• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于鐵死亡探討溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)機(jī)制

    2023-12-20 08:59:50向軍軍李麗琴李建錚莫雪妮陳煒胡躍強(qiáng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院廣西南寧53003廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西南寧530000
    中藥新藥與臨床藥理 2023年12期
    關(guān)鍵詞:復(fù)元方組誘導(dǎo)劑

    向軍軍,李麗琴,李建錚,莫雪妮,陳煒,胡躍強(qiáng)(.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西南寧 53003;. 廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西南寧 530000)

    缺血性腦卒中(Ischemic stroke,IS)是臨床中常見的腦卒中類型,是世界范圍內(nèi)致殘率和死亡率最高的疾病之一[1]。目前缺血性腦卒中的治療方法主要包括藥物溶栓或介入手術(shù),可快速使血管恢復(fù)灌注[2]。然而缺血區(qū)域因恢復(fù)灌注所造成的腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)可通過炎性反應(yīng)、鈣離子超載、自由基過度形成、興奮性氨基酸的毒性作用等誘發(fā)或加重對神經(jīng)元的損傷[3]。近年來發(fā)現(xiàn)鐵代謝介導(dǎo)的鐵穩(wěn)態(tài)失衡參與腦缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)過程,并發(fā)現(xiàn)改善鐵代謝,維持細(xì)胞內(nèi)外鐵穩(wěn)態(tài)有望成為改善腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵干預(yù)途徑[4]。

    鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory proteins,IRP)/鐵反應(yīng)原件(iron responsive elements,IRE)是目前維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)機(jī)制,IRE 是存在于目標(biāo)mRNA中的一個高度保守的核苷酸序列,與IRP結(jié)合形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),其在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;IRP包括IRP1 和IRP2 兩型,其中IRP1 是一種雙功能酶,已證實(shí)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體1(Transferrin receptor protein 1,TFR1)與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Recombinant Ferroportin ,F(xiàn)PN)是IRE 的主要目標(biāo)基因[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵過載時,IRP1 終止與IRE 目標(biāo)基因(TFR1 及FPN)結(jié)合,增加細(xì)胞內(nèi)鐵的輸出而減少鐵攝取,維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。

    溫陽復(fù)元方是本課題組經(jīng)多年臨床實(shí)踐凝練而成的治療缺血性腦卒中的有效方劑,經(jīng)多中心臨床研究[7-8]發(fā)現(xiàn)該方可有效地促進(jìn)患者神經(jīng)肢體功能康復(fù)。動物實(shí)驗研究[9]發(fā)現(xiàn)該方改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損的機(jī)制可能與上調(diào)人類貓白血病C亞類病毒受體(Feline leukemia virus subgroup C receptor,F(xiàn)LVCR)和胸腺癌抵抗蛋白(Breast Cancer Resistance Protein,BCRP)的表達(dá)有關(guān);而BCRP 與FLVCR 作為血紅素鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與鐵代謝關(guān)系密切[10],因此,我們推測該方對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與通過IRP1 調(diào)節(jié)腦鐵代謝,進(jìn)而抑制鐵死亡有關(guān)。

    本研究擬從溫陽復(fù)元方改善腦鐵代謝角度,探索缺血性腦卒中的潛在治療靶點(diǎn),以期為該方的臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動物健康雄性SPF級SD大鼠72只,3月齡,體質(zhì)量(250±50)g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司提供,動物質(zhì)量合格證號: 430727221102400862,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0004。動物飼養(yǎng)在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗中心,各組大鼠自由飲食、飲水,室溫、60%濕度的受控環(huán)境中,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),倫理審批號: DW20211204-196,實(shí)驗流程及動物處理遵循動物實(shí)驗管理條例。

    1.2 藥物及試劑溫陽復(fù)元方由經(jīng)典方四逆湯化裁而來,方藥組成:白附片30 g(先煎1 h)、黃芪30 g、黨參30 g、石菖蒲20 g、淫羊藿15 g、田三七15 g、干姜10 g、炙甘草6 g。所有藥材均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購,由廣西仙茱中藥科技有限公司制備(批號:20190701),經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳超副主任藥師鑒定為正品,符合2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)范。加入藥材總質(zhì)量7倍的蒸餾水浸泡藥材30 min,待藥材完全吸水后,白附片先煎1 h(大火煮開,文火煎1 h),后加入其他藥物武火煮開后,文火煮1 h,用無菌紗布濾過、收集藥液;繼續(xù)加約7 倍的水繼續(xù)煎煮40 min,濾過,將2次藥液混合,大火濃縮至含原生藥濃度1.0 g·mL-1的溶液,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩9辔竸┝坑嬎惴椒▍⒄账幚韺?shí)驗方法[11],按人與大鼠體表面積換算系數(shù),成人(70 kg)每日服用156 g 原生藥,則大鼠溫陽復(fù)元方的用藥劑量為18.0 g·kg-1。

    MCAO 線栓,河南平頂山豫順生物科技有限公司,批號:2543;TRIzol ReagentRNA 試劑盒,美國Ambion 公司,批號:284909;Erastin 鐵死亡誘導(dǎo)劑,美國MedChemExpress 公司,批號:118342;Ferrostatin-1 鐵死亡抑制劑,美國Selleckchem 公司,批號:S7243;戊巴比妥鈉,美國Serve 公司,批號:201505;Western 一抗稀釋液、Western 二抗稀釋液、ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(特超敏),均購自中國Biosharp 公司,批號依次為:BL506A、BL536A、BL520A;2×S6Universal SYBR高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液、IRP1 抗體、TfR1 抗體、FPN 抗體、還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒、鐵含量檢測試劑盒、anti-GAPDH Rabbit polyclone、二甲基亞砜(DMSO),均購自中國Solarbio 公司,批號依次為:F3525、K111307P、DF1356、AF5343、BC1175、B26465、BL006B、DB371。

    1.3 儀器DP73 顯微鏡,日本Olympus 公司;LightCycler 96 Instrument PCR 儀,瑞士Roche 公司;ChemiScope 6000 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司;MDF-382E型超低溫保存箱,日本三洋公司;BV-2 型電泳儀、BT-2 型轉(zhuǎn)膜儀,武漢賽維爾生物科技有限公司;H-600型透射電鏡,日本日立公司;M200PRO型多功能酶標(biāo)儀,瑞士TECAN公司。

    1.4 分組、模型復(fù)制及給藥72 只SD 雄性大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溫陽復(fù)元方組、鐵死亡誘導(dǎo)劑組、溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組、鐵死亡抑制劑組,每組12只。

    術(shù)前禁食不禁水12 h,采用線栓法制備大腦中動脈閉塞/再灌注(MCAO/R)大鼠模型[12]:以40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,沿頸前正中線切口,逐層分離且充分暴露頸動脈,小心分離迷走神經(jīng)與頸總動脈以及頸外、頸內(nèi)動脈,并結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈,線栓經(jīng)頸內(nèi)動脈插入至大腦中動脈(深度約17~18 mm),形成大鼠右側(cè)腦缺血。所有手術(shù)均為右側(cè)大腦中動脈栓塞。假手術(shù)組手術(shù)步驟同模型組,但線栓只插入頸內(nèi)動脈深度9 mm,不堵塞大腦中動脈。參照Longa 等[13]的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,評分1~3 分表明造模成功,不符合者進(jìn)行剔除。

    鐵死亡誘導(dǎo)劑和鐵死亡抑制劑用10%二甲基亞砜(DMSO)按要求配置,于造模前24 h開始按分組分別以100、5 mg·kg-1腹腔注射;溫陽復(fù)元方組于清醒后2 h 開始灌胃18.0 g·kg-1;模型組、假手術(shù)組灌胃等體積蒸餾水,自由飲食飲水。各干預(yù)措施均為每天1次,連續(xù)7 d。

    1.5 標(biāo)本采集與處理造模后第7天,神經(jīng)功能缺損評分后,隨機(jī)取6 只大鼠采用戊巴比妥(30 mg·kg-1)腹腔麻醉后解剖開大鼠胸腔暴露心臟,剪開右心耳,將注射器針頭經(jīng)心尖插入至主動脈端并固定好,用100 mL 生理鹽水通過注射器快速注入,待心臟無血色液體流出,前爪、肺部顏色變成白色后,開顱取腦,切取右側(cè)缺血周邊組織進(jìn)行取材;隨機(jī)取其中3 只的組織置于4%多聚甲醛中固定,用于HE染色等其他指標(biāo)檢測;將另外3只缺血區(qū)域皮質(zhì)部位組織切成1 mm3的組織塊,投入預(yù)冷的電鏡固定液中,于4 ℃冰箱保存。剩余6只麻醉后,冰上操作快速取右側(cè)缺血區(qū)域組織并迅速投入液氮中冷凍,然后存放于-80 ℃冰箱保存,用于RT-qPCR 及Western Blot等分子檢測。

    1.6 大鼠神經(jīng)功能缺失的Longa 評分法大鼠神經(jīng)功能缺損評分參照Longa 等[13]的評分標(biāo)準(zhǔn):0 分為無神經(jīng)功能缺失癥狀,活動正常者;1分為提尾時左側(cè)前肢不能完全伸展;2 分為行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象);3分為行走時向左側(cè)傾斜;4分為不能自主行走,意識喪失。

    1.7 腦組織蘇木素-伊紅染色取腦組織樣本,經(jīng)常規(guī)脫水透明、浸蠟、石蠟包埋后,進(jìn)行組織蠟塊切片,切片厚度約3~5 μm。脫蠟脫水處理后,進(jìn)行蘇木素及伊紅染色,封片,光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)元分布、形態(tài)學(xué)等病理改變并拍照保存。

    1.8 生化法檢測腦組織Fe2+和GSH 含量取腦組織樣本,各組分別稱取0.1 g 腦組織,加入0.9 mL 的勻漿介質(zhì),冰水浴中剪碎、研磨,制成10%的勻漿液;以2 500 r·min-1離心15 min(離心半徑8 cm),吸取上清液。按照GSH 試劑盒及鐵含量檢測試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)操作,計算組織中Fe2+和GSH的含量。

    1.9 RT-qPCR 法檢測缺血區(qū)域腦組織中TFR1、IRP1、FPN mRNA 的表達(dá)水平提取腦組織總mRNA 后,添加TRIzol 試劑以保持樣品中RNA 的完整性,測定總mRNA 的純度和濃度,反轉(zhuǎn)錄制備互補(bǔ)DNA。將樣品加入96 孔板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。記錄在每個反應(yīng)管中達(dá)到設(shè)定閾值時熒光信號經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct 值)。通過2-ΔΔCt方法確定基因表達(dá)的差異,基因引物序列見表1,引物由北京擎科生物技術(shù)公司合成。

    表1 qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of qPCR

    1.10 Western Blot 法檢測缺血區(qū)域腦組織中TFR1、IRP1 和FPN 蛋白的表達(dá)水平取腦組織樣本,經(jīng)常規(guī)蛋白提取、配膠與電泳、轉(zhuǎn)膜,再加入一抗4 ℃下孵育過夜,TBST 洗滌3 次,每次5 min;然后加入二抗在室溫下孵育1 h 后,將PVDF 膜用TBST在脫色振蕩器上于室溫下洗滌3次,每次5 min;取出后加入顯影液,將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀掃描并保存結(jié)果圖像。經(jīng)ImageJ 軟件分析目的蛋白條帶灰度值,以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白,計算出目的蛋白的相對表達(dá)量。

    1.11 透射電鏡觀察缺血區(qū)域腦組織中線粒體超微結(jié)構(gòu)變化將樣品用戊二醛中固定,經(jīng)過磷酸漂洗液漂洗,鋨酸固定,乙醇梯度脫水,包埋;然后經(jīng)恒溫烘箱內(nèi)聚合,半薄定位及超薄切片機(jī)切片,醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色;最后,在透射電鏡下觀察并攝片。

    1.12 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,參數(shù)數(shù)值以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用One-Way ANOVA檢驗比較各組間的差異,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有制圖均應(yīng)用Graphpad 9.0軟件制作。

    2 結(jié)果

    2.1 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠神經(jīng)功能缺損的影響如表2 所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠在術(shù)后1、3、7 d時神經(jīng)功能缺損評分明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,溫陽復(fù)元方組及鐵死亡抑制劑組大鼠在術(shù)后1、3、7 d時神經(jīng)功能缺損評分降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較,在各個觀察時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與溫陽復(fù)元方組比較,鐵死亡誘導(dǎo)劑組及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠在各時間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評分明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而與模型組比,則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表2 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠再灌注不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的影響(±s,分;n=12)Table 2 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on neurological function deficit scores at different time points of rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(±s,scores;n=12)

    表2 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠再灌注不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的影響(±s,分;n=12)Table 2 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on neurological function deficit scores at different time points of rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(±s,scores;n=12)

    注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05;與溫陽復(fù)元方組比較,#P<0.05

    術(shù)后7 d 0.00±0.00 1.87±0.50**0.62±0.54△1.82±0.83#1.69±0.71#0.56±0.52△組別假手術(shù)組模型組溫陽復(fù)元方組鐵死亡誘導(dǎo)劑組溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組鐵死亡抑制劑組術(shù)后1 d 0.00±0.00 2.08±0.62**1.02±0.54△2.16±0.75#2.09±0.78#1.00±0.50△術(shù)后3 d 0.00±0.00 2.00±0.18**1.00±0.50△2.09±0.78#1.78±0.67#0.89±0.33△

    2.2 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響如圖1所示,假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列緊密整齊,細(xì)胞形態(tài)完整規(guī)則、胞核淡染大而圓;而模型組、鐵死亡誘導(dǎo)劑組以及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞數(shù)目減少且水腫,細(xì)胞核淡染固縮,邊緣出現(xiàn)空泡,各組病理損傷程度相似。溫陽復(fù)元方組和鐵死亡抑制劑組神經(jīng)元細(xì)胞排列有序,細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則完整,核染色清晰,病理損傷明顯減輕。

    圖1 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠缺血區(qū)域腦組織病理形態(tài)的影響(HE 染色,×400)Figure 1 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the pathological morphology ischemic brain tissue in rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(HE,×400)

    2.3 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠腦組織中Fe2+及GSH含量變化的影響如表3所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織Fe2+含量明顯升高、GSH 含量降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,溫陽復(fù)元方組與鐵死亡抑制劑組大鼠腦組織Fe2+含量下降、GSH含量上升,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較,F(xiàn)e2+及GSH含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與溫陽復(fù)元方組比較,鐵死亡誘導(dǎo)劑組及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠腦組織Fe2+含量明顯升高、GSH 含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);而與模型組比,則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表3 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠腦組織中Fe2+及GSH 含量變化的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the contents of Fe2 +and GSH of brain tissue in rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(±s,n=6)

    表3 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠腦組織中Fe2+及GSH 含量變化的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the contents of Fe2 +and GSH of brain tissue in rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(±s,n=6)

    注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05;與溫陽復(fù)元方組比較,#P<0.05,##P<0.01

    GSH/(μg·g-1)104.50±11.66 52.83±13.17**92.00±15.20△52.83±7.15#57.54±10.79#83.83±13.21△組別假手術(shù)組模型組溫陽復(fù)元方組鐵死亡誘導(dǎo)劑組溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組鐵死亡抑制劑組Fe2+/(μg·g-1)10.33±1.70 18.23±3.02**11.82±2.57△17.79±3.58##17.25±2.70#11.15±2.15△

    2.4 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠TFR1、IRP1 和FPN mRNA 表達(dá)的影響如表4 所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠IRP1、FPN mRNA 表達(dá)水平降低,TFR1 mRNA 表達(dá)水平升高(P<0.01)。與模型組比較,溫陽復(fù)元方組及鐵死亡抑制劑組大鼠IRP1、FPN mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),而TFR1 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05);且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較,各基因表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與溫陽復(fù)元方組比較,鐵死亡誘導(dǎo)劑組和溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠IRP1、FPN mRNA 表達(dá)水平降低、TFR1 mRNA 表達(dá)水平上升(P<0.05);而與模型組比,則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表4 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠腦組織TFR1、IRP1 和FPN mRNA 表達(dá)的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the mRNA expressions of TFR1,IRP1 and FPN in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(±s,n=6)

    表4 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠腦組織TFR1、IRP1 和FPN mRNA 表達(dá)的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the mRNA expressions of TFR1,IRP1 and FPN in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(±s,n=6)

    注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05;與溫陽復(fù)元方組比較,#P<0.05

    FPN 0.998±0.076 0.622±0.124**0.846±0.133△0.514±0.115#0.509±0.166#0.891±0.025△組別假手術(shù)組模型組溫陽復(fù)元方組鐵死亡誘導(dǎo)劑組溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組鐵死亡抑制劑組IRP1 1.295±0.165 0.846±0.181**1.439±0.335△0.898±0.191#0.893±0.128#1.203±0.135△TFR1 0.424±0.147 0.854±0.117**0.457±0.183△0.786±0.135#0.796±0.232#0.465±0.215△

    2.5 溫陽復(fù)元方對CIRI 大鼠TFR1、IRP1 和FPN蛋白表達(dá)的影響如圖2所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠FPN、IRP1 蛋白表達(dá)下降(P<0.05,P<0.01),TFR1 蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。與模型組比較,溫陽復(fù)元方組及鐵死亡抑制劑組大鼠FPN、IRP1 mRNA升高(P<0.05,P<0.01),而TFR1 mRNA表達(dá)量下降(P<0.01);且鐵死亡抑制劑組與溫陽復(fù)元方組比較,各基因表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與溫陽復(fù)元方組比較,鐵死亡誘導(dǎo)劑組及溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠FPN、IRP1蛋白表達(dá)下降(P<0.05,P<0.01),TFR1 蛋白表達(dá)量升高(P<0.01);而與模型組比,則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    圖2 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠腦組織TFR1、IRP1 和FPN 蛋白表達(dá)的影響(±s,n=6)Figure 2 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the protein expressions of TFR1,IRP1 and FPN in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(±s,n=6)

    2.6 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)變化如圖3所示,假手術(shù)組大鼠線粒體結(jié)構(gòu)正常且清晰、線粒體包膜完整、線粒體嵴清晰可見;模型組缺血區(qū)域神經(jīng)元線粒體數(shù)目減少且萎縮、線粒體嵴斷裂甚至溶解消失、膜密度增加;與模型組比較,溫陽復(fù)元方組和鐵死亡抑制劑組神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)相對清晰,線粒體包膜、線粒體嵴相對完整,線粒體嵴清晰;而與溫陽復(fù)元方組比較,鐵死亡誘導(dǎo)劑組和溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑組大鼠神經(jīng)元線粒體形態(tài)學(xué)相似,表現(xiàn)為線粒體數(shù)目減少,線粒體膜密度增加甚至破裂,線粒體嵴斷裂溶解。

    圖3 溫陽復(fù)元方對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠腦組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響(×6 000)Figure 3 Effect of Wenyang Fuyuan Prescription on the ultrastructural changes of neurons in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)(×6 000)

    3 討論

    缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“腦卒中”“中風(fēng)”范疇,今人論中風(fēng)病機(jī)本質(zhì)均認(rèn)為其病機(jī)以“臟腑虛衰、正氣虧虛”為本,“痰、瘀、風(fēng)、火、痰、濕”為標(biāo)[14]。受《黃帝內(nèi)經(jīng)》及《傷寒論》重陽思想的影響,課題組經(jīng)多年理論與實(shí)踐凝練[15]認(rèn)為,中風(fēng)的本質(zhì)是腎虛無力潛陽,傷其本則腎陽虧損、溫煦無力,導(dǎo)致痰濁叢生、堵塞腦絡(luò),進(jìn)一步提出“陽虛”是中風(fēng)病的發(fā)病之本,并貫穿于中風(fēng)病的始終;因此,提出治療需以溫陽培本為大法,治則為溫陽益氣、化痰通絡(luò)(即溫陽復(fù)元法),創(chuàng)立了溫陽復(fù)元方治療的方法。方中白附子能起少陰之真陽,恢復(fù)元陽之虛;黃芪、黨參與白附子合用溫陽益氣,三者共為君藥;桂枝能化太陽之氣,淫羊藿有引陽入陰、啟陰交陽之能,二者為臣;桂枝與白附片相合,則氣機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn),生化之機(jī)乃能暢通,得淫羊藿則一出一入,一開一合,使內(nèi)外宣通,陰陽協(xié)和;再佐以石菖蒲化痰開竅,三七活血散瘀。諸藥合用,共奏溫陽益氣、化痰通絡(luò)之功。課題組前期[7-8]已證明溫陽復(fù)元方在改善腦卒中患者神經(jīng)功能缺損方面療效顯著。在基礎(chǔ)實(shí)驗[9]中也證實(shí)可通過改善腦缺血再灌注損傷大鼠鐵代謝和抗氧化水平對神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。本研究通過神經(jīng)功能缺損評分檢測,顯示模型組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分較假手術(shù)組明顯升高,而溫陽復(fù)元方和鐵死亡抑制劑干預(yù)后,可明顯降低大鼠神經(jīng)功能評分,改善大鼠的神經(jīng)缺損癥狀。同時還發(fā)現(xiàn)溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑聯(lián)合干預(yù)與單純鐵死亡誘導(dǎo)劑干預(yù)后,兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯高于溫陽復(fù)元方組且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,而與模型組比較則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,這說明溫陽復(fù)元方改善大鼠的神經(jīng)功能作用機(jī)制可能與抑制鐵死亡有關(guān)。

    目前研究鐵死亡的主要特征包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩方面。細(xì)胞形態(tài)方面,主要表現(xiàn)為細(xì)胞線粒體變小,膜密度增高,嵴減少;細(xì)胞分子方面,主要表現(xiàn)為鐵依賴的脂質(zhì)過氧化增高,包括Fe2+和GSH的耗竭[16]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠腦組織中Fe2+含量上調(diào)、GSH 含量顯著下降,HE 染色顯示神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少且排列稀疏、細(xì)胞周圍空泡大量形成;電鏡下可見線粒體膜破裂或密度增多,線粒嵴溶解斷裂。而溫陽復(fù)元方和鐵死亡抑制劑干預(yù)后,可降低Fe2+含量,上調(diào)GSH 含量,HE 及電鏡觀察顯示可顯著改善大鼠神經(jīng)細(xì)胞病理性損傷。這提示溫陽復(fù)元方可能具有通過抑制鐵死亡而發(fā)揮神經(jīng)損傷的保護(hù)作用,這與曾勁松等[17]的研究結(jié)果相似。但該方抑制鐵死亡的具體機(jī)制尚不明確。

    鐵死亡的機(jī)制包括鐵代謝、氨基酸代謝及脂質(zhì)代謝[18]。近年來研究[19-20]發(fā)現(xiàn),大腦的鐵代謝紊亂參與缺血性腦卒中后神經(jīng)損傷的病理過程。因此,探索改善鐵代謝抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡也成為神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。研究[21]發(fā)現(xiàn),當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生后,鐵代謝紊亂導(dǎo)致TFR1增加和FPN減少,從而促使細(xì)胞外三價鐵離子(Fe3+)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為游離的二價亞鐵離子Fe2+,在大腦中異常積聚,造成鐵穩(wěn)態(tài)失衡,并通過芬頓(Fenton)反應(yīng)產(chǎn)生的自由基,誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致線粒體鐵死亡,最終引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。在腦內(nèi),IRP/IRE 調(diào)節(jié)的異常,會導(dǎo)致腦內(nèi)的鐵水平發(fā)生明顯變化,引起多種鐵代謝失衡相關(guān)疾病,IRP 包括IRP1 和IRP2 兩型,其中IRP1是一種雙功能酶,已證實(shí)TFR1與FPN是IRE的主要目標(biāo)基因[5]。而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏時,IRP1 與FPNmRNA 5’UTR結(jié)合導(dǎo)致翻譯終止,減少細(xì)胞內(nèi)鐵輸出,同時與TFR1 mRNA 3’UTR結(jié)合,增加了細(xì)胞的鐵攝??;反之,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵過載時,IRP1 終止與IRE 目標(biāo)基因(TFR1 及FPN)結(jié)合,增加細(xì)胞內(nèi)鐵的輸出而減少鐵攝取,維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)[5,22]。因此,改善鐵代謝對維持細(xì)胞內(nèi)外鐵穩(wěn)態(tài)具有重要作用。腦缺血時導(dǎo)致FPN 下調(diào),從而增強(qiáng)鐵的吸收能力,減弱鐵的釋放能力,加劇了鐵在細(xì)胞中的積累[23]。Erastin 鐵死亡誘導(dǎo)劑與Ferrostatin-1 鐵死亡抑制劑是目前公認(rèn)的具有誘導(dǎo)和抑制鐵死亡的化學(xué)制劑,前者能夠通過阻斷細(xì)胞內(nèi)GSH 的合成,削弱細(xì)胞的抗氧化能力,最終導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[24];而后者通過抑制脂質(zhì)體中由鐵和微量脂質(zhì)氫過氧化物引發(fā)的過氧化反應(yīng),清除多余鐵離子及活性氧自由基,進(jìn)而拮抗鐵死亡[25]。因此,本研究選用Erastin和Ferrostatin-1作為對照組,一定程度上可對溫陽復(fù)元方的藥效作用提供參考。本結(jié)果顯示,模型組大鼠IRP1、FPN蛋白及mRNA 表達(dá)水平明顯降低,TFR1 蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高,這說明腦缺血再灌注損傷后可能鐵代謝紊亂參與激活了鐵死亡途徑。而中藥溫陽復(fù)元方與鐵死亡抑制劑干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)上述改變,且兩者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,這一定程度證實(shí)了溫陽復(fù)元方發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制鐵死亡有關(guān)。同時研究還發(fā)現(xiàn)溫陽復(fù)元方+鐵死亡誘導(dǎo)劑與鐵死亡誘導(dǎo)劑干預(yù)后顯示,兩組大鼠腦梗死區(qū)域IRP1、FPN 蛋白及mRNA 表達(dá)水平明顯低于中藥溫陽復(fù)元方組,TFR1 蛋白及mRNA 表達(dá)水平明顯升高,這一定程度上證實(shí)了溫陽復(fù)元方的神經(jīng)保護(hù)作用可能與鐵依賴的脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。這與部分學(xué)者的研究[17,26]有相似之處,一定程度上證實(shí)了中藥復(fù)方可通過改善腦鐵代謝抑制線粒體鐵死亡途徑對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能起到保護(hù)作用。

    綜上,我們可以得出推論,溫陽復(fù)元方可改善大鼠神經(jīng)功能損傷及腦缺血再灌注損傷后大鼠腦缺血區(qū)域神經(jīng)病理損傷,其機(jī)制可能與該方可上調(diào)鐵調(diào)蛋白IRP1 表達(dá),進(jìn)而通過調(diào)節(jié)鐵代謝途徑發(fā)揮抑制鐵死亡有關(guān),這為溫陽復(fù)元方治療缺血性腦卒中提供了實(shí)驗依據(jù)。但該方是否還存在其他的途徑同時作用于調(diào)節(jié)鐵死亡機(jī)制的靶點(diǎn),這是今后需要繼續(xù)深入研究的部分。

    猜你喜歡
    復(fù)元方組誘導(dǎo)劑
    復(fù)元
    間歇浸沒植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)梔子愈傷組織及產(chǎn)藏紅花素條件研究
    門純德臨證思維淺析——從時間醫(yī)學(xué)角度探究“聯(lián)合方組”作用機(jī)制
    復(fù)元活血湯加味聯(lián)合髓內(nèi)釘固定治療股骨骨折術(shù)后不愈合的臨床觀察
    誘導(dǎo)劑對乳白耙齒菌產(chǎn)MnP活性影響研究
    祛痰、化瘀和祛痰化瘀方對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡功能的影響?
    理中復(fù)元方結(jié)合針刺法治療脾虛痰瘀型慢性萎縮性胃炎
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:25
    英國警示含左炔諾孕酮的緊急避孕藥與肝酶誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用可能降低緊急避孕效果
    活血益氣方及其拆方對大鼠心肌梗死邊緣區(qū)Spred1及血管新生的影響
    葡聚糖類抗病誘導(dǎo)劑在水稻上的試驗初報
    最近手机中文字幕大全| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲国产av新网站| 国产精品三级大全| 日日撸夜夜添| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 中文欧美无线码| 搡女人真爽免费视频火全软件| 美女大奶头黄色视频| 久久99精品国语久久久| 大码成人一级视频| 日本av手机在线免费观看| 久久久久精品性色| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲经典国产精华液单| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久免费观看电影| 边亲边吃奶的免费视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美国产精品va在线观看不卡| 男人操女人黄网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 最新中文字幕久久久久| 老司机影院毛片| 1024香蕉在线观看| 99久久人妻综合| 一级黄片播放器| 99九九在线精品视频| 亚洲av中文av极速乱| 妹子高潮喷水视频| 国产精品 欧美亚洲| av免费观看日本| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 少妇的丰满在线观看| 国产成人精品久久二区二区91 | www日本在线高清视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩中文字幕视频在线看片| 最近中文字幕2019免费版| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品亚洲成国产av| 999精品在线视频| 美女国产高潮福利片在线看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 最新的欧美精品一区二区| 日韩视频在线欧美| 欧美成人午夜精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| a级片在线免费高清观看视频| 韩国精品一区二区三区| 国产乱来视频区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一级毛片我不卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 伊人亚洲综合成人网| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久亚洲国产成人精品v| 丝袜喷水一区| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 免费黄网站久久成人精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲国产av新网站| 日本免费在线观看一区| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 丝袜脚勾引网站| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人a∨麻豆精品| 久久午夜福利片| 一本久久精品| 男男h啪啪无遮挡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费看不卡的av| av女优亚洲男人天堂| 天堂8中文在线网| 性少妇av在线| 老鸭窝网址在线观看| 日本欧美视频一区| 亚洲成人一二三区av| av卡一久久| av天堂久久9| 成人国语在线视频| 国产黄频视频在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 韩国av在线不卡| 看免费av毛片| 在线观看三级黄色| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 美女中出高潮动态图| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产免费又黄又爽又色| 青春草视频在线免费观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 欧美在线黄色| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品在线美女| 婷婷色av中文字幕| 自线自在国产av| 99久久人妻综合| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 97人妻天天添夜夜摸| 人妻系列 视频| 国产精品蜜桃在线观看| 老熟女久久久| 国产免费又黄又爽又色| 18+在线观看网站| 深夜精品福利| 九草在线视频观看| 90打野战视频偷拍视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| www.精华液| 国产精品偷伦视频观看了| 免费观看av网站的网址| 18+在线观看网站| 中文字幕制服av| 婷婷成人精品国产| 啦啦啦啦在线视频资源| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品一二三区在线看| 黄色 视频免费看| 男人舔女人的私密视频| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲精品一二三| 美女高潮到喷水免费观看| 中文字幕人妻丝袜制服| av有码第一页| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av综合色区一区| 99久国产av精品国产电影| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 9色porny在线观看| 9色porny在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产片内射在线| 国产成人av激情在线播放| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩av久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 嫩草影院入口| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 婷婷色综合www| 亚洲精品成人av观看孕妇| 晚上一个人看的免费电影| 日本91视频免费播放| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 色网站视频免费| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品无大码| 亚洲国产av新网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 制服诱惑二区| 在线观看三级黄色| 综合色丁香网| 亚洲精品国产av成人精品| a 毛片基地| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产xxxxx性猛交| 赤兔流量卡办理| 国产一区二区激情短视频 | 欧美人与性动交α欧美软件| 观看美女的网站| 欧美国产精品一级二级三级| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品 国内视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | videossex国产| 国产精品久久久久成人av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久久久久国产电影| 欧美在线黄色| 99国产精品免费福利视频| 欧美xxⅹ黑人| 波多野结衣一区麻豆| 观看av在线不卡| 日韩伦理黄色片| 欧美bdsm另类| 看非洲黑人一级黄片| 18在线观看网站| 永久免费av网站大全| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美bdsm另类| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品 欧美亚洲| av在线播放精品| 又黄又粗又硬又大视频| 免费黄色在线免费观看| 国产成人欧美| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜福利一区二区在线看| 久久久欧美国产精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人手机av| xxx大片免费视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 高清在线视频一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜福利视频在线观看免费| 蜜桃在线观看..| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品 国内视频| 国产黄色免费在线视频| 成人黄色视频免费在线看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| xxxhd国产人妻xxx| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲图色成人| 国产成人一区二区在线| 精品福利永久在线观看| 最新中文字幕久久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产 精品1| 精品亚洲成a人片在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品久久久久久久久免| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久久久人人人人人| 黄色 视频免费看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产一级毛片在线| 男女午夜视频在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产 一区精品| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产欧美网| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人午夜精彩视频在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品成人在线| 午夜激情久久久久久久| 看免费av毛片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲视频免费观看视频| 美女高潮到喷水免费观看| 国产av精品麻豆| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美97在线视频| 久久久久精品人妻al黑| 国产成人精品久久久久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 夫妻午夜视频| 咕卡用的链子| 老汉色∧v一级毛片| 午夜福利乱码中文字幕| 国产欧美亚洲国产| 国产精品 国内视频| 国产97色在线日韩免费| 久久97久久精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产亚洲精品第一综合不卡| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品自拍成人| 大片电影免费在线观看免费| 春色校园在线视频观看| 三上悠亚av全集在线观看| 国产成人一区二区在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 一级毛片 在线播放| 99久久综合免费| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久这里有精品视频免费| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av成人精品一二三区| 综合色丁香网| av不卡在线播放| 丝袜在线中文字幕| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 麻豆av在线久日| 国产男人的电影天堂91| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品 国内视频| 十分钟在线观看高清视频www| 9色porny在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看免费视频网站a站| 国产av精品麻豆| 男女免费视频国产| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久国产一区二区| www日本在线高清视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲国产看品久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 黄片无遮挡物在线观看| 国产男女内射视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 九草在线视频观看| 观看av在线不卡| 国产精品一区二区在线不卡| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲国产看品久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 69精品国产乱码久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 咕卡用的链子| 晚上一个人看的免费电影| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美激情高清一区二区三区 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 男女国产视频网站| 国产成人aa在线观看| 一区福利在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产男人的电影天堂91| av不卡在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 天堂中文最新版在线下载| 女人精品久久久久毛片| 午夜老司机福利剧场| 国产爽快片一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 视频区图区小说| 国产成人免费无遮挡视频| 久久精品久久久久久久性| videossex国产| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人人妻人人澡人人看| 久久毛片免费看一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲一区中文字幕在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久99蜜桃精品久久| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 秋霞伦理黄片| freevideosex欧美| 天堂8中文在线网| 久久久久久久国产电影| 夫妻性生交免费视频一级片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成电影观看| 两个人看的免费小视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲精品一二三| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲国产av影院在线观看| 国产一区二区 视频在线| 国产乱来视频区| 亚洲第一av免费看| 大话2 男鬼变身卡| 一区二区av电影网| 日本av手机在线免费观看| 成年av动漫网址| 国产精品一区二区在线观看99| 国产极品粉嫩免费观看在线| 热re99久久国产66热| 国产精品久久久av美女十八| 婷婷色麻豆天堂久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲男人天堂网一区| 又大又黄又爽视频免费| 春色校园在线视频观看| 人妻 亚洲 视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| av国产久精品久网站免费入址| 国产爽快片一区二区三区| 在线天堂最新版资源| av天堂久久9| 丝袜在线中文字幕| 岛国毛片在线播放| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 丝袜美足系列| 日本91视频免费播放| 午夜福利在线免费观看网站| 精品国产一区二区久久| 99久久精品国产国产毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| 母亲3免费完整高清在线观看 | 青青草视频在线视频观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 大片电影免费在线观看免费| 欧美成人午夜精品| 亚洲av电影在线进入| 精品久久蜜臀av无| 久久精品夜色国产| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 两性夫妻黄色片| 99久久综合免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费观看在线日韩| av一本久久久久| 18禁动态无遮挡网站| av.在线天堂| 男女高潮啪啪啪动态图| 丝袜在线中文字幕| 国产成人精品久久久久久| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品蜜桃在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av天堂久久9| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 午夜免费观看性视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 精品人妻在线不人妻| 最新中文字幕久久久久| 美女国产高潮福利片在线看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久精品94久久精品| 乱人伦中国视频| 亚洲精品,欧美精品| 婷婷色综合www| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 少妇被粗大猛烈的视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲成人av在线免费| 国产一区二区 视频在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久久久精品性色| 欧美日本中文国产一区发布| 啦啦啦在线观看免费高清www| 妹子高潮喷水视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 少妇的逼水好多| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品免费视频内射| 久久久久久久久久人人人人人人| 9色porny在线观看| 欧美97在线视频| 日本wwww免费看| 免费看av在线观看网站| 久久人妻熟女aⅴ| av国产精品久久久久影院| 久热这里只有精品99| 亚洲伊人久久精品综合| 秋霞在线观看毛片| 大陆偷拍与自拍| 久久青草综合色| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久精品性色| 色94色欧美一区二区| 久久久久视频综合| 最近2019中文字幕mv第一页| 不卡av一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 少妇熟女欧美另类| 久久女婷五月综合色啪小说| av一本久久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 不卡视频在线观看欧美| 日韩av免费高清视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品免费大片| 韩国av在线不卡| 老司机影院毛片| 精品午夜福利在线看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 日本色播在线视频| 午夜91福利影院| 99re6热这里在线精品视频| 极品人妻少妇av视频| www日本在线高清视频| 亚洲经典国产精华液单| 久久久国产一区二区| 高清在线视频一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久这里有精品视频免费| 男女边摸边吃奶| 一区二区三区乱码不卡18| 男人添女人高潮全过程视频| 免费在线观看黄色视频的| 又黄又粗又硬又大视频| 人妻 亚洲 视频| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲综合色网址| 婷婷色av中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 综合色丁香网| 一级爰片在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜激情av网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久综合国产亚洲精品| 国产av一区二区精品久久| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品在线美女| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 一二三四在线观看免费中文在| 1024香蕉在线观看| 亚洲av.av天堂| 国产精品99久久99久久久不卡 | 免费黄色在线免费观看| 老司机影院毛片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲av免费高清在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 久久久久视频综合| 亚洲伊人色综图| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品免费视频内射| 午夜福利在线免费观看网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 精品人妻在线不人妻| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 熟女电影av网| 美女福利国产在线| 午夜免费观看性视频| 在线观看三级黄色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男女边摸边吃奶| 色播在线永久视频| www.av在线官网国产| 国产成人精品婷婷| 亚洲精品在线美女| 麻豆av在线久日| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲中文av在线| 亚洲欧洲日产国产| 成年动漫av网址| 国产一区二区在线观看av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品 国内视频| 国产成人a∨麻豆精品| 五月开心婷婷网| 欧美少妇被猛烈插入视频| 人妻 亚洲 视频| 中国三级夫妇交换| 国产野战对白在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品一区二区在线观看99| 在线观看免费高清a一片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 欧美xxⅹ黑人| 丰满少妇做爰视频| 高清视频免费观看一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 大码成人一级视频| 免费黄网站久久成人精品| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精品自拍成人| 久久国内精品自在自线图片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产淫语在线视频| 大码成人一级视频| 美女视频免费永久观看网站| 观看av在线不卡| www日本在线高清视频| 大话2 男鬼变身卡| 人妻人人澡人人爽人人| 黄频高清免费视频| 丝袜美足系列| 国产av精品麻豆| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 十八禁网站网址无遮挡| 一级毛片电影观看| 涩涩av久久男人的天堂| 日本av免费视频播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 纵有疾风起免费观看全集完整版|