基于轉(zhuǎn)錄組鑒定鼓槌石斛花溫度脅迫響應(yīng)基因

陳宏宇，于瑩，李菲

基于轉(zhuǎn)錄組鑒定鼓槌石斛花溫度脅迫響應(yīng)基因

陳宏宇1，于瑩2，李菲1

（貴州中醫(yī)藥大學(xué) 1. 藥學(xué)院，2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

為研究鼓槌石斛花在溫度脅迫應(yīng)答方面的基因表達(dá)差異，對其在低溫和高溫脅迫下進(jìn)行Illumina技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測序．結(jié)果表明，組裝獲得321 734個單基因，其中141 464個基因在Nr，COG等4個數(shù)據(jù)庫中獲得注釋．低溫和高溫脅迫分別識別了3 830，10 430個應(yīng)答基因．在應(yīng)答基因中，發(fā)現(xiàn)多個CBL，CBF和熱激蛋白等基因成員．鼓槌石斛花低溫脅迫應(yīng)答可能與“損傷應(yīng)答”“細(xì)胞外區(qū)”“血紅素結(jié)合”等多個過程有關(guān)；高溫脅迫應(yīng)答可能與“缺水應(yīng)答”“核”“ATP結(jié)合”等多個過程有關(guān)．這些差異基因為解析鼓槌石斛非生物脅迫應(yīng)答機制提供幫助．

鼓槌石斛；轉(zhuǎn)錄組；溫度脅迫；基因

鼓槌石斛（Lindl.）為蘭科石斛屬附生植物，是藥典石斛的主要來源之一，其益胃生津、滋陰清熱，用于病后虛熱、口干煩渴、腫痛等[1]．鼓槌石斛野生資源有限，由于生長緩慢和過度采挖，其野生資源驟減，栽培產(chǎn)量也較低[2]．

低溫和高溫脅迫是常見的非生物脅迫．低溫會引起細(xì)胞膜損傷，造成代謝失調(diào)，活性氧積累[3]，同時激活信號分子，引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使抗逆功能基因表達(dá)[4]．DREB/CBF途徑是低溫調(diào)控的主要通路[5]．MAPK、鈣調(diào)蛋白、CDPK和ICE轉(zhuǎn)錄因子等也是低溫響應(yīng)基因[6]．高溫會改變細(xì)胞膜流動性，造成內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，影響分子遺傳等功能[7]．等高溫耐受功能基因可以保護(hù)細(xì)胞膜、葉綠體和代謝等過程[8]．高通量測序技術(shù)用于大規(guī)模分析基因表達(dá)并識別基因功能和調(diào)控通路[9]．THOMASHOW[10]等利用基因芯片首次研究了擬南芥低溫脅迫響應(yīng)基因．隨著測序技術(shù)的成熟，基于測序的轉(zhuǎn)錄組分析在該領(lǐng)域應(yīng)用逐漸增多[11]．LI[12]等利用轉(zhuǎn)錄組研究了柳枝稷高溫脅迫響應(yīng)分子機制．隨后，陸續(xù)報道了棉花、苦瓜和茶樹等相關(guān)的研究與分析[13]．鼓槌石斛春季開花，目前未見鼓槌石斛與溫度脅迫分子機制的相關(guān)報道，本文對鼓槌石斛花在低溫和高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，識別差異表達(dá)基因，分析調(diào)控通路，為進(jìn)一步揭示其脅迫應(yīng)答分子機制提供基礎(chǔ)．

1　實驗部分

1.1　材料與處理

鼓槌石斛由生藥學(xué)實驗室提供，栽培基質(zhì)為碎松樹皮+木屑（3∶1）．碎松樹皮源于四川松樹，取皮粉碎為3～6 mm碎片，以黑色塑料營養(yǎng)缽作為容器，放入人工氣候室（22℃，14 h光照/天）．開花后，選取花期一致的15顆植株，分為3組，分別為對照、低溫（4℃人工氣候室）處理和高溫（40℃人工氣候室）處理．1 h后，每組取5朵花，稱取相同質(zhì)量，混樣后液氮冷凍．

1.2　測序

樣本提取總RNA，消化DNA，反轉(zhuǎn)錄．cDNA擴增產(chǎn)生150～200 bp的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行定量和純化．利用金唯智（GENEWIZ）公司Illumina IIx基因組分析系統(tǒng)進(jìn)行32 nt單端轉(zhuǎn)錄組測序．利用Cutadapt（v1.9.1）軟件去除接頭序列，去除5’或3’末端質(zhì)量值低于20或含N堿基，去除trim后reads長度低于75 bp的序列．

1.3　基因組裝與注釋

合并所有樣本數(shù)據(jù)后，利用Trinity（v2.2.0）軟件從頭組裝，序列聚類后進(jìn)行序列拼接和冗余去除，得到非冗余長Unigene序列，統(tǒng)計序列數(shù)量與長度分布．利用BLAST軟件對Unigene進(jìn)行Nr數(shù)據(jù)庫、SwissProt數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、COG數(shù)據(jù)庫注釋．

1.4　基因表達(dá)分析

利用FPKM值表示對應(yīng)Unigene的表達(dá)量．使用Bioconductor軟件包的edgeR（v3.4.6）進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異基因表達(dá)變化2倍以上且qvalue≤0.05定義為差異顯著基因．采用GOseq法進(jìn)行GO富集，顯著富集篩選標(biāo)準(zhǔn)為over_represented_pvalue≤0.05，KEGG顯著富集篩選標(biāo)準(zhǔn)為Qvalue<0.05．

2　結(jié)果與討論

2.1　測序與差異表達(dá)基因

對鼓槌石斛花對照、低溫處理和高溫處理3個樣本測序，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，分別獲得28 776 626，39 813 750，31 544 116個Reads．3個樣本數(shù)據(jù)合并后，從頭組裝共獲得321 734條長的、非冗余單基因，平均長度526.98，GC含量39.02%．其中長度為200～500 bp的單基因數(shù)量最多，占總數(shù)的71.9%．利用Nr，COG，SwissProt，KEGG數(shù)據(jù)庫分別注釋了138 372，41 957，56 479，8 778條單基因，共141 464條單基因．

經(jīng)計算得，低溫脅迫識別差異表達(dá)基因3 830個，其中上調(diào)（誘導(dǎo)）表達(dá)1 533個，下調(diào)（抑制）表達(dá)2 297個；高溫脅迫識別差異表達(dá)基因10 430個，其中上調(diào)表達(dá)4 422個，下調(diào)表達(dá)6 008個．結(jié)果表明，在2種脅迫下均有較大程度的基因表達(dá)量變化，高溫脅迫應(yīng)答基因數(shù)量明顯多于低溫脅迫，2種脅迫下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量均多于上調(diào)表達(dá)基因．

2.2　基于GO的基因功能分類

鼓槌石斛花低溫脅迫應(yīng)答基因的顯著富集功能聚類分為三大類：生物過程、細(xì)胞組分和分子功能，分別有10，3，17個功能聚類．高溫脅迫三大類分別為13，6，11個．按照差異表達(dá)基因數(shù)量，分別列出每種聚類排名前5的類別，其中細(xì)胞組分只有3個類別（見表1～2）．結(jié)果表明，低溫脅迫在3種聚類的數(shù)量都少于高溫脅迫．低溫脅迫引起鼓槌石斛花“損傷應(yīng)答”“細(xì)胞外區(qū)”“血紅素結(jié)合”等方面的應(yīng)答．但“低溫應(yīng)答”并未列入最顯著富集的30個聚類．高溫脅迫引起鼓槌石斛花“缺水應(yīng)答”“核”“ATP結(jié)合”等方面的應(yīng)答．同時分別有88和43個基因聚類在“熱脅迫應(yīng)答”和“細(xì)胞對熱應(yīng)答”，說明高溫脅迫引起鼓槌石斛花熱脅迫應(yīng)答相關(guān)基因響應(yīng)．

表1　鼓槌石斛花低溫脅迫應(yīng)答基因的GO聚類分析

表2　鼓槌石斛花高溫脅迫應(yīng)答基因的GO聚類分析

2.3　基于KEGG的基因調(diào)控通路分析

鼓槌石斛花低溫脅迫應(yīng)答基因歸屬通路分為三大類：遺傳信息過程、代謝和細(xì)胞過程，分別有1，28，1個通路（見表3，圖1a）．鼓槌石斛花高溫脅迫應(yīng)答基因歸屬通路分為四大類：環(huán)境信息過程、遺傳信息過程、代謝和細(xì)胞過程，分別有3，8，17，2個通路（見表4，圖1b）．按照差異表達(dá)基因數(shù)量，遺傳信息過程和代謝只列出排名前5的通路．結(jié)果表明，低溫脅迫中代謝過程是最主要的富集途徑，差異表達(dá)基因數(shù)量和占比最多；高溫脅迫中除代謝過程外，環(huán)境信息過程、遺傳信息過程和細(xì)胞過程的差異表達(dá)基因數(shù)量也較多．

表3　鼓槌石斛花低溫脅迫應(yīng)答基因的KEGG聚類分析

表4　鼓槌石斛花高溫脅迫應(yīng)答基因的KEGG聚類分析

圖1　鼓槌石斛花低溫、高溫脅迫應(yīng)答基因的KEGG聚類分析

2.4　溫度脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析

DREB/CBF（dehydration-responsive element-binding protein/C-repeat binding factor）途徑是植物最重要的低溫應(yīng)答通路之一，本文識別了34個可能的CBF基因，但在低溫脅迫下均未顯著表達(dá)．列舉了在低溫脅迫下有一定程度差異表達(dá)的13個CBF基因（見表5）．其中，DN134227_c0_g1_i1，DN135743_c0_g2_i6在低溫脅迫下表達(dá)量有所升高；DN119624_c0_g1_i1，DN127127_c0_g3_i1，DN129406_c0_g1_i1，DN134227_c2_g1_i3，DN135743_c0_g2_i3，DN135822_c1_g10_i1，DN135822_c1_g1_i1，DN135822_c1_g5_i1，DN135822_c1_g8_i2，DN138346_c1_g2_i1，DN60230_c0_g1_i2在低溫脅迫下表達(dá)量有所降低，但均未達(dá)到顯著差異．

表5　鼓槌石斛花DREB/CBF基因在低溫脅迫下的相對表達(dá)量

根據(jù)基因功能聚類分析，識別了鼓槌石斛花高溫脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因（GO：0009408）．按照差異表達(dá)程度，列出排名前10的基因（見表6）．結(jié)果表明，鼓槌石斛花在高溫脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)程度最高的10個基因均屬于熱激蛋白．

2.5　MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)分析

MAPK是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase）家族，按照級聯(lián)途徑分為MAPK，MAPKK，MAPKKK；按信號來源分類，分別逐級激活調(diào)控下游其他基因的表達(dá)．本文識別了188個可能的MAPK基因，其中在低溫脅迫中，3個上調(diào)表達(dá)，2個下調(diào)表達(dá)（見表7）；在高溫脅迫中，6個上調(diào)表達(dá)，12個下調(diào)表達(dá)（見表8）．結(jié)果表明，低溫脅迫對MAPK誘導(dǎo)較小，高溫脅迫對MAPK誘導(dǎo)較大．MAPKK9在2種溫度脅迫中都被誘導(dǎo)表達(dá)；MAPK10和MAPKKK1都被抑制表達(dá)．

表7　鼓槌石斛花低溫脅迫應(yīng)答MAPK家族基因

表8　鼓槌石斛花高溫脅迫應(yīng)答MAPK家族基因

3　結(jié)論

利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)拈呈诘蜏睾透邷孛{迫下的花進(jìn)行基因表達(dá)分析，組裝獲得321 734個單基因，其中141 464個基因獲得注釋．低溫和高溫脅迫分別識別了3 830和10 430個應(yīng)答基因．按照GO聚類的分析，“損傷應(yīng)答”“細(xì)胞外區(qū)”“血紅素結(jié)合”等方面可能在鼓槌石斛花低溫脅迫應(yīng)答起到重要作用，而“缺水應(yīng)答”“核”“ATP結(jié)合”等方面可能在其高溫脅迫應(yīng)答起到重要作用．同時，按照KEGG調(diào)控通路預(yù)測，代謝過程等方面在其溫度脅迫應(yīng)答方面起到重要作用．

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Identifying genes responsive to temperature stress inflower based on transcriptome analysis

CHEN Hongyu1，YU Ying2，LIFei1

（1. School of Pharmacy，2. School of Basic Medicine，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China）

To understand the information of differentially expressed genes under temperature stress inflower．The transcriptome of flower under low temperature stress and high temperature stress were sequenced by Illumina sequencing technology．The results showed that there were 321 734 unigenes obtained，among which 141 464 unigenes were annotated by four databases．There were 3 830 and 10 430 responsive genes in low temperature stress and high temperature stress in．Among the regulated genes were members of the CBL，CBF，heat shock protein and so on．On thebasisthat result of gene regulation pathways，the low temperature stress responsive genes was correlated with response to wounding，extracellular region and heme binding．The high temperature stress responsive genes was correlated with response to water deprivation，nucleus and ATP binding in．Differences in gene expression may contribute to the observed mechanism of abiotic stress responsive in．

；transcriptome；temperature stress；gene

1007-9831（2023）11-0044-06

Q94

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2023.11.009

2023-06-07

貴州省科技計劃項目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2021]一般521）；貴州中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動基金（貴中醫(yī)博士啟動[2020]19號，3043-043200019）

陳宏宇（1981-），男，黑龍江齊齊哈爾人，講師，博士，從事藥用植物學(xué)研究．E-mail：chy810501@163.com