管中，然后吸取1 mL 上清液稀釋3 倍，使用紫外分光光度計(UV-3200)分別測量在波長564、618 和730 nm處的吸光度值，以PBS 作為空白組，剩余藻膽蛋白上清液置于4 °C 保存。另外，將離心沉淀物取出，加入5 mL DMF (N,N-二甲基甲酰胺)，在4 °C 下萃取24 h。萃取結束后6 000 r/min冷凍離心10 min，將含有葉綠素的上清液轉移至新的離心管中，使用分光光度計分別讀取625、647、664 和750 nm 處的吸光度值，且以DMF 作為參照。藻紅蛋白(PE)含量(mg/g)、葉綠素a(Chl.a) 含量(mg/g)計算公式：

式中，N為稀釋倍數(shù)，Ve為萃取液(DMF)的體積(5 mL)，I為比色皿的光徑(3.5 cm)，W為所取藻體的鮮重(g)。

細胞超微結構的觀察 分別切取淡水(鹽度 0.000)脅迫3 和20 h 以及對照組(鹽度 26.000)藻段在ST 和R2 時藻段兩端處的薄片(1～2 mm3)。將切取的離體樣本取下，采用2.5%戊二醛(pH 7.5)冷固定，抽氣至樣本沉入2.5 mL EP 管底，室溫放置2 h 固定后置于4 °C 保存。再用PBS (pH 7.4)漂洗樣本3 次，每次15 min。之后用1%鋨酸(pH 7.4)在室溫下暗固定7 h，同樣用PBS (pH 7.4)漂洗3 次。再經(jīng)系列脫水、滲透包埋、聚合和超薄切片，最后用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色法進行染色。在日立HT7800 型透射電鏡(TEM)下觀察，采集圖像并進行分析。

統(tǒng)計分析 使用 Excel 2007 軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 19.0 軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05 作為差異顯著性水平，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 最適低滲濃度與時間組合的選擇及其對龍須菜切段再生的影響

觀察了實驗周期(28 d)內龍須菜藻段的生長情況。結果顯示，短于12 h 的低滲脅迫均可以促進龍須菜切段在恢復正常鹽度培養(yǎng)后的出芽，藻段的出芽數(shù)增加明顯，總出芽數(shù)均高于對照組。其中，淡水(鹽度 0.000)脅迫3 和6 h 后藻段的出芽數(shù)最多。而淡水脅迫超過20 h，藻體恢復正常鹽度培養(yǎng)后第3 天開始發(fā)白、碎裂，全部消亡(圖1，圖版Ⅰ)。

圖1 龍須菜藻段經(jīng)不同低滲脅迫處理后恢復至正常鹽度培養(yǎng)28 d 時的出芽數(shù)Fig.1 Number of regenerated buds of the algal fragments during 28 days of normal salinity culture after different treatments of hypo-osmotic stress in G. lemaneiformis

圖版Ⅰ 低滲脅迫后恢復正常鹽度培養(yǎng)28 d 的龍須菜藻段的形態(tài)1.對照組；2～5.淡水(鹽度 0.000)分別處理1、3、6 和12 h；6～10.鹽度 6.500 海水分別處理1、3、6、12 和20 h；11～15.鹽度 13.000 海水分別處理1、3、6、12 和20 h；16～20.鹽度 19.500 海水分別處理1、3、6、12 和20 h；21.藻段淡水脅迫20 h，藻體在4 d 內全部死亡。Plate Ⅰ Morphology of 28 days old algal fragments cultured at normal salinity after different treatments with hypo-osmotic stress in G. lemaneiformis1.control group;2-5.freshwater (S 0.000) treatment for 1,3,6 and 12 h,respecitively;6-10.seawater (S 6.500) treatment for 1,3,6,12 and 20 h,respecitively;11-15.seawater (S 13.000) treatment for 1,3,6,12 and 20 h,respecitively;16-20.seawater (S 19.500) treatment for 1,3,6,12 and 20 h,respecitively;21.the algal fragments under freshwater for 20 h,all of them died within 4 days.

龍須菜藻段在低滲脅迫后恢復至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)28 d 后，藻段FW 的增加情況存在差異(表1)。淡水脅迫時間小于6 h 的藻段增重較多，其對應的RGR 較高，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。培養(yǎng)28 d 時，淡水脅迫3 h的藻段FW增加最多，生長速率最快，RGR 高達0.91%/d，較對照組提高了61.27% (圖2)。淡水脅迫時間超過12 h 的藻段FW 則出現(xiàn)負增長，藻體顏色逐漸褪去、潰爛，最終消亡。淡水脅迫20 h 藻段受脅迫最嚴重，相對生長速率為-8.62 %/d，藻段短時間內全部死亡，僅剩有部分殘渣。表明小于6 h的低滲脅迫對恢復正常鹽度培養(yǎng)過程的龍須菜切段再生具有促進作用，以淡水脅迫3 h 的效果最佳。

表1 龍須菜藻段低鹽脅迫后再恢復至正常鹽度培養(yǎng)28 d 時的鮮重變化Tab.1 Changes of fresh weight in the fragments of G. lemaneiformis cultured at normal salinity after different treatments of hypo-osmotic stress g

圖2 龍須菜藻段淡水脅迫后再恢復至正常鹽度培養(yǎng)28 d 內的相對生長率1～6.分別為淡水處理0、1、3、6、12 和20 h。不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05)。Fig.2 Relative growth rate of G. lemaneiformis fragments cultured in normal salinity medium for 28 days after treatment of hypo-osmotic stress with freshwater1-6.freshwater treatment time within 0,1,3,6,12 and 20 h,respectively.Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.2 淡水脅迫對龍須菜藻段Fv/Fm 的影響

比較了龍須菜藻段在耐受不同時間的淡水(鹽度 0.000)脅迫后恢復至正常鹽度(鹽度 26.000)培養(yǎng)過程中Fv/Fm的變化趨勢。結果顯示，經(jīng)1 h和3 h 淡水脅迫，藻段Fv/Fm出現(xiàn)略微下降，但仍與對照組相接近，轉移至正常鹽度培養(yǎng)后能迅速恢復至對照組水平，甚至高于對照組(圖3-a)。這表明龍須菜可以適應短時的極限低滲脅迫，短時低鹽脅迫對龍須菜的光合生理活性無明顯的負面影響。然而淡水脅迫20 h 時，藻段Fv/Fm值迅速下降至接近0，轉入正常鹽度培養(yǎng)后不能恢復生長(圖3-b)，說明龍須菜藻段在長時間的淡水脅迫下受到了不可逆的損傷。

圖3 淡水脅迫對龍須菜切段再生過程中Fv/Fm 的影響(a) 淡水脅迫1 和3 h 后的Fv/Fm 變化；(b)淡水脅迫20 h 后的Fv/Fm 變化。OS.未脅迫前，ST.脅迫結束時，R2、R6、R11、R16、R21 分別為藻段恢復至正常鹽度培養(yǎng)2、6、11、16 和 21 d，下同。Fig.3 Effects of hypo-osmotic stress with freshwater on Fv/Fm during the regeneration of algal fragments in G. lemaneiformis(a) changes of Fv/Fm after treatments of hypo-osmotic freshwater stress within 1 h and 3 h,respectively;(b) changes of Fv/Fm after treatment of hypoosmotic freshwater stress within 20 h.OS.before hypo-osmotic stress;ST.after hypo-osmotic stress;R2,R6,R11,R16,R21.sampling at the fragments restored to culture at normal salinity for 2,6,11,16 and 21 days,respectively.The same below.

2.3 光合色素含量檢測

單因素方差分析顯示，與對照組相比較，經(jīng)淡水(鹽度 0.000)脅迫后恢復至正常鹽度(鹽度26.000)培養(yǎng)的龍須菜藻段在同一取樣時間點的PE 含量差異顯著(P<0.05)，Chl.a含量差異顯著(P<0.05) (圖4)。與對照組相比較，淡水處理后龍須菜體內PE、Chl.a含量下降明顯(P<0.05)。然而恢復至正常鹽度海水培養(yǎng)后，經(jīng)淡水脅迫3 h的藻段的PE、Chl.a含量升高，且隨著恢復培養(yǎng)時間的增加而持續(xù)升高。藻段PE 含量在R6 組超過對照組水平，較對照組提高2.33%。Chl.a累積相對較慢，在R11 組才檢測到其含量超過對照組水平，超過對照組2.78%。然而，經(jīng)淡水脅迫20 h的藻段PE、Chl.a含量極速下降，且在第6 天取樣時藻體全部死亡，未能測定其含量。

圖4 3 和20 h 淡水脅迫后恢復正常鹽度培養(yǎng)的龍須菜切段的藻紅蛋白和葉綠素a 含量變化(a)葉綠素a 含量變化；(b)藻紅蛋白含量變化。不同小寫字母表示同一取樣時間點下不同時間處理組間差異顯著(P<0.05)。Fig.4 Changes of contents of phycoerythrin and chlorophyll a during the regeneration of algal fragments of G. lemaneiformis cultured at normal salinity after 3 h and 20 h treatments with hypo-osmotic freshwater stress(a) changes of contents of Chl. a;(b) changes of contents of phycoerythrin.Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.4 細胞超微結構觀察

通過透射電鏡觀察，對照組(鹽度 26.000)龍須菜藻段的表皮層細胞內細胞器排列整齊，清晰可見，呈現(xiàn)典型的紅藻內部結構。細胞內充滿豐富的色素體，色素體內包含的類囊體片層結構清晰，排列有序、間隔均勻，且少量的質體小球嵌合在類囊體內，一些紅藻淀粉顆粒和少量的脂質體分布于胞漿內(圖版Ⅱ-1,2)。細胞壁結構完整，層次分明(圖版Ⅱ-3)。

圖版Ⅱ 淡水脅迫3 和20 h 后及經(jīng)過脅迫后恢復正常鹽度培養(yǎng)的龍須菜藻段表皮細胞的超微結構1～2.培養(yǎng)第1 天的對照組藻段表皮細胞，含有完整的細胞壁、少量的紅藻淀粉顆粒和質體小球、零星的脂質體、豐富的色素體；3.對照組藻段的細胞壁；4～5.淡水處理3 h 藻段細胞內聚集著豐富的紅藻淀粉、質體小球以及體積增大的脂質體；6.龍須菜藻段淡水處理3 h 后再經(jīng)過2 d 的恢復培養(yǎng)，細胞含有的紅藻淀粉顆粒、質體小球減少，脂質體逐漸消失；7～8.淡水脅迫20 h 藻段細胞變形，細胞膜受損、胞內細胞器排列混亂、有明顯的腫脹現(xiàn)象；9.對照組藻段培養(yǎng)至第3 天的細胞超微結構。cw.細胞壁，c.色素體，s.紅藻淀粉粒，p.質體小球，ld.脂質體，thy.類囊體，n.細胞核，nu.核仁。Plate Ⅱ Ultrastructure of epidermal cell of algal fragments in G. lemaneiformis after 3 and 20 h treatments with hypo-osmotic freshwater and during rehydration with normal salinity culture medium1-2.the epidermal cell of the first day cultured algal fragments in the control group contains complete cell walls,a small amount of floridean starch grains and plastoglobuli,sporadic lipid droplets and abundant chloroplasts;3.enlarged view of the cell wall of epidermal cell in the control group;4-5.abundant floridean starch grains,plastoglobuli and lipid droplets with increased volume are accumulated in the epidermal cells of algal fragments after freshwater stress for 3 h;6.the freshwater treatment of algal fragments for 3 h,and then it undergoes two days of normal culture,floridean starch grains and plastoglobuli are reduced and lipid droplets in cytosol gradually disappeared;7-8.after hypo-osmotic stress with freshwater for 20 hours,the epidermal cell is deformed,and its cell membrane is damaged,organelles are disordered and involve obvious swelling;9.the ultrastructures of algal fragments in the control group until being cultured for three days.cw.cell wall,c.chloroplast,s.floridean starch grains,p.plastoglobuli,ld.lipid droplets,thy.thylakoid,n.nuclei,nu.nucleolus.

與對照組相比，受淡水(鹽度 0.000)脅迫的龍須菜藻段兩端切口處的表皮細胞的亞細胞器結構發(fā)生了明顯的變化，主要涉及色素體、紅藻淀粉顆粒、質體小球以及脂質體等(圖版Ⅱ-4～5,7～8)。經(jīng)3 h 淡水脅迫后，藻段表皮細胞的細胞壁仍然保持結構完整，胞內色素體結構正常，但紅藻淀粉顆粒密度增加，質體小球增多，脂質體體積增大(圖版Ⅱ-4～5)。脅迫結束恢復至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d，胞內色素體內嵌合的類囊體的片層結構排列緊密，脂質體逐漸消失，且色澤由暗淡變成透亮的紅藻淀粉顆粒和質體小球數(shù)量略有減少，但仍較對照組多(圖版Ⅱ-6,9)。然而，淡水脅迫20 h 后，藻段表皮細胞的超微結構發(fā)生了明顯改變，呈現(xiàn)出細胞膜破損，紅藻淀粉粒破裂，色素體形態(tài)不規(guī)則，類囊體被破壞，質體小球和脂質體數(shù)量減少(圖版Ⅱ-7～8)。

3 討論

3.1 最佳脅迫時間與脅迫鹽度組合的確定

本研究中，經(jīng)淡水(鹽度 0.000)脅迫3 h 的藻段未出現(xiàn)死亡，轉移至正常鹽度培養(yǎng)液中培養(yǎng)28 d 后表現(xiàn)出較多的出芽數(shù)和鮮重增加，藻段再生效果明顯，這說明淡水3 h 脅迫是龍須菜藻段的最佳脅迫鹽度和時間組合。相關研究表明，自然條件下棲息在潮間帶區(qū)域的江蘺屬海藻由于潮水的漲落，藻體長期經(jīng)歷著低潮失水與高潮復水的鹽度變化。在低潮時，干露地帶會遭受太陽暴曬，藻體周圍海水蒸發(fā)，鹽度升高，藻體受到高鹽脅迫。此時，若恰遇暴雨，藻體將受淡水沖刷，甚至會完全浸泡在淡水之中，藻體又需耐受低滲脅迫。高潮復水后，這些海藻又能在正常鹽度下迅速恢復生長[9-10]。這暗示著潮間帶的海藻在一定時間范圍內可能具有對低滲脅迫的適應能力，且在這一時間內鹽度改變并不會對這些藻類的生長產(chǎn)生不利的影響，甚至有助于藻體的生長發(fā)育[8-10]。但是淡水脅迫超過20 h 的龍須菜藻段則全部死亡，推測超長時間的低滲脅迫則會破壞藻體的滲透勢平衡，進而影響細胞的代謝反應和光合生理，由此阻礙藻體的生長發(fā)育[15]。另外，由于本研究中使用的實驗材料龍須菜主枝藻段在實驗前已經(jīng)去除細小側芽，因此本實驗結論不能代表藻體的整體情況。如果保留藻體側芽，推測藻段的耐受性將有所下降，最適淡水脅迫時間可能小于3 h，具體處理時間仍需進一步驗證。

3.2 短時淡水脅迫對龍須菜藻段切段再生過程中光合生理的影響

在植物中，光合作用不僅是將光能轉化為化學能的必要過程，且光合反應中心還是一種環(huán)境傳感器，當植物受到脅迫時最先表現(xiàn)在光合性能上[16-17]。藻類光系統(tǒng)PSⅡ的最大光化學產(chǎn)量(Fv/Fm)是植物光合性能的敏感指標，當植物受到脅迫時會顯著下降[18]。本研究中，雖然淡水(鹽度0.000)脅迫不超過3 h 的龍須菜藻段的Fv/Fm降低，但與對照組相差不大，轉移至正常鹽度培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d 內就可以迅速恢復至對照組水平，這表明短時低滲脅迫對Fv/Fm的影響較小，藻體對低滲的耐受能力較強。在培養(yǎng)后期藻段的Fv/Fm甚至高于對照組，可能是前期的低滲脅迫并沒有對龍須菜藻段產(chǎn)生不可逆的損傷，藻段細胞為快速適應低鹽環(huán)境而提高了細胞的代謝水平，光合性能增強。光合色素作為紅藻進行光合作用的物質基礎，能夠吸收、傳遞和轉換光能，其光能傳遞途徑依次為藻膽蛋白→類胡蘿卜素→葉綠素。在光合作用過程中葉綠素a、類胡蘿卜素及藻膽蛋白都直接或間接參與光反應，因此其含量和組成均會影響藻體的光合速率[19]。本研究中，龍須菜藻段經(jīng)3 h 淡水脅迫后，與光系統(tǒng) PSⅡ緊密相關的PE[20]含量下降，但恢復至正常鹽度培養(yǎng)后持續(xù)升高，最終高于對照組。這提示著龍須菜切段再生過程中藻段細胞一直保持較高的光子捕獲效率，且經(jīng)過短時淡水脅迫的龍須菜藻段較未作處理的藻段具有更高的光子捕獲效率。Chl.a與光系統(tǒng)PSⅠ緊密相關[20]，其含量在龍須菜切段再生過程中表現(xiàn)出與PE 相類似的變化趨勢，可能是淡水脅迫在短時間內限制了藻段的光合效率，但是藻段被轉移至正常鹽度下培養(yǎng)后加速了Chl.a的合成，使藻體各項機能逐漸恢復正常。另外，色素蛋白合成量的增加在提高藻體光合反應速率的同時也可能有助于清除胞內產(chǎn)生的氧自由基，以減少細胞的損傷[21]。

相關研究表明，短時間的鹽度脅迫不會對大型海藻的光合作用產(chǎn)生不利影響。徐涵等[22]研究認為，短期的高鹽脅迫會顯著影響脆江蘺(G.chouae)的各項光合生理指標，但繼續(xù)經(jīng)過24 h 正常鹽度培養(yǎng)后基本可恢復至對照組水平。Gao 等[5]研究表明，短時低滲處理不會抑制羊棲菜的光合活性，經(jīng)過淡水處理的藻體的光合活性甚至獲得增強。Wang 等[6]研究表明，壇紫菜葉狀體能夠適應鹽度5 的低鹽環(huán)境，且藻株的Fv/Fm無明顯變化，而經(jīng)淡水脅迫再復水后藻株的Fv/Fm隨脅迫時間顯著下降，葉片受到不可逆的功能損傷。類似的，本研究中淡水脅迫20 h 后龍須菜藻段的Fv/Fm迅速降低至0，PE、Chl.a含量明顯低于對照組，且在后期的恢復培養(yǎng)中不斷下降。推測長時間的淡水脅迫會對龍須菜藻段的光合電子傳遞產(chǎn)生影響，可能是長時間的淡水脅迫破壞了藻體的光合色素合成途徑，光系統(tǒng)PSⅡ反應中心受到不可逆的損傷，光合作用原初化學反應被抑制[23]。

3.3 淡水脅迫復水前后細胞超微結構的變化

生命體細胞的細胞器結構與功能是相適應的。色素體是大型海藻進行光合作用的主要場所，色素體被膜之內存在著由膜層形成的類囊體，用于執(zhí)行光能的吸收與轉化[24]。本研究中，龍須菜表皮層細胞充滿色素體，推斷龍須菜具有較強的光合能力。紅藻淀粉顆粒是儲存光合產(chǎn)物碳水化合物的細胞器[25]，質體小球具有儲存脂類物質、類胡蘿卜素、維生素K1和E 的功能[26]，脂質體則可提供質體再生所需質膜或為代謝活動提供能量[27]。此外，藻類色素體內嵌合的蛋白核發(fā)揮了光合功能和CO2濃縮機制(CCM)[28]。細胞超微結構的變化是一個復雜的動態(tài)過程，其根本原因是藻體為了適應環(huán)境，以維持逆境下的生理平衡。鹽度脅迫主要是通過濃度差影響滲透勢，導致細胞內外離子失衡，從而對細胞器產(chǎn)生破壞[29]。本研究中，經(jīng)淡水3 h 脅迫的藻段細胞內的紅藻淀粉顆粒密度顯著增加，質體小球數(shù)量增多，脂質體體積增大。這說明短時間淡水脅迫后龍須菜胞內大量的紅藻淀粉顆粒、質體小球等細胞器可能參與了應對不利的脅迫環(huán)境[30]。且當脅迫停止后轉移至正常鹽度培養(yǎng)，細胞內堆積的紅藻淀粉和質體小球可為藻段的生長發(fā)育提供豐富的能量物質，體積增大的脂質體可以作為切段再生過程中胞內的質體再生所需的中性脂，并維持質體氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)[27,31]。因此短時淡水脅迫后的藻段再生較對照組表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢。短時淡水脅迫后轉移至正常鹽度培養(yǎng)2 d，胞內的紅藻淀粉顆粒密度降低、質體小球減少、脂質體逐漸消失，這提示著能量物質的分解或動員有利于促進龍須菜藻段的出芽生長。而淡水脅迫20 h，藻段細胞長時間過度吸水，細胞結構和膜完整性被破壞，細胞器遭受永久性損傷。這說明過度的低滲脅迫則會抑制藻類細胞的代謝反應和光合生理，這與對提克江蘺和壇紫菜等的研究結果相似[6,8]。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）