短時(shí)受精結(jié)合早期補(bǔ)救ICSI的臨床應(yīng)用價(jià)值分析

莫麗芬，阮秋燕，勞艷萍，王超，莫房德，鐘慧芝，牛向麗

(廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院,南寧 530029)

輔助生殖技術(shù)(ART)的蓬勃發(fā)展為不孕不育的患者帶來(lái)了福音,但仍無(wú)法避免常規(guī)體外受精(IVF)的患者有10%～15%存在受精失敗[1]。即使是常規(guī)卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI),也有1%～3%的患者受精失敗或受精低下[2]。大多數(shù)受精失敗歸因于精液質(zhì)量太差或卵母細(xì)胞數(shù)量過(guò)少。在既往IVF周期中,授精后16～18 h觀察是否出現(xiàn)原核以判斷是否受精,若未出現(xiàn)原核,視為受精失敗,則立即進(jìn)行補(bǔ)救ICSI(R-ICSI)。然而臨床研究顯示,對(duì)過(guò)夜受精失敗卵母細(xì)胞實(shí)施R-ICSI后,受精率仍較低,可能是由于卵母細(xì)胞老化或精子代謝產(chǎn)物毒性的影響[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞在授精后4 h即出現(xiàn)第二極體[4]。在配子短期孵育4～6 h后去除顆粒細(xì)胞,可以早期發(fā)現(xiàn)受精率低或失敗,且不影響胚胎質(zhì)量,故短時(shí)受精成為一種早期觀察受精率并及時(shí)采取干預(yù)措施的有效方法。2003年,首次報(bào)道對(duì)授精后6 h未出現(xiàn)第二極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行R-ICSI,其受精結(jié)局和妊娠結(jié)局均優(yōu)于過(guò)夜補(bǔ)救,此后早期R-ICSI被廣泛應(yīng)用于臨床[5]。早期R-ICSI不僅可避免卵母細(xì)胞老化,還可以減少精子代謝產(chǎn)物對(duì)卵母細(xì)胞的不良影響,保證胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜的同步性。大量研究報(bào)道,在授精4～6 h后剝除顆粒細(xì)胞觀察第二極體排出情況,對(duì)IVF受精失敗或受精率低于30%的卵母細(xì)胞行R-ICSI,可提高受精率,有效減少這部分患者因無(wú)可移植胚胎而取消周期,并改善妊娠結(jié)局[6-7]。本研究將R-ICSI組、常規(guī)IVF和ICSI組患者的相關(guān)資料進(jìn)行比較,評(píng)估短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI對(duì)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響,探討短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI在IVF完全受精失敗和受精率低下周期中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2020年1月至2021年12月于廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院接受ART助孕治療的患者臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡20～35歲;(2)體質(zhì)量指數(shù)(BMI)處于正常范圍(18.5～24.9 kg/m2);(3)激素水平均處于正常范圍,FSH(1～10 U/L)、LH(1～10 U/L)、E2(100～400 pmol/L);(4)促排卵方案為卵泡期長(zhǎng)方案、黃體期長(zhǎng)方案、超長(zhǎng)方案和拮抗劑方案;(5)獲卵數(shù)≥5個(gè);(6)第一次IVF/ICSI助孕;(7)選擇D3胚胎或D5囊胚進(jìn)行移植。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)排除使用供體卵子/精子、子宮異常、嚴(yán)重少精子癥;(2)排除有過(guò)IVF/ICSI治療史。(3)排除卵巢反應(yīng)異常和子宮異常;(4)排除夫妻雙方某一方染色體異常。

根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn),本研究共納入2 649個(gè)周期。根據(jù)最終的受精方式,分為短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組(R-ICSI組,105個(gè)周期)、常規(guī)IVF組(IVF組,2 058個(gè)周期)及常規(guī)ICSI組(ICSI組,486個(gè)周期)。其中,R-ICSI組新鮮移植周期有56個(gè),IVF組新鮮移植周期有1 059個(gè),ICSI組新鮮移植周期有259個(gè)。

二 研究方法

1.促排卵方案及取卵:所有患者采用卵泡期長(zhǎng)方案、黃體期長(zhǎng)方案、超長(zhǎng)方案和拮抗劑方案等常規(guī)促排卵方案,至少3個(gè)卵泡平均直徑達(dá)到≥18 mm時(shí),注射10 000 U注射用絨毛膜促性腺激素(HCG,珠海麗珠),36～40 h后經(jīng)陰道B超穿刺取卵,獲得的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受精培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.精液處理和受精:男方禁欲3～5 d后,手淫取精,根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)對(duì)精子濃度、活率、形態(tài)進(jìn)行評(píng)估,通過(guò)密度梯度離心聯(lián)合上游法處理精液,將精液密度調(diào)至1×106/ml。注射HCG約40 h后,根據(jù)男方精液情況選擇常規(guī)IVF和ICSI。

3.脫顆粒細(xì)胞與R-ICSI:IVF組在授精16～18 h后,脫顆粒細(xì)胞,觀察原核和第二極體,判斷受精情況。R-ICSI組在授精后4～6 h機(jī)械去除顆粒細(xì)胞,置于新的培養(yǎng)基中觀察是否出現(xiàn)第二極體。如果所有卵母細(xì)胞或超過(guò)30%的卵母細(xì)胞均未出現(xiàn)第二極體,將觀察時(shí)間延至授精后8～9 h,若仍未增加第二極體的數(shù)目則立即進(jìn)行R-ICSI。

4.胚胎培養(yǎng)及評(píng)分:授精后的16～20 h觀察到2PN和2PB為正常受精。卵裂期胚胎(D3)評(píng)分采用Peter評(píng)分法,囊胚(D5/D6)形態(tài)學(xué)評(píng)分采用Gardner評(píng)分法[8]。選擇1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者的基本資料

3組患者的女方年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)生殖激素(E2、FSH、LH)水平、Gn用量和天數(shù)、平均獲卵數(shù)及可移植周期率均無(wú)顯著差異(P>0.05);R-ICSI組和ICSI組患者原發(fā)不孕比例顯著高于IVF組(P<0.05),繼發(fā)不孕比例顯著低于IVF組(P<0.05),但R-ICSI組和ICSI組之間無(wú)顯著差異(P>0.05);R-ICSI組無(wú)患者使用卵泡期長(zhǎng)方案,IVF組和ICSI組使用卵泡期長(zhǎng)方案促排卵的周期比例無(wú)顯著差異(P>0.05);R-ICSI組使用黃體期長(zhǎng)方案促排卵的周期數(shù)比例顯著高于IVF組(P<0.05),但與ICSI組無(wú)顯著差異(P>0.05);3組使用超長(zhǎng)方案和拮抗劑方案促排卵的周期數(shù)比例均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者的基本資料[(-±s),n(%)]

二、3組患者的受精情況比較

R-ICSI組和ICSI組患者的總受精率和正常受精率均高于IVF組(P<0.05),但MⅡ率、多精受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率和可用囊胚率均顯著低于IVF組(P<0.05);R-ICSI組的總受精率和多精受精率顯著高于ICSI組(P<0.05),而囊胚形成率顯著低于ICSI組(P<0.05)(表2)。

表2 三組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較(%)

三、3組患者新鮮胚胎移植情況及妊娠結(jié)局比較

R-ICSI組新鮮移植56個(gè)周期,IVF組新鮮移植1 059個(gè)周期,ICSI組新鮮移植259個(gè)周期。ICSI組移植D3胚胎周期比例顯著高于IVF組(P<0.05),但與R-ICSI組無(wú)顯著差異(P>0.05);3組患者在平均移植胚胎數(shù)、移植D5胚胎周期比例、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、分娩率、多胎妊娠率、異位妊娠率、活產(chǎn)率、出生性別比、出生體重等方面均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 三組患者新鮮胚胎移植情況及妊娠結(jié)局比較[(-±s),%]

討 論

哺乳動(dòng)物的自然受精過(guò)程,包括精子與卵母細(xì)胞卵丘復(fù)合物之間的相互作用、頂體反應(yīng)、精子與卵母細(xì)胞的結(jié)合和穿入、皮層反應(yīng)、原核形成等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。在整個(gè)過(guò)程中,任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題,都有可能導(dǎo)致受精失敗。常規(guī)IVF的18 h配子共孵育最初就是根據(jù)這一受精過(guò)程來(lái)制定的。隨著ART發(fā)展的越來(lái)越成熟,臨床促排卵方案和胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控也在不斷完善,但是常規(guī)IVF-ET周期仍有10%～15%的受精失敗無(wú)法避免。ICSI可以避免自然受精過(guò)程出現(xiàn)的失敗因素,但由于ICSI對(duì)卵母細(xì)胞的損傷和避開(kāi)對(duì)精子自然篩選的過(guò)程,有可能將遺傳缺陷傳遞給下一代[9]。雖然短時(shí)受精后去除顆粒細(xì)胞結(jié)合R-ICSI可以避免完全受精失敗和過(guò)度ICSI治療,但對(duì)于所有的IVF周期實(shí)施短時(shí)受精工作量太大。既往研究表明,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI適用于夫妻雙方原發(fā)不孕、不明原因、不孕年限長(zhǎng)的患者,可有效避免完全受精失敗或受精低下[10]。本研究中患者的一般情況分析結(jié)果顯示,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI患者原發(fā)不孕患者比率顯著高于常規(guī)IVF,這與既往研究一致,說(shuō)明原發(fā)不孕是受精失敗的高危因素。在臨床中可以選取符合適應(yīng)證的人群進(jìn)行早受精觀察,既能對(duì)可能受精失敗的卵母細(xì)胞進(jìn)行早期干預(yù),又能提高工作效率。

個(gè)體化促排卵方案是輔助生殖助孕的關(guān)鍵環(huán)節(jié),利用藥物誘發(fā)多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育和成熟,提高獲卵率,是后續(xù)挑選可移植優(yōu)質(zhì)胚胎的重要保障。目前最常用的促排卵方案是使用促性腺激素釋放激素(GnRH)激動(dòng)劑促排卵的卵泡期長(zhǎng)方案、黃體期長(zhǎng)方案、超長(zhǎng)方案或GnRH拮抗劑方案。與GnRH激動(dòng)劑方案相比,GnRH拮抗劑的優(yōu)勢(shì)在于可以立即和直接阻斷GnRH受體,抑制促性腺激素分泌,不存在誘發(fā)睪酮激增的風(fēng)險(xiǎn)。多中心的前瞻性研究表明,GnRH拮抗劑的治療時(shí)間更短,所需的外源性促性腺激素的用量以及卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生率也有所降低。雖然使用拮抗劑方案的患者獲得卵母細(xì)胞和胚胎數(shù)量較少,但其與激動(dòng)劑方案的成熟卵母細(xì)胞率、受精率及妊娠率是相似的[11-12]。然而,也有薈萃分析證明,拮抗劑方案的植入率和妊娠率較低[13]。一項(xiàng)前瞻性研究比較了ICSI周期中分別使用GnRH激動(dòng)劑和拮抗劑的卵巢刺激方案對(duì)卵巢反應(yīng)、優(yōu)質(zhì)胚胎和臨床妊娠的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子的影響,通過(guò)多變量分析顯示,GnRH拮抗劑方案與較低水平的GnRH、較低水平的rFSH、較高獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著相關(guān),而GnRH激動(dòng)劑方案與較高的受精率和較高的妊娠率相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組和常規(guī)ICSI組中使用黃體期長(zhǎng)方案促排卵的周期比例均高于常規(guī)IVF組,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組和常規(guī)ICSI組的總受精率和正常受精率也顯著高于常規(guī)IVF組(P<0.05)。3組使用拮抗劑方案的周期比例雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但與常規(guī)IVF組患者相比,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組和常規(guī)ICSI組使用拮抗劑方案促排卵周期比例均下降,且優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著下降(P<0.05),與上述研究結(jié)果一致。然而,3組之間的臨床妊娠率并無(wú)顯著差異(P>0.05),表明促排卵方案的差異可能是影響本研究實(shí)驗(yàn)室結(jié)局的因素之一。

在短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組中,顆粒細(xì)胞在授精后4～6 h被剝除,觀察是否有第二極體排出。在這個(gè)精卵結(jié)合的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),卵丘細(xì)胞仍緊密包裹卵細(xì)胞或受精卵,剝除卵丘細(xì)胞的反復(fù)機(jī)械抽吸行為可能會(huì)對(duì)紡錘絲造成損害,影響胚胎發(fā)育潛能。因此,顆粒細(xì)胞的去除時(shí)機(jī)尤為重要。研究證實(shí),在授精后4 h內(nèi)去除顆粒細(xì)胞多精受精率和第3天優(yōu)胚率最高,5.5 h至6 h去除顆粒細(xì)胞原核形成失敗率最高[15]。本研究中,雖然短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組的卵母細(xì)胞成熟率顯著低于常規(guī)IVF組,但總受精率和正常受精率均顯著高于常規(guī)IVF組,表明短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI挽救了大部分受精失敗的MⅡ卵母細(xì)胞。短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI多精受精率為6.72%,顯著低于常規(guī)IVF組但高于常規(guī)ICSI組,可能是由于在精卵結(jié)合的早期對(duì)卵母細(xì)胞重復(fù)的機(jī)械抽吸也會(huì)對(duì)透明帶的完整性產(chǎn)生不利影響,降低透明帶阻止多精受精的保護(hù)機(jī)制。研究報(bào)道,約90%的卵母細(xì)胞在授精后6 h內(nèi)釋放出第二極體,而少部分受精卵超過(guò)6 h才排出第二極體[16]。故本研究中有少部分卵母細(xì)胞也可能是碎裂極體誤判為第一極體而行R-ICSI導(dǎo)致的多精受精。從胚胎發(fā)育的結(jié)局看,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組的優(yōu)胚率、囊胚形成率和可用囊胚率均顯著低于常規(guī)IVF組(P<0.05),雖然R-ICSI的胚胎發(fā)育結(jié)局不如常規(guī)IVF,但兩組患者的可移植周期率和臨床妊娠結(jié)局并無(wú)顯著差異(P>0.05)。從技術(shù)的有效性看,提示短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI是挽救IVF受精失敗和受精低下周期的有效措施。

在常規(guī)IVF中,配子孵育18～20 h后去除卵丘細(xì)胞以觀察受精狀態(tài)。卵丘細(xì)胞是卵母細(xì)胞的支持細(xì)胞,保護(hù)卵母細(xì)胞免受微環(huán)境的影響。卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的雙向通信在卵母細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟、受精和早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[17]。關(guān)于早期去除卵丘細(xì)胞的安全性一直存在爭(zhēng)議。最近一項(xiàng)研究報(bào)道了關(guān)于早期去除顆粒細(xì)胞聯(lián)合R-ICSI預(yù)防受精失敗的安全性,結(jié)果顯示,常規(guī)ICSI組與早期R-ICSI組的受精、臨床妊娠、流產(chǎn)、異位妊娠、活產(chǎn)、性別、平均胎齡、極低出生體重、巨大兒和出生缺陷等指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05),但R-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率較低(P<0.01),說(shuō)明了早期去除顆粒細(xì)胞聯(lián)合R-ICSI可獲得良好妊娠結(jié)局,且未增加出生缺陷[18]。另一項(xiàng)研究比較不同時(shí)間去除卵丘細(xì)胞對(duì)胚胎發(fā)育潛力和IVF結(jié)局的影響,結(jié)果顯示,在授精后4 h去除卵丘細(xì)胞可利用胚胎率顯著降低(P=0.002),提示在早期去除卵丘細(xì)胞觀察第二極體,有可能會(huì)影響胚胎發(fā)育潛能[19]。也有研究報(bào)道,R-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于ICSI組,猜測(cè)可能是由于R-ICSI時(shí)間較常規(guī)ICSI延遲幾個(gè)小時(shí),成熟的卵母細(xì)胞更多,卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟更同步,且尚未老化,故胚胎發(fā)育潛能更好[7]。在本研究中,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI組與常規(guī)ICSI組的正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)胚率、可用囊胚率、胚胎著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎率、活產(chǎn)率、出生性別比、出生體重等方面均無(wú)顯著差異(P>0.05),與大多數(shù)研究結(jié)果相似[20]。一項(xiàng)研究比較不同時(shí)期去除早期卵丘細(xì)胞對(duì)妊娠和新生兒結(jié)局的影響,結(jié)果表明,早期去除卵丘細(xì)胞與不良妊娠和新生兒結(jié)局無(wú)關(guān)[21]。也有研究報(bào)道,在接受早期R-ICSI的患者中,早產(chǎn)、雙胞胎和低出生體重新生兒的發(fā)生率更高[22]。他們猜測(cè)可能是由于早期去除卵丘細(xì)胞的過(guò)程中損害了紡錘體的完整性,從而導(dǎo)致雙胞胎或胎兒生長(zhǎng)不良。此外,卵丘細(xì)胞去除過(guò)程中不適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力會(huì)導(dǎo)致與低出生體重相關(guān)的表觀遺傳學(xué)變化[23-24]。目前,關(guān)于早期去除顆粒細(xì)胞行R-ICSI對(duì)子代安全性影響的數(shù)據(jù)不多,未來(lái)仍需要更多隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)和大規(guī)模研究進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證,以評(píng)估其長(zhǎng)期效果和安全性。

綜上所述,短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI獲得良好的實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)局,有效避免患者無(wú)胚胎移植,為不孕不育患者帶來(lái)新的希望。因此,建議在患者從充分知情技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和局限性的前提下,對(duì)可能受精失敗或受精低下的患者實(shí)施短時(shí)受精結(jié)合早期R-ICSI進(jìn)行挽救。