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    蘇木酮A 通過抑制JAK2-STAT3 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用

    2023-12-20 08:59:54鄧成杰馬洪星張華茜胡月周黃靜孫世芹辛萍哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院黑龍江大慶69江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科江蘇南京00江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院科教科江蘇南京00
    中藥新藥與臨床藥理 2023年12期
    關(guān)鍵詞:蘇木抗炎存活率

    鄧成杰,馬洪星,張華茜,胡月周,黃靜,孫世芹,辛萍(. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院,黑龍江大慶 69;. 江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇南京 00;. 江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院科教科,江蘇南京 00)

    炎癥反應(yīng)是對(duì)組織損傷和病原體入侵和感染的快速防御反應(yīng)。巨噬細(xì)胞及其它吞噬細(xì)胞是宿主抵御微生物入侵的首要防線,可以吞噬炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的有害物質(zhì)并維持體內(nèi)平衡,也是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵免疫細(xì)胞[1]。巨噬細(xì)胞的持續(xù)活化會(huì)分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β等大量的炎癥介質(zhì),這些介質(zhì)不受控制的產(chǎn)生或過量分泌與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]。巨噬細(xì)胞表面的TLR-4 受體的激活會(huì)啟動(dòng)胞內(nèi)下游炎癥信號(hào)通路,包括JAK-STAT、MAPK 和PI3K-AKT 等[5-7]。目前,臨床上JAK-STAT 抑制劑在治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等炎癥相關(guān)疾病方面顯示出很大的優(yōu)勢,持續(xù)激活的JAK-STAT信號(hào)通路在某些病理?xiàng)l件下,經(jīng)常引起慢性炎癥和炎癥介導(dǎo)的癌癥[8]。在炎癥狀態(tài)下,細(xì)胞膜表面的細(xì)胞因子與受體和配體相結(jié)合產(chǎn)生二聚化從而激活下游信號(hào)通路JAK2-STAT3[9]。已有研究[10]表明,抑制JAK2-STAT3蛋白激酶的磷酸化能夠減少促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌和表達(dá),進(jìn)而有效抑制炎癥反應(yīng)。

    蘇木酮A(Sappanone A,SA)屬于高異黃酮類化合物,是從豆科云實(shí)屬植物蘇木(CaesalpiniasappanL.)的心材中分離出來的單體[11]。蘇木主要分布于東南亞,具有活血祛瘀、消腫止痛的作用?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究[12-14]表明,蘇木酮A具有多種生物活性,如抗神經(jīng)炎、抗腫瘤、抗氧化和免疫抑制等活性。然而,蘇木酮A的抗炎活性及其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。因此,本研究擬采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),以評(píng)價(jià)蘇木酮A的抗炎活性并探討其作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)小鼠單核巨噬RAW264.7 細(xì)胞購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫,培養(yǎng)在含有10%FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)液中,細(xì)胞密度約達(dá)到80%,并取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2 藥物及試劑蘇木酮A(純度≥98%),赫利森生物科技有限公司,批號(hào):HS030-10-04;AG490(JAK2 特異性抑制劑),美國Selleck&bimake 公司,批號(hào):S114303;脂多糖(LPS),北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):462H031;胎牛血清(FBS)浙江天杭生物科技股份有限公司,批號(hào):19070704;DMEM高糖培養(yǎng)基,美國GE 公司,批號(hào):AD20616263;MTT,北京伊塔生物科技有限公司,批號(hào):EZ2811B347;小鼠IL-6 ELISA 試劑盒,北京欣博盛生物科技有限公司,批號(hào):M180327-004a;總RNA提取試劑盒,上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司,批號(hào):0000278076;SYBR@Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒,上海東洋紡生物科技有限公司,批號(hào):841500;BCA 蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):052319190910;JAK2(批號(hào):H08233592)、p-JAK2(批號(hào):G04152997)、STAT3(批號(hào): G07143207)、 p- STAT3(批號(hào):G04153001)一抗,均購自萬類生物科技有限公司;β-actin 一抗(批號(hào):191050722)、兔二抗(批號(hào):139931),均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.3 主要儀器Airstream?Gen 3 ESCO 超凈工作臺(tái),深圳市賽亞泰科儀器設(shè)備公司;BioTekSynergyHT 多功能酶標(biāo)儀,美國BioTek 公司;AE2000 倒置顯微鏡,上海光學(xué)儀器廠;Centrifuge 5430R 超低溫高速離心機(jī),德國Eppendorf 公司;LightCycler 480 PCR儀,瑞士Roche 公司;AI600 超靈敏多功能成像儀,美國GE公司。

    1.4 MTT 法測定細(xì)胞存活率將RAW264.7 細(xì)胞以1.5×104個(gè)·孔-1接種于96 孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL,每組平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h;棄掉培養(yǎng)液,用不同濃度梯度SA、LPS、AG490 分別處理20 h 后;然后每孔加入200 μL 的0.5 mg·mL-1MTT 溶液,在5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h;吸去上清液,每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO),用酶標(biāo)儀在492 nm處檢測各孔吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)孔OD值/空白孔OD值×100%。

    1.5 ELISA法檢測細(xì)胞IL-6分泌水平將2×105個(gè)·mL-1RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于24 孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL。培養(yǎng)20 h 后,除空白組外,其余各孔均加入100 ng·mL-1LPS 刺激。設(shè)置LPS 模型組,蘇木酮A低、中、高劑量組(1.25,2.5、5 μg·mL-1),蘇木酮A中劑量聯(lián)合抑制劑組(2.5 μg·mL-1蘇木酮A+10 μg·mL-1AG490)、蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑組(5 μg·mL-1蘇木酮A+10 μg·mL-1AG490),處理細(xì)胞20 h。收集上清液,按ELISA試劑盒說明書操作,用酶標(biāo)儀檢測IL-6分泌水平。

    1.6 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)水平將4×105個(gè)·mL-1RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于6 孔培養(yǎng)板中,每孔2 mL。培養(yǎng)20 h后,除空白組外,其余各孔均加入100 ng·mL-1LPS刺激。設(shè)置LPS模型組、高劑量(5 μg·mL-1)蘇木酮A組、蘇木酮A高劑量聯(lián)合抑制劑組(5 μg·mL-1蘇木酮A+10 μg·mL-1AG490),處理細(xì)胞20 h。使用EastepSuper 總RNA 提取試劑盒提取RAW264.7 細(xì)胞總RNA,進(jìn)行定量,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR master mix 試劑盒對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,階段1:95 ℃、30 s;階段2:95 ℃、5 s;55 ℃、10 s;72 ℃、15 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作內(nèi)參,運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算各組間mRNA 表達(dá)水平差異并歸一化處理。所使用的引物序列如表1所示,引物由賽默飛科技(中國)有限公司合成。

    表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of Real-Time qPCR

    1.7 Western Blot 法檢測細(xì)胞JAK2、STAT3 蛋白水平的表達(dá)將4×105個(gè)·mL-1RAW264.7細(xì)胞懸液接種于6 孔培養(yǎng)板中,每孔2 mL,細(xì)胞培養(yǎng)、分組及給藥同“1.6”項(xiàng)下。向6 孔板中加入含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液,提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度;上樣量30 μg蛋白,經(jīng)8%~15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜;5%的脫脂牛奶封閉1 h后,用0.1%的Tween 20(T-TBS)洗滌。孵育一抗,于4 ℃過夜;第2 天,取出用TTBS 洗滌,在室溫下孵育二抗1 h 后,用T-TBS 洗滌,ECL熒光劑將蛋白可視化,在超靈敏多功能成像儀AI600 進(jìn)行顯影。使用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 蘇木酮A、LPS 和AG490 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響采用MTT 法進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2~表4。以5、10、 20、40和80 μg·mL-1蘇木酮A處理RAW264.7細(xì)胞,結(jié)果顯示與空白組比較,5 μg·mL-1蘇木酮A 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率無影響(P>0.05),故選取1.25、2.5、5 μg·mL-1蘇木酮A 作為炎性細(xì)胞因子IL-6 的處理濃度。與空白組比較,50、100、500 ng·mL-1LPS 處理的RAW264.7 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活能力無影響(P>0.05),1 000 ng·mL-1LPS 可明顯降低RAW264.7 細(xì)胞的存活率(P<0.05),故選取100 ng·mL-1LPS來建立RAW264.7細(xì)胞炎性模型。以濃度為5、10、15、20、25 μg·mL-1的AG490 處理RAW264.7 細(xì)胞,結(jié)果顯示與空白組比較,5 和10 μg·mL-1AG490對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活無影響(P>0.05),故選取濃度為10 μg·mL-1的AG490 進(jìn)行后續(xù)分子水平研究。

    表2 蘇木酮A(SA)對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響(±s,n=5)Table 2 Effect of sappanone A(SA)on the survival rate of RAW264.7 cells(±s,n=5)

    表2 蘇木酮A(SA)對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響(±s,n=5)Table 2 Effect of sappanone A(SA)on the survival rate of RAW264.7 cells(±s,n=5)

    注:與空白組比較,**P<0.01

    細(xì)胞存活率/%100.00±13.13 96.36±19.09 47.77±9.44**40.99±4.27**15.54±3.37**5.29±1.30**組別空白組蘇木酮A組濃度/(μg·mL-1)-5 10 20 40 80 OD值2.187±0.287 2.087±0.414 1.045±0.206 0.896±0.093 0.340±0.074 0.116±0.028

    表3 脂多糖(LPS)對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響(±s,n=5)Table 3 Effect of lipopolysaccharide(LPS)on the survival rate of RAW264.7 cells(±s,n=5)

    表3 脂多糖(LPS)對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響(±s,n=5)Table 3 Effect of lipopolysaccharide(LPS)on the survival rate of RAW264.7 cells(±s,n=5)

    注:與空白組比較,*P<0.05

    細(xì)胞存活率/%100.00±1.46 97.69±2.94 95.36±5.51 98.89±11.16 88.27±10.10*組別空白組LPS組濃度/(ng·mL-1)-50 100 500 1 000 OD值1.873±0.027 1.830±0.055 1.786±0.103 1.852±0.209 1.594±0.064

    表4 AG490 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響(±s,n=5)Table 4 Effect of AG490 on the survival rate of RAW264.7 cells(±s,n=5)

    表4 AG490 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響(±s,n=5)Table 4 Effect of AG490 on the survival rate of RAW264.7 cells(±s,n=5)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01

    細(xì)胞存活率/%100.00±4.25 94.36±13.81 98.37±15.25 91.29±10.00*79.51±5.15**68.34±3.04**組別空白組AG490組濃度/(μg·mL-1)-5 10 15 20 25 OD值1.933±0.082 1.791±0.206 1.902±0.295 1.765±0.193 1.537±0.100 1.321±0.059

    2.2 蘇木酮A 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6水平的影響結(jié)果見圖1。與空白組比,LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生IL-6 水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比,蘇木酮A 低劑量組IL-6 水平與模型組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),中、高劑量組RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6 明顯降低(P<0.01)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蘇木酮A 的抗炎效果,我們使用JAK2的特異性抑制劑AG490 與蘇木酮A 聯(lián)合處理,蘇木酮A中劑量聯(lián)合抑制劑組、蘇木酮A高劑量聯(lián)合抑制劑組的RAW264.7 細(xì)胞IL-6 分泌水平均明顯降低(P<0.01)。

    圖1 蘇木酮A(SA)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6 水平的影響(±s,n=6)Figure 1 Effects of sappanone A(SA)on the level of IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells(±s,n=6)

    2.3 蘇木酮A 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6、JAK2 及STAT3 mRNA 的表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。與空白組比,模型組IL-6、JAK2 及STAT3 mRNA 表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)。與模型組比,蘇木酮A 高劑量組及蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑組的IL-6、JAK2 和STAT3 mRNA 表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01),且二者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖2 蘇木酮A(SA)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)的影響(±s,n=6)Figure 2 Effects of sappanone A(SA)on the mRNA expressions of IL-6,JAK2 and STAT3 in LPS-induced RAW264.7 cells(±s,n=6)

    2.4 SA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。與空白組比,LPS 模型組的p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);蘇木酮A 高劑量組、蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑組均明顯下調(diào)p-JAK2、p-STAT3 蛋白的表達(dá)(P<0.01),且二者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3 討論

    炎癥與大多數(shù)疾病的病理生理過程的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在炎癥過程中會(huì)分泌大量的炎癥細(xì)胞因子,可作用于多種細(xì)胞并引發(fā)“炎癥因子風(fēng)暴”,這種過度的不可控的炎癥反應(yīng)加劇了對(duì)細(xì)胞的損傷,最終導(dǎo)致多種炎癥疾病破壞機(jī)體健康或死亡[15-16]。RAW264.7細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)非常重要的免疫細(xì)胞和炎癥效應(yīng)細(xì)胞,在自身免疫性疾病、炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[17]。當(dāng)外界因素刺激RAW264.7 細(xì)胞時(shí),會(huì)導(dǎo)致促炎因子大量生成并釋放,如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等。因此,抑制RAW264.7細(xì)胞中促炎性因子的表達(dá)和釋放被認(rèn)為是預(yù)防和治療炎癥性疾病的潛在策略。Najjar 等[18]研究LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中山茱萸多酚提取物的抗炎效果,蛋白水平結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β和IL-6均明顯下調(diào)。Lampiasi 等[19]利用LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠抑制IL-6 mRNA 表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,蘇木酮A 或蘇木酮A 聯(lián)合AG490 均可抑制RAW264.7細(xì)胞中炎性因子IL-6的釋放,這說明蘇木酮A或蘇木酮A聯(lián)合AG490均能通過降低炎性因子的表達(dá)來改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥,并且蘇木酮A的處理濃度越高,抑制IL-6釋放越明顯,抗炎作用越好。

    JAK2-STAT3信號(hào)通路的持續(xù)激活與許多炎癥性和免疫疾病密切相關(guān),包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、敗血癥以及腫瘤性疾病等[2-4]。在炎癥過程中,JAK2-STAT3 是受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的主要信號(hào)通路,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相對(duì)簡單。當(dāng)細(xì)胞受到外源性LPS刺激后,會(huì)分泌炎癥細(xì)胞因子并與細(xì)胞表面的膜受體相結(jié)合,首先激活細(xì)胞質(zhì)中JAK2激酶發(fā)生磷酸化,進(jìn)而激活下游STAT3 蛋白磷酸化并活化形成二聚體。最后,細(xì)胞質(zhì)中的二聚化STAT3 被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,進(jìn)一步促使細(xì)胞分泌一些炎癥細(xì)胞因子[20]。先前的研究[21]表明,JAK2-STAT3 信號(hào)通路可在LPS刺激的RAW264.7 細(xì)胞中激活并釋放炎性細(xì)胞因子,例如TNF-α、IL-1β和IL-6等。本研究中,我們研究了蘇木酮A 在LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞中對(duì)JAK2-STAT3磷酸化蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),蘇木酮A高劑量組和蘇木酮A 高劑量聯(lián)合抑制劑AG490 處理組均明顯下調(diào)p-JAK2、p-STAT3 蛋白的表達(dá)(P<0.01),且二者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明蘇木酮A可能是潛在的JAK2-STAT3抑制劑,但仍需進(jìn)一步深入研究。以上結(jié)果表明,蘇木酮A可以通過抑制LPS刺激的JAK2磷酸化,進(jìn)而抑制STAT3的磷酸化,從而發(fā)揮抑制炎癥作用。

    使用LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞是構(gòu)建體外炎癥的經(jīng)典模型,故本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上探討了蘇木酮A的抗炎活性及作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,蘇木酮A能夠下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中p-JAK2 和p-STAT3 基因與蛋白表達(dá),減少促炎因子IL-6 的分泌,進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用,可為蘇木酮A在治療炎癥性疾病的藥物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但在本研究中尚未涉及其他網(wǎng)絡(luò)調(diào)控信號(hào)的探索,我們擬在后續(xù)的研究中探討蘇木酮A是否通過其他網(wǎng)絡(luò)調(diào)控信號(hào)或靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎作用,并完善其分子作用機(jī)制。

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