消炎退熱顆粒清熱抗炎作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析及其主要成分的含量測定

王冠楠，王宏進，苑楠楠，針濤，王佳雪，孫立新（. 沈陽藥科大學，遼寧本溪 7004；2. 遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧沈陽 068）

消炎退熱顆粒收錄于2020 年版《中國藥典》一部，是由大青葉、蒲公英、紫花地丁、甘草制成的復方制劑[1]，主要用于感冒發(fā)熱、上呼吸道感染、咽喉腫痛及各種瘡癤腫痛[2]。方中君藥大青葉有清熱解毒、涼血消斑的功效，是消炎退熱顆粒發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；臣藥蒲公英能夠解毒消腫、利尿通淋，可增強大青葉清熱解毒的功效；佐藥紫花地丁清熱解毒、涼血消腫，可以協(xié)調(diào)君臣二藥；使藥甘草具有清熱解毒、調(diào)和諸藥的作用。研究[3-7]發(fā)現(xiàn)，消炎退熱顆粒具有顯著的清熱解毒作用，但其作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于公共數(shù)據(jù)庫，以“網(wǎng)絡(luò)靶標”為核心，能夠?qū)Α俺煞?靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)進行多層次分析，廣泛應(yīng)用于中藥活性化合物的作用機制研究[8-12]；分子對接技術(shù)是通過計算機模擬化合物與靶蛋白的相互作用，預測兩者間的親和力和結(jié)合方式，常被應(yīng)用于設(shè)計和篩選活性化合物，是藥物開發(fā)過程中重要的手段[13-14]。

目前網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)的中藥藥效物質(zhì)研究大多數(shù)是基于口服生物利用度和藥物相似性等預測性參數(shù)進行篩選，而藥物發(fā)揮藥效的前提是進入血液循環(huán)。因此，以口服后吸收入血成分作為藥效物質(zhì)進行網(wǎng)絡(luò)藥理學研究更加準確。本課題組前期試驗結(jié)果顯示，以UPLC-Q-Exactive MS 技術(shù)分析口服消炎退熱顆粒后的血清樣品，共鑒定出88 個入血成分，其中75 個原型成分，包括萜類化合物5 個、黃酮類化合物5 個、有機酸類化合物32 個、苯丙素類化合物14個和其他類型化合物19個；代謝產(chǎn)物13個，主要為甘草苷、甘草素、秦皮乙素及咖啡酸的代謝產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選消炎退熱顆粒的有效成分和核心靶點，并利用分子對接的方法進行驗證，同時建立UPLC-MS/MS（超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）方法分析其主要活性成分含量，以期為消炎退熱顆粒的藥理學研究及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器Acquity 超高效液相色譜儀、Micromass Quattro Micro API 質(zhì)譜儀和Masslynx V4.1色譜工作站（美國Waters公司）；JF1004萬分之一電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；BT25S 十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；XK96-A快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；BKQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；L530型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 藥品及試劑綠原酸（批號：B20782）、咖啡酸（批號：B20660）、異甘草素（批號：B21525）、甘草素（批號：B20416）、甘草苷（批號：B20414）、甘草酸（批號：B20417）、秦皮乙素（批號：B20991）、靛玉紅（批號：B20298），質(zhì)量分數(shù)均大于98%，上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸、甲酸銨（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）；純化水（杭州娃哈哈集團有限公司）。16 批消炎退熱顆粒，來自A、B 兩藥企。A 廠樣品批號：ZGA1801、ZBA2002、ZEA2001、ZEA2003、ZBA2001、ZCA1901、ZHA1901（編號：A1～A7），B 廠樣品批號：19012、190806、200310、200313、190807、200224、200304、190407、190904（編號：B1～B9）。

1.3 主要軟件及數(shù)據(jù)庫CTD 數(shù)據(jù)庫（https：//ctdbase.org/）；Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）；String 網(wǎng)站（https：//string-db.org/）；Cytoscape 3.9.1 軟件；SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch /）；微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）；RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）；David 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；Maestro 11.8軟件（美國Schrodinger公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接研究

2.1.1消炎退熱顆粒入血成分的靶點收集 通過UPLC-Q-Exactive MS 技術(shù)測定口服消炎退熱顆粒后的血清樣品，共鑒定出88個入血成分，見表1。通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫查詢所鑒定化合物的SMILES，上傳到SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，獲得化合物的相應(yīng)靶點。

表1 消炎退熱顆粒的入血化學成分Table 1 Ingredients absorked in the blood of Xiaoyan Tuire Granules

2.1.2藥物成分和疾病靶點的篩選 利用SwissTarget-Prediction 數(shù)據(jù)庫檢索到消炎退熱顆粒的成分靶點共813 個。采用“fever”和“inflammation”為關(guān)鍵詞，檢索CTD 數(shù)據(jù)庫，獲得發(fā)熱和炎癥疾病相關(guān)靶點47 410個。去除重復靶點，以inference score≥150.07為篩選條件，最終得到疾病靶點2 746 個。應(yīng)用Venny 2.1 取入血成分靶點和疾病相關(guān)靶點的交集，獲得405個共同靶點。見圖1。

圖1 消炎退熱顆粒的成分-疾病交集靶點Figure 1 Intersection targets of components of Xiaoyan Tuire Granules-disease

2.1.3成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述交集靶點導入Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)。見圖2。應(yīng)用軟件中“Network Analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)分析，以網(wǎng)絡(luò)中連接度值（Degree值）為指標篩選出消炎退熱顆粒入血成分中潛在的活性成分。該網(wǎng)絡(luò)包含483 個節(jié)點和1 563 條邊。以Degree 值大于2 倍中位數(shù)篩選出甘草素、甘草次酸、阿魏酸、秦皮乙素、異甘草素、東莨菪素、靛玉紅、咖啡酸、綠原酸、甘草酸、甘草苷、紫檀素、大馬酮、7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮、苯乙基內(nèi)酰脲、谷氨酰酪氨酸等16個重要成分。

圖2 消炎退熱顆粒的成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 The network of components of Xiaoyan Tuire Granules-disease targets

2.1.4蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點的篩選 將交集靶點導入String 11.5 數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins、Homo sapiens，設(shè)置相互作用閾值（medium confidence＞0.9）及隱藏游離節(jié)點后進行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。將結(jié)果導入Cytoscape 3.9.1 軟件，并通過CytoHubba 插件中的Degree 算法進行分析，獲得評分前10 位的靶點。見圖4。結(jié)果顯示，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素6（IL-6）等靶點為核心靶點。

圖3 消炎退熱顆粒的成分-疾病交集靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of intersection targets for components of Xiaoyan Tuire Granules-disease

圖4 消炎退熱顆粒的核心靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)（前10 位）Figure 4 PPI network of core targets of Xiaoyan Tuire Granules（top 10）

2.1.5GO功能與KEGG通路富集分析 將篩選的核心靶點導入David數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，進行基因本體生物學過程（gene-ontology biology process，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以P＜0.01為篩選條件，選取有代表性的GO富集和KEGG通路。其中，GO富集共篩選出83 個條目，生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）條目分別為76、3、4 條。導入微生信網(wǎng)站作圖，其中展示生物過程前10條目（見圖5）。細胞凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)途徑（MAPK cascade）等對BP 影響較大；大分子復合物（macromolecular complex）、膜筏（membrane raft）和細胞外間隙（extracellular space）等對CC 影響較大；細胞因子活性（cytokine activity）、相同蛋白結(jié)合（identical protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）和一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性（nitricoxide synthase regulator activity）對MF 影響較大。KEGG 通路富集分析篩選出72 個KEGG 富集條目，根據(jù)P值篩選出前16 條密切相關(guān)的通路。見表2。結(jié)果顯示，人巨細胞病毒感染信號通路（Human cytomegalovirus infection）、 TNF 信號通路（TNF signaling pathway）和MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）等為主要的富集通路。

表2 消炎退熱顆粒與炎癥和發(fā)熱密切相關(guān)的信號通路（前16 條）Table 2 Pathways closely associated with fever and inflammation for Xiaoyan Tuire Granules（top 16）

2.1.6構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò) 將消炎退熱顆粒的關(guān)鍵成分、核心靶點和信號通路導入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，用其插件“Network analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)分析。將關(guān)鍵成分、核心靶點和信號通路導入Cytoscape 軟件構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。網(wǎng)絡(luò)圖包含98 個節(jié)點和354條邊。以節(jié)點Degree值大小為指標，16個化合物Degree 值差異不大，均可能是消炎退熱顆粒的關(guān)鍵成分；72條作用通路Degree值范圍為3～8，其中AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway，Degree=8）、阿爾茨海默病信號通路（Alzheimer disease，Degree=8）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway， Degree=7）、 癌癥信號通路（Pathways in cancer，Degree=7）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection，Degree=7）、沙門氏菌感染（Salmonella infection，Degree=7）的連接度高于其他信號通路，可能為消炎退熱顆粒的關(guān)鍵信號通路。

圖6 消炎退熱顆粒的主要活性成分-核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 The ＂active components-core targets-signaling pathways＂ network diagram of Xiaoyan Tuire Granules

2.1.7分子對接 將篩選出的活性成分與核心靶點對應(yīng)的陽性藥進行分子對接，預測蛋白-分子相互作用的結(jié)合能。其中，化合物的mol2 文件來自PubChem數(shù)據(jù)庫，從PDB 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并導入Maestro 11.8 軟件。蛋白大分子先后通過Protein preparation wizard 模塊、Sample water orientations、OPLS3e 模塊進行優(yōu)化，并以原始配體小分子為中心，生成大小為25 ?×25 ?×25 ? 的對接盒子文件。在LigPre 模塊中進行化合物優(yōu)化，生成pH 值（7.0±2.0）下的離子化狀態(tài)，加氫、去鹽，合成互變異構(gòu)體，選擇“XP”超精密對接，并由Glide中“docking score”打分函數(shù)對對接結(jié)果進行評價。結(jié)果見圖7。16個成分與關(guān)鍵靶點結(jié)合能均小于0 kJ·mol-1，表明藥物分子與靶蛋白的相互作用穩(wěn)定。進一步可視化分析結(jié)果顯示，各化合物均能夠與對應(yīng)的靶點通過氫鍵形成穩(wěn)定結(jié)合。見圖8。咖啡酸、綠原酸和甘草苷可與AKT1 相互作用，作用于其殘基賴氨酸（LYS）179、天冬氨酸（ASP）292、丙氨酸（ALA）230 和精氨酸（ARG）4。秦皮乙素、靛玉紅、苯乙基內(nèi)酰脲和異甘草素可與TNF 相互作用，作用于其殘基亮氨酸（LEU）172、亮氨酸（LEU）168、天冬酰胺（ASN）119、天冬酰胺（ASN）171 和天冬氨酸（ASP）158。甘草素、大馬酮、7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮、東莨菪素和紫檀素可與EGFR相互結(jié)合，作用于其殘基賴氨酸（LYS）745、天冬氨酸（ASP）855、蘇氨酸（THR）854、異亮氨酸（ILE）759和半胱氨酸（CYS）775。甘草次酸、阿魏酸、甘草酸和谷氨酰酪氨酸可與CASP3相互作用，作用于其殘基賴氨酸（LYS）210、天冬酰胺（ASN）208、絲氨酸（SER）209、絲氨酸（SER）65、精氨酸（ARG）64和精氨酸（ARG）207。

圖7 消炎退熱顆粒主要活性成分與核心靶點分子對接的評分熱圖Figure 7 Scoring heat map of main active important components and key targets of Xiaoyan Tuire Granules

圖8 消炎退熱顆粒主要活性成分與核心靶點的模擬對接圖Figure 8 Simulated docking diagram of main active components and core targets of Xiaoyan Tuire Granules

2.2 消炎退熱顆粒的含量測定

2.2.1色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL·min-1；流動相：0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨（B），梯度洗脫（0～1.0 min，15% A；1.0～3.0 min，15%～40%A；3.0～11.0 min，40%A；11.0～11.1 min，40%～15%A）；進樣室溫度：4 ℃；進樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子化源（ESI 源）；檢測模式：正負離子掃描模式；檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑溫度為300 ℃；離子源電壓為3.5 kV。8種成分的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表3。

表3 8 種化合物的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters of 8 compounds

2.2.2溶液的配制 均在避光下操作。

2.2.2.1 供試品溶液制備 取消炎退熱顆粒，研細，取粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。精密加入甲醇2.0 mL，密塞，稱定質(zhì)量。超聲提取20 min（250 W，40 kHz），放冷。再稱定質(zhì)量，用甲醇補足損失的質(zhì)量。搖勻，取上清液用0.22 μm 濾膜濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.2.2 對照品溶液制備 取靛玉紅、異甘草素、甘草苷、甘草素、甘草酸、咖啡酸、綠原酸和秦皮乙素適量，除靛玉紅加三氯甲烷2.0 mL 溶解外，其余均加甲醇配制成單一成分的對照品儲備液；精密量取各對照品儲備液適量，加甲醇分別配制成上述成分的混合對照品儲備液Ⅰ和混合對照品儲備液Ⅱ，其濃度見表4。

表4 各對照品及混合對照品儲備液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）Table 4 The comantration of each reference substance and mixed standard solutions（μg·mL-1）

2.2.3專屬性 分別取空白溶劑（甲醇）、供試品溶液以及混合對照品溶液（為“2.2.2.2”項下混合對照品儲備液Ⅰ稀釋10 倍），按“2.2.1”項下進樣分析。見圖9。結(jié)果表明該方法專屬性良好，提取溶劑不干擾8種成分的含量測定。

圖9 消炎退熱顆粒中8 種化合物的質(zhì)譜圖Figure 9 UPLC-MS/MS chromatograms of 8 compounds in Xiaoyan Tuire Granules

2.2.4線性與范圍 分別精密量取“2.2.2.2”項下混合對照品儲備液Ⅰ1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度的混合對照品溶液。分別取上述溶液進樣分析，以對照品溶液的濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得各化合物的回歸方程。結(jié)果見表5。

表5 8 種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 5 The results of linear relationships test of 8 components

2.2.5檢測限和定量限 精密吸取單一對照品儲備液適量，按“2.2.1”項下進樣分析，不斷稀釋已知濃度的對照品溶液，以信噪比為3∶1 和10∶1 分別計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果見表5。

2.2.6精密度 精密吸取“2.2.2.2”項下混合對照品儲備液Ⅱ，按上述檢測條件進樣分析，連續(xù)進樣6 次，記錄各峰面積。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD 分別為4.8%、4.7%、4.6%、4.2%、4.2%、5.0%、5.0%、4.5%，表明該方法精密度良好。

2.2.7重復性稱取消炎退熱顆粒（批號：200304）共6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2.1”項下平行制備6份供試品溶液，依法分別測定。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD 分別為3.0%、4.4%、5.2%、5.5%、4.1%、2.4%、4.1%、4.7%，結(jié)果表明該方法重復性較好。

2.2.8穩(wěn)定性 取消炎退熱顆粒（批號：200304）供試品溶液，室溫放置，按上述檢測條件分別于0、4、6 和12 h 進樣分析。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD 分別為2.7%、2.8%、2.7%、2.8%、2.9%、1.8%、3.4%、2.4%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9準確度 取已知含量（批號：200304）的消炎退熱顆粒6份，每份約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入精密量取的混合對照品儲備液Ⅱ1.0 mL，按“2.2.2.1”項下方制備供試品溶液，平行制備6份，進樣分析。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸和綠原酸的平均加樣回收率分別為92.8%、90.5%、93.6%、93.7%、95.7%、97.8%、93.1%和92.9%，RSD 分別為2.8%、2.1%、4.3%、4.2%、4.8%、4.3%、2.2%和5.3%，表明該方法準確度良好。

2.2.10耐用性 取消炎退熱顆粒（批號：200304）供試品溶液，對“2.2.1”項下色譜條件中的流速（0.20、0.25、0.30 mL·min-1）、柱溫（38、40、42 ℃）、甲酸體積分數(shù)（0.09%、0.10%、0.11%）等參數(shù)進行調(diào)整后，測定樣品含量，以考察本方法的耐用性。結(jié)果顯示，不同條件下進樣測定，各成分峰面積的RSD均小于3.5%，表明該方法耐用性良好。

2.2.11樣品的含量測定 取16 批消炎退熱顆粒，按“2.2.2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下進樣分析，記錄峰面積，并計算出8種成分的含量，結(jié)果見表6。8 種成分中以秦皮乙素的含量為最高，平均含量為208.69 μg·g-1；甘草酸次之，為113.85 μg·g-1；咖啡酸和甘草苷的平均含量為16.25和7.34 μg·g-1；而靛玉紅、甘草素、異甘草素和綠原酸的含量相對較低，平均含量僅為1.67、1.66、2.20、3.32 μg·g-1。進一步對2個廠家樣品中8種成分平均含量進行方差分析。結(jié)果顯示，咖啡酸、甘草酸和秦皮乙素的含量無顯著性差異（P＞0.05），而靛玉紅、甘草素、異甘草素、甘草苷和綠原酸的含量有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。

表6 16 批消炎退熱顆粒中8 種化合物的含量測定結(jié)果（±s，μg·g-1；n=3）Table 6 Contents of 8 analytes in 16 batches of Xiaoyan Tuire Granules（±s，μg·g-1；n=3）

注：兩廠家8種成分含量比較，**P＜0.01，*P＜0.05

綠原酸3.47±0.38 5.58±0.86 3.74±0.28 3.69±0.47 4.00±0.30 3.64±0.56 4.90±0.09 2.27±0.10 2.43±0.13 3.80±0.33 2.61±0.30 1.99±0.05 2.46±0.12 2.83±0.49 3.20±0.32 2.55±0.16 4.15±0.73 2.68±0.51**編號A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 A1～A7 B1～B9靛玉紅1.04±0.04 1.24±0.07 1.28±0.08 1.39±0.06 1.13±0.04 1.75±0.18 1.19±0.02 2.03±0.14 0.94±0.06 2.76±0.06 1.69±0.15 1.20±0.12 1.64±0.06 3.41±0.18 2.62±0.61 1.47±0.09 1.29±0.21 1.97±0.76*異甘草素3.85±0.27 1.83±0.19 5.61±0.19 2.22±0.06 4.14±0.23 1.89±0.09 4.33±0.13 1.24±0.17 1.23±0.10 1.51±0.01 1.34±0.25 1.24±0.10 0.99±0.10 1.29±0.06 1.31±0.21 1.20±0.04 3.41±1.34 1.26±0.13**甘草苷2.31±0.08 1.18±0.03 5.84±0.29 1.51±0.05 3.65±0.45 1.44±0.07 2.60±0.15 0.87±0.07 0.89±0.04 0.97±0.02 0.86±0.08 0.81±0.05 0.80±0.02 0.84±0.06 0.90±0.03 1.01±0.04 2.65±1.52 0.88±0.07**甘草酸104.99±13.19 112.74±0.86 138.32±4.16 113.50±4.86 134.47±10.61 96.79±2.31 141.11±3.90 100.30±12.13 101.90±2.64 139.20±4.79 119.23±15.03 85.48±22.61 96.87±0.18 101.89±19.73 129.03±3.21 105.83±2.72 120.27±16.25 108.86±16.00甘草素6.79±0.55 10.09±0.61 10.01±0.35 9.10±0.05 9.49±0.84 9.77±0.23 9.35±0.83 5.80±0.78 5.64±0.43 6.81±0.53 6.48±0.97 4.30±0.24 5.45±0.11 5.10±0.44 6.57±1.09 6.70±0.60 9.23±1.05 5.87±0.80**秦皮乙素152.35±7.34 187.17±16.08 219.28±4.52 168.85±0.65 271.80±20.26 181.58±6.61 194.01±9.21 209.68±3.43 197.93±3.90 262.31±5.89 205.47±14.27 207.37±10.75 232.93±4.56 255.99±9.11 217.56±11.09 174.81±2.22 196.43±36.29 218.23±26.32咖啡酸15.55±0.83 17.14±1.67 12.92±0.59 8.60±0.12 12.02±1.43 15.21±1.70 22.44±1.90 16.67±1.85 11.31±0.55 26.94±1.15 17.79±3.21 11.69±0.24 14.02±0.92 21.00±2.84 20.21±1.55 16.61±0.49 14.84±4.04 17.36±4.65

3 討論

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接研究本研究從消炎退熱顆粒中篩選出16個潛在的有效成分，并獲得10個相應(yīng)的核心靶點。其中咖啡酸能夠清除由中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的氧自由基，降低促炎癥因子的表達[15]；甘草酸可通過抑制IL-18 的生成，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）的含量，從而發(fā)揮抗炎活性[16]；甘草素能夠抑制蛋白激酶（AKT），降低炎癥反應(yīng)，起到細胞保護作用[17]；異甘草素可降低巨噬細胞中前列腺素PGE2 和NO 的生成，以發(fā)揮抗炎作用；甘草苷可抑制髓過氧化物酶（MPO）活性，抑制細胞間黏附因子1（ICAM-1）的表達，降低組織炎性損傷[18]；靛玉紅能夠顯著降低脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7 炎癥細胞模型IL-6、TNF-α 的濃度，具有顯著的體外抗炎作用[19]；秦皮乙素能夠降低NO 的分泌，調(diào)節(jié)血管收縮，減輕組織器官的炎性損傷[20]；綠原酸能夠螯合金屬離子和清除自由基，調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK/c-Jun 氨基末端激酶信號通路來降低組織的炎癥反應(yīng)[21]。

靶點篩選結(jié)果顯示，AKT1、TNF、IL6、JUN、IL1β、CASP3、EGFR、VEGFA、CTNNB1、GAPDH與核心成分的連接度值較高，推測可能是消炎退熱顆粒發(fā)揮作用的核心靶點。其中AKT1在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖及糖代謝的過程中起著重要作用。同時，能調(diào)節(jié)AKT1的表達以影響下游靶點，從而改善炎癥反應(yīng)[22]；TNF、IL-1β、IL-6 為典型的促炎細胞因子，能夠?qū)ρ装Y和免疫調(diào)節(jié)起促進作用，增強炎癥反應(yīng)程度[23]。TNF不僅直接促進炎癥基因表達，還能間接地促使細胞死亡、誘導炎癥免疫反應(yīng)；IL-1β可誘導多種促炎介質(zhì)，如細胞因子和趨化因子，加重炎癥反應(yīng)；IL-6 可促進炎癥部位單核細胞和巨噬細胞的募集，誘導炎癥介質(zhì)過度表達，促進效應(yīng)細胞產(chǎn)生炎癥因子，進一步加劇炎癥反應(yīng)；JUN蛋白家族是炎癥中最重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，可通過促進巨噬細胞中促炎基因的轉(zhuǎn)錄從而增加促炎細胞因子的表達[24]；EGFR、CASP3、VEGFA、CTNNB1 和GAPDH基因均參與細胞增殖、凋亡、分化、黏附和遷移等生理過程，在炎癥進程中發(fā)揮重要的作用[25-27]。

本研究進一步對消炎退熱顆粒的關(guān)鍵靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點主要富集于炎癥信號通路，如人巨細胞病毒（HCMV）通路、MAPK 信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、Toll 樣受體（TLR）信號通路和TNF 信號通路等。其中MAPK 信號通路是最常見的炎癥信號通路，MAPKs 是絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，是細胞膜表面受體與基因表達的重要信號調(diào)節(jié)酶[28]；HCMV感染可促進患兒TLR4/p38 MAPK 信號通路激活，加重肝細胞炎癥反應(yīng)和損傷，抑制該靶點能產(chǎn)生良好抗炎效果[29]；HIF-1α/BNIP3/Beclin-1 通路是線粒體自噬的激活通路，存在于線粒體外膜、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜，是線粒體自噬的重要調(diào)控蛋白，激活HIF-1通路能有效降低炎癥水平[30]； TLR介導的先天性免疫系統(tǒng)失調(diào)是炎癥機制的核心參與者，TLR信號轉(zhuǎn)導通路的激活會誘導機體防御的相關(guān)基因，包括炎癥細胞因子、趨化因子和抗原提呈分子，調(diào)節(jié)TLR能夠平衡機體免疫功能，改善炎癥水平[31]。

通過分子對接研究進一步驗證發(fā)現(xiàn)16 個成分與關(guān)鍵靶點均有良好的親和力，可能為潛在的活性成分?？梢暬治鼋Y(jié)果顯示，各化合物均能夠與對應(yīng)的靶點通過氫鍵形成穩(wěn)定結(jié)合，預測消炎退熱顆?？赡芡ㄟ^多成分、多靶點發(fā)揮藥效作用。

3.2 含量測定研究本研究建立了UPLC-MS/MS法測定上述網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選出的消炎退熱顆粒清熱抗炎的潛在活性成分。由于甘草次酸、阿魏酸、東莨菪素、紫檀素、大馬酮、7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮、苯乙基內(nèi)酰脲、谷氨酰-酪氨酸等成分在樣品中含量較低未能檢出，因此僅對靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸8 種成分進行含量測定。

本研究應(yīng)用超聲提取法，考察了提取溶劑[甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙酸乙酯-甲醇（1∶1）、乙酸乙酯]、料液比（1∶1、1∶2、1∶5、1∶10 和1∶15）、超聲時間（15、20 、30 min），確定最佳提取條件為料液比1∶10，用甲醇超聲提取20 min。在色譜條件優(yōu)化過程中，分別考察了乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸銨作為流動相，其中甲醇-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸銨作為流動相時，色譜柱壓力較大，不適合批量進樣；乙腈-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸作為流動相時，靛玉紅的峰形拖尾嚴重；以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨作為流動相時，各成分峰形較好。含量測定結(jié)果顯示，靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸和綠原酸在各個批次的消炎退熱顆粒中均能檢出并定量。其中2個廠家的消炎退熱顆粒中秦皮乙素的平均含量分別達到218.23 和196.43 μg·g-1，含量遠遠高于2020 年版《中國藥典》中秦皮乙素的規(guī)定（每袋不得少于0.3 mg）。同時方差分析結(jié)果顯示，兩個廠家的樣品中靛玉紅、甘草素、異甘草素、甘草苷和綠原酸的含量有顯著性差異。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法及分子對接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)消炎退熱顆粒入血成分中潛在的16 種活性成分及其可能干預的關(guān)鍵靶點和信號通路，建立了UPLC-MS/MS 法測定其中的8 種活性成分的含量，并應(yīng)用該分析方法對市售16 個批次的消炎退熱顆粒進行測定。該方法準確、簡便，能夠?qū)崿F(xiàn)對消炎退熱顆粒中多成分的定量分析，可為其進一步的機理研究及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。