蛇含委陵菜的化學(xué)成分及抗炎活性研究

張 寶, 劉 佳, 匡維米, 蔣 禮, 李勇軍, 李 悅*

( 1. 貴陽(yáng)市婦幼保健院/貴陽(yáng)市兒童醫(yī)院 藥學(xué)部, 貴陽(yáng) 550003; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴安 561113; 3. 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴安 561113 )

蛇含委陵菜(Potentillakleiniana)為薔薇科委陵菜屬一年生、二年生或多年生宿根草本植物,又名五匹風(fēng)、五皮風(fēng)、地五甲、五爪龍等,在我國(guó)主要分布于廣西、貴州、云南、四川等地(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì),1985;貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)編審委員會(huì),2003)。蛇含委陵菜味苦、性微寒,歸肝、肺經(jīng),具有祛風(fēng)止咳、搜風(fēng)剔邪、清熱解毒等功效,在貴州省苗族、布依族及侗族等少數(shù)民族地區(qū)常用于治療肺炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎性疾病(羅迎春和孫慶文,2013)。目前對(duì)蛇含委陵菜的化學(xué)成分及生物活性鮮有研究,已報(bào)道的化學(xué)成分主要包括三萜類(lèi)和黃酮類(lèi)(黃易安,2008;李勝華等,2011),生物活性側(cè)重于提取物的抗菌、抗炎、降糖活性篩選(李勝華等,2014;張晨光等,2018;Liu et al., 2019),其抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。為了進(jìn)一步豐富該藥用植物的化學(xué)成分信息,明確其抗炎活性物質(zhì),促進(jìn)其開(kāi)發(fā)利用,本研究以黔產(chǎn)蛇含委陵菜全株為研究對(duì)象,采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)、光譜學(xué)手段及藥理學(xué)方法,擬探討:(1)蛇含委陵菜60%乙醇提取物的化學(xué)成分;(2)分離得到的化合物的體外抗炎活性。

1 材料與儀器

1.1 材料

蛇含委陵菜藥材采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)高坡鄉(xiāng),經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)劉春花副教授鑒定為薔薇科植物蛇含委陵菜(Potentillakleiniana)全草(圖1)。標(biāo)本保存于貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,憑證號(hào)為NO.20210416。

1.2 儀器

高分辨質(zhì)譜儀(Theemo Fisher Q Exactive-Plus 四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道肼,Theemo Fisher Scientific公司,美國(guó));核磁共振波譜儀(Bruker AV-600型,Bruker公司,德國(guó);JEOL-ECS-400 MHz型,JEOL,日本);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHIR-300型,BUCHI公司,瑞士);超純水機(jī)(KZ-20L型,上?？浦骗h(huán)保設(shè)備有限公司);MCI(CHP20/P120,三菱公司,日本);D-101大孔樹(shù)脂(天津市海光化工有限公司);柱層析硅膠及硅膠GF254預(yù)制板(青島海洋化工廠);Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech公司,瑞士);Toyopearl HW 40F(JEOL,日本);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Gibco公司,美國(guó));CCK-8試劑盒(GlpBio公司,美國(guó));NO試劑盒(南京建成生物工程研究所);脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(北京索萊寶科技有限公司);地塞米松(上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司);小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù),美國(guó))。其余化學(xué)試劑均為分析純。

圖 1 蛇含委陵菜標(biāo)本Fig. 1 Sample of Potentilla kleiniana

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

取蛇含委陵菜干燥全草15 kg,粉碎后用乙醇-水(60∶40,V/V)回流提取3次(2、1.5、1.5 h),提取液合并后減壓濃縮至浸膏(2.1 kg)。浸膏加入適量蒸餾水,超聲振蕩分散,經(jīng)D-101大孔樹(shù)脂,用乙醇-水(0∶100,50∶50,95∶5,V/V)洗脫,收集各部分洗脫液,減壓濃縮。其中,50%乙醇部位(428 g)經(jīng)正相硅膠柱層析(硅膠:200～300目。洗脫劑:氯仿-甲醇50∶1～1∶1,V/V)洗脫,得到9個(gè)組分(Fr.A～Fr.I)。

Fr.B減壓濃縮并放至室溫后析出少量難溶性粉末狀沉淀,過(guò)濾沉淀備用,濾液經(jīng)正相硅膠柱層析(硅膠:300～400目。洗脫劑:二氯甲烷-甲醇100∶1,V/V)得到Fr.B1～Fr.B3。Fr.B3經(jīng)正相硅膠柱層析(硅膠:300～400目。洗脫劑:石油醚-丙酮20∶1,V/V)得到Fr.B3.1～Fr.3.6。Fr.B3.6依次經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20(二氯甲烷-甲醇 1∶1,V/V)、正相硅膠(硅膠:300～400目。洗脫劑:二氯甲烷-甲醇 100∶1,V/V)柱層析純化,得化合物1(10.4 mg)、6(15.1 mg)。

Fr.C經(jīng)正相硅膠柱層析(硅膠:200～300目。洗脫劑:石油醚-乙酸乙酯20∶1～1∶1,V/V)梯度洗脫得到Fr.C1～Fr.C4。Fr.C2～Fr.C4經(jīng)反復(fù)正相硅膠、Sephadex LH-20(二氯甲烷-甲醇 1∶1,V/V)、Toyopearl HW-40F(二氯甲烷-甲醇 1∶1,V/V)、ODS(甲醇-水 80∶20～95∶5,V/V)柱層析純化,最終得化合物2(11.8 mg)、3(13.2 mg)、4(2.9 mg)、5(11.3 mg)、8(6.3 mg)、11(5.3 mg)。

Fr.D經(jīng)MCI柱層析,乙醇-水(30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0,V/V)梯度洗脫得到Fr.D1～Fr.D8。Fr.D2減壓濃縮并放至室溫后析出少量難溶性粉末狀沉淀,過(guò)濾沉淀備用,濾液經(jīng)正相硅膠柱層析(硅膠:300～400目。洗脫劑:二氯甲烷-甲醇 20∶1,V/V)得6個(gè)組分,其中Fr.D2.3～Fr.D2.4經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20(甲醇)、ODS(甲醇-水 30∶70～60∶40,V/V)、Toyopearl HW-40F(甲醇)純化,得化合物7(7.2 mg)、12(12.3 mg)。Fr.D4經(jīng)正相硅膠柱層析(硅膠:300～400目。洗脫劑:二氯甲烷-甲醇 10∶1～2∶1,V/V)得9個(gè)組分Fr.D4.1～Fr.D4.9,其中Fr.D4.5依次經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)、半制備HPLC (22%甲醇-水溶液)洗脫,得化合物14(3.8 mg)、15(4.1 mg)。

Fr.F經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)得到Fr.F1～Fr.F6,其中Fr.F2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)洗脫得Fr.F2.1～Fr.F2.2。Fr.F2.2經(jīng)反復(fù)正相硅膠(硅膠:300～400目。洗脫劑:二氯甲烷-甲醇 10∶1～2∶1,V/V)、Sephadex LH-20(甲醇)、Toyopearl HW-40F(甲醇)柱層析純化,得化合物9(19.0 mg)、10(95.9 mg)、13(5.5 mg)。

2.2 抗炎活性測(cè)試

安全濃度考察:采用CCK-8法考察各化合物的安全濃度,分別給予不同濃度的化合物溶液作用于RAW 264.7細(xì)胞,24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力,通過(guò)細(xì)胞存活率確定化合物的安全濃度范圍。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW 264.7細(xì)胞(調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升3×105個(gè))接種于96孔板中,每孔100 μL,實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組(陽(yáng)性藥組)和藥物組(待測(cè)化合物),每組設(shè)置3個(gè)平行孔,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞同時(shí)用0.25 μg·mL-1LPS和不同濃度梯度的待測(cè)化合物刺激24 h后,收集上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)方法測(cè)定NO的含量,計(jì)算NO釋放抑制率。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無(wú)定型粉末,易溶于氯仿、吡啶、DMSO,難溶于甲醇、丙酮。HR-ESI-MSm/z: 899.803 5 [M+Na]+(C56H108O6Na,理論值:899.803 8),結(jié)合1H-NMR和13C-NMR推測(cè)分子式為C56H108O6。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 譜顯示108個(gè)質(zhì)子信號(hào),從低場(chǎng)至高場(chǎng)區(qū)依次為1個(gè)次甲基質(zhì)子信號(hào) [δ: 5.24 (1H, m, H-2)]、49個(gè)亞甲基質(zhì)子信號(hào) [δ: 4.27 (2H, dd,J=12.0, 4.8 Hz, H-1a, 3a), 4.12 (2H, dd,J=12.0, 6.0 Hz, H-1b, 3b), 2.29 (6H, m, H-2′, 2″, 2?), 1.58 (6H, m, H-3′, 3″, 3?), 1.24 (82H, overlap, H-4′-17′, 4′′-16″, 4?-17?)]、3個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào) [δ: 0.85 (9H, t,J=6.8 Hz, H-18′, 17″, 18?) ]。由13C-NMR和HMQC譜推測(cè),該結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)羰基碳信號(hào) [δ: 173.3 (C-1′, 1?) , 172.9 (C-1″)]、2個(gè)連氧亞甲基碳信號(hào) [δ: 62.1 (C-1, 3)]、1個(gè)連氧次甲基碳信號(hào) [δ: 68.8 (C-2)]、3個(gè)甲基碳信號(hào) [δ: 14.1 (C-18′, 17″, 18?)],余下碳信號(hào)為亞甲基信號(hào)。該化合物的1H-NMR 和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Abdulmumeen et al.,2017)報(bào)道的化合物1,2,3-propanetriyl tris(hexadecanoate)相似,區(qū)別僅在于化合物1高場(chǎng)區(qū)多5個(gè)-CH2-信號(hào)。綜合HR-ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)分析,推測(cè)化合物為2-(heptadecanoyloxy)propane-1,3-diyl distearate。文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)2-(heptadecanoyloxy)propane-1,3-diyl distearate的核磁數(shù)據(jù),通過(guò)HMQC和HMBC進(jìn)一步確證該化合物的結(jié)構(gòu),具體見(jiàn)表1和圖2。HMBC譜顯示,H-1b/C-1′、H-3b/C-1?、H-1a/C-1′、H-3a/C-1?、H-1b/C-2和H-3b/C-2可確證并歸屬甘油三脂基本骨架。H-2′、2″、2?分別與C-1′、1″、1?相關(guān),H-3′、3″、3?分別與C-1′、1″、1?和C-4′、4″、4?相關(guān),H-18′、17″、18?分別與C-17′、16″、17?和C-16′、15″、16?相關(guān)(圖3),可確證烷烴片段的連接并歸屬其核磁數(shù)據(jù)。

化合物2透明油狀物。HR-ESI-MSm/z: 327.217 7 [M-H]-(C18H31O5,理論值:327.217 7),分子式為C18H32O5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 5.57 (2H, m, H-10, 11), 5.41(1H, m, H-16), 5.35 (1H, m, H-15), 3.89 (1H, dd,J=10.8, 6.0 Hz, H-9), 3.79 (1H, t,J=4.8 Hz, H-13), 3.27 (1H, m, H-12), 2.19 (1H, m, H-14a), 1.97 (2H, m, H-17), 1.92 (1H, m, H-14b), 1.88 (2H, m, H-2), 1.39 (2H, m, H-4), 1.32 (2H, m, H-8), 1.25 (2H, m, H-3), 1.21 (6H, m, H-5, 6, 7), 0.90 (3H, t,J=7.8 Hz, H-18);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 177.1 (C-1), 134.5 (C-10), 131.8 (C-15), 129.8 (C-11), 126.7 (C-16), 74.0 (C-12), 73.7 (C-13), 70.7 (C-9), 38.0 (C-2), 37.4 (C-8), 30.2 (C-14), 29.2 (C-5), 29.1 (C-6, 7), 26.3 (C-4), 24.9 (C-3), 20.2 (C-17), 14.2 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李帥等,2003)報(bào)道基本一致,故鑒定為9,12,13-三羥基-10,15-十八碳二烯酸。

表 1 化合物1的1H-NMR (400 MHz, CDCl3)和13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) data of Compound 1

化合物3淡黃色粉末。HR-ESI-MSm/z: 341.233 1 [M-H]-(C19H33O5,理論值:341.232 3), 分子式為C19H34O5。1H-NMR (400MHz, CD3OD)δ: 5.69 (2H, m, H-10, 11), 5.45 (2H, m, H-15, 16), 4.06 (1H, m, H-9), 3.95 (1H, m, H-12), 3.64 (3H, s, -OCH3), 3.45 (1H, m, H-13), 2.31 (3H, m, H-2, 14a), 2.08 (3H, m, H-14b, 17), 1.59 (2H, m, H-3), 1.49 (2H, m, H-8), 1.32 (8H, s, H-4, 5, 6, 7), 0.96 (3H, t,J= 7.6 Hz, H-18);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 176.0 (C-1), 136.5 (C-10), 134.3 (C-15), 131.1 (C-11), 126.4 (C-16), 75.9 (C-12), 75.8 (C-13), 73.0 (C-9), 52.0 (-OCH3), 38.3 (C-8), 34.8 (C-2), 31.5 (C-14), 30.6 (C-7), 30.4 (C-6), 30.2 (C-5), 26.5 (C-4), 26.0 (C-3), 21.7 (C-17), 14.6 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(楊炳友等,2017)報(bào)道基本一致,故鑒定為9,12,13-三羥基-10,15-十八碳二烯酸甲酯。

圖 2 化合物 1-15 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Chemical structures of compounds 1-15

圖 3 化合物1主要的HMBC相關(guān)Fig. 3 Key HMBC correlations of Compound 1

化合物4黃色油狀物。HR-ESI-MSm/z: 395.331 6 [M+H]+(C28H43O,理論值:395.330 8),分子式為C28H42O。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.45 (2H, d,J=8.8 Hz, H-6, 6′), 7.45 (2H, d,J=2.4 Hz, H-3, 3′), 7.21 (2H, dd,J=8.8, 2.4 Hz, H-5, 5′), 1.33 (18H, s, H-12-14, H-12′-14′), 1.30 (18H, s, H-8-10, H-8′-10′);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 149.1 (C-2, 2′), 148.8 (C-1, 1′), 139.9 (C-4), 139.8 (C-4′), 125.9 (C-3, 3′), 125.2 (C-5, 5′), 120.0 (C-6, 6′), 35.9 (C-7, 7′), 35.5 (C-11, 11′), 31.8 (C-8-10, 8′-10′), 30.8 (C-12-14, 12′-14′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Cao et al., 2020)報(bào)道基本一致,故鑒定為2,2′-氧代雙(1,4-二叔丁苯)。

化合物5黃色粉末。HR-ESI-MSm/z: 269.045 5 [M-H]-(C15H9O5,理論值:269.045 6),分子式為C15H10O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.03 (1H, s, 1-OH), 11.96 (1H, s, 8-OH), 11.27 (1H, s, 6-OH), 7.46 (1H, s, H-4), 7.13 (1H, s, H-2), 7.10 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-5), 6.57 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-7), 2.40 (3H, s, -CH3);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 189.6 (C-9), 181.2 (C-10), 165.5 (C-6), 164.4 (C-8), 161.4 (C-1), 148.2 (C-3), 135.0 (C-10a), 132.7 (C-4a), 124.1 (C-2), 120.4 (C-4), 113.3 (C-9a), 108.9 (C-8a), 108.7 (C-5), 107.9 (C-7), 21.5 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kharlamova, 2007)報(bào)道基本一致,故鑒定為大黃素。

化合物6黃色粉末。HR-ESI-MSm/z: 253.050 6 [M-H]-(C15H9O4,理論值:253.049 5),分子式為C15H10O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.79 (1H, dd,J=8.4, 7.6 Hz, H-6), 7.69 (1H, dd,J=7.6, 1.2 Hz, H-5), 7.53 (1H, d,J=1.2 Hz, H-4), 7.37 (1H, dd,J=8.4, 1.2 Hz, H-7), 7.20 (1H, d,J=1.2 Hz, H-2);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 191.6 (C-9), 181.4 (C-10), 161.5 (C-8), 161.3 (C-1), 149.1 (C-3), 137.3 (C-6), 133.3 (C-10a), 133.0 (C-4a), 124.4 (C-2), 124.0 (C-7), 120.5 (C-4), 119.3 (C-5), 115.8 (C-8a), 113.7 (C-9a), 21.6 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Zhou et al., 2006)報(bào)道基本一致,故鑒定為大黃酚。

化合物7白色粉末。HR-ESI-MSm/z: 393.187 9 [M+Na]+(C19H30O7Na,理論值:393.188 4),分子式為C19H30O7。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 5.87 (1H, s, H-4), 5.77 (1H, dd,J=15.2, 6.4 Hz, H-8), 5.63 (1H, dd,J=15.2, 9.2 Hz, H-7), 4.38 (1H, m, H-9), 3.81 (1H, dd,J=11.6, 2.0 Hz, H-6′α), 3.65 (1H, dd,J=11.6, 5.2 Hz, H-6′β), 2.67 (1H, d,J=9.2, H-6), 2.42 (1H, d,J=16.8, H-2α), 2.04 (1H, d,J=16.8, H-2β), 1.93 (3H, d,J=0.8, H-13), 1.28 (3H, d,J=6.4, H-10), 1.00 (3H, s, H-11), 1.02 (3H, s, H-12);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 202.0 (C-3), 165.8 (C-5), 138.2 (C-8), 128.8 (C-7), 126.1 (C-4), 102.4 (C-1′), 78.1 (C-5′), 78.0 (C-3′), 77.0 (C-9), 75.2 (C-2′), 71.5 (C-4′), 62.7 (C-6′), 56.7 (C-6), 37.1 (C-1), 28.0 (C-12), 27.6 (C-16), 23.8 (C-13), 21.0 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(彭冰等,2014)報(bào)道基本一致,故鑒定為(6R,9R)-3-酮-α-紫羅蘭醇-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物8白色粉末。HR-ESI-MSm/z: 503.260 7 [M+Na]+(C26H40O8Na,理論值:503.261 5),分子式為C26H40O8。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δ: 7.15 (1H, t,J=1.6 Hz, H-14), 4.90 (1H, s, H-17b), 4.83 (1H, d,J=7.6 Hz, H-1′), 4.72 (1H, s, H-17a), 4.33 (1H, d,J=9.6 Hz, H-19b), 3.49 (1H, d,J=9.6 Hz, H-19a), 1.19 (3H, s, 18-CH3), 0.64 (3H, s, 20-CH3);13C-NMR (100 MHz, C5D5N)δ: 174.6 (C-16), 148.2 (C-8), 145.4 (C-14), 134.2 (C-13), 107.0 (C-17), 105.5 (C-1′), 78.8 (C-3′), 78.4 (C-5′), 75.4 (C-2′), 72.6 (C-19), 71.8 (C-4′), 70.6 (C-15), 62.9 (C-6′), 56.7 (C-9), 56.2 (C-5), 39.8 (C-4), 39.1 (C-1), 38.8 (C-7), 38.7 (C-10), 36.4 (C-3), 28.2 (C-18), 25.0 (C-12), 24.7 (C-6), 22.1 (C-11), 19.4 (C-12), 15.5 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Sun et al., 2019)報(bào)道基本一致,故鑒定為新穿心蓮內(nèi)酯。

化合物9白色粉末。HR-ESI-MSm/z: 217.068 0 [M+Na]+(C7H14O6Na,理論值:217.068 3),分子式為C7H14O6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 4.02 (1H, d,J=4.0 Hz, H-3), 3.88 (1H, dd,J=6.4, 4.4 Hz, H-4), 3.83 (1H, m, H-5), 3.73 (1H, t,J=3.2 Hz, H-1a), 3.69 (1H, s, H-1b), 3.62 (2H, m, H-6), 3.30 (3H, s, -OCH3);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 109.2 (C-2), 84.6 (C-5), 82.5 (C-3), 78.9 (C-4), 62.8 (C-6), 60.5 (C-1), 48.9 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(尹宏權(quán)等,2006)報(bào)道基本一致,故鑒定為甲基-α-D-呋喃果糖苷。

化合物10白色固體。HR-ESI-MSm/z: 343.121 6 [M+H]+(C12H23O11,理論值:343.123 5),分子式為C12H22O11。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 4.87 (1H, overlap, H-1′), 4.13 (2H, overlap, H-4, 5), 4.01 (1H, overlap, H-3), 3.90 (2H, overlap, H-2′, 3′), 3.78 (2H, overlap, H-6b, 6′b), 3.74 (2H, overlap, H-4′, 5′), 3.63 (1H, overlap, H-1), 3.45 (2H, overlap, H-6a, 6′a);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 102.8 (C-2), 99.0 (C-1′), 82.5 (C-5), 77.1 (C-4), 76.2 (C-3), 71.3 (C-2′), 70.8 (C-5′), 69.0 (C-3′), 65.5 (C-4′), 64.2 (C-1, 6′), 63.8 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Ye et al., 2020)報(bào)道基本一致,故鑒定為1-O-β-D-吡喃果糖-α-D-吡喃阿洛糖苷。

化合物11白色粉末。HR-ESI-MSm/z: 163.039 1 [M-H]-(C9H7O3,理論值:163.040 1),分子式為C9H8O3。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.49 (2H, d,J=8.4 Hz, H-3, 5), 7.47 (1H, d,J=16.2 Hz, H-7), 6.79 (2H, d,J=8.4 Hz, H-2, 6), 6.29 (1H, d,J=16.2 Hz, H-8);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 168.4 (C-9), 159.6 (C-4), 143.7 (C-7), 132.0 (C-6), 130.0 (C-2), 125.4 (C-1), 115.8 (C-3, 5), 114.9 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(屈珅玥等,2020)報(bào)道基本一致,故鑒定為對(duì)香豆酸。

化合物12白色粉末。HR-ESI-MSm/z: 367.135 7 [M+Na]+(C16H24O8Na,理論值:367.136 3),分子式為C16H24O8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 6.15 (1H, d,J=2.4 Hz, H-5), 6.13 (1H, d,J=2.4 Hz, H-3), 4.43 (1H, d,J=7.8 Hz, H-1′), 3.83 (1H, dd,J=12.0, 2.4 Hz, H-6′a), 3.78 (1H, dd,J=12.0, 4.2 Hz, H-6′b), 3.49 (2H, overlap, H-7, 4′), 3.47 (1H, overlap, H-2′), 3.42 (1H, d,J=9.0 Hz, H-3′), 3.24 (1H, m, H-5′), 1.58 (1H, m, H-8a), 1.50 (1H, m, H-8b), 1.08 (3H, d,J=7.2 Hz, H-10), 0.87 (3H, t,J=7.2 Hz, H-9);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 156.1 (C-4), 151.5 (C-6), 143.9 (C-2), 138.2 (C-1), 108.2 (C-1′), 104.7 (C-3), 102.1 (C-5), 78.4 (C-5′), 78.2 (C-3′), 75.6 (C-2′), 71.0 (C-4′), 62.2 (C-6′), 33.7 (C-7), 31.5 (C-8), 22.2 (C-10), 12.6 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Wubshet et al., 2015)報(bào)道基本一致,故鑒定為cesternosides A。

化合物13白色粉末。HR-ESI-MSm/z: 355.099 0 [M+Na]+(C14H20O9Na,理論值:355.099 9),分子式為C14H20O9。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.72 (1H, s, 4-OH), 6.38 (2H, s, H-2, 6), 4.67 (1H, d,J=7.2 Hz, H-1′), 3.71 (6H, s, 2×-OCH3);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 150.2 (C-4), 148.1 (C-2, 6), 130.5 (C-1), 101.6 (C-1′), 95.3 (C-3, 5), 77.0 (C-5′), 76.7 (C-3′), 73.2 (C-2′), 70.1 (C-4′), 60.8 (C-6′), 55.8 (2×-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Wu et al., 2013)報(bào)道基本一致,故鑒定為koaburaside。

化合物14黃色粉末。HR-ESI-MSm/z: 471.089 0 [M+Na]+(C21H20O11Na,理論值:471.089 8),分子式為C21H20O11。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 13.18 (1H, s, 5-OH), 7.53 (1H, d,J=8.4 Hz, H-6′), 7.47 (1H, s, H-2′), 6.85 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.63 (1H, s, H-3), 6.25 (1H, s, H-6), 4.68 (1H, d,J=10.2 Hz, H-1″);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 182.0 (C-4), 164.0 (C-2), 162.2 (C-7), 160.4 (C-5), 156.0 (C-9), 149.9 (C-4′), 145.9 (C-3′), 121.8 (C-1′), 119.4 (C-6′), 115.7 (C-5′), 114.0 (C-2′), 104.6 (C-8, 10), 102.4 (C-3), 98.2 (C-6), 82.0 (C-5″), 78.8 (C-3″), 73.4 (C-1″), 70.8 (C-2″), 70.7 (C-4″), 61.7 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(吳洪新等,2009)報(bào)道基本一致,故鑒定為葒草素。

化合物15黃色粉末。HR-ESI-MSm/z: 471.089 4 [M+Na]+(C21H20O11Na,理論值:471.089 8),分子式為C21H20O11。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 13.57 (1H, s, 5-OH), 7.42 (1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, H-6′), 7.40 (1H, d,J=2.4 Hz, H-2′), 6.89 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.68 (1H, s, H-3), 6.48 (1H, s, H-8), 4.58 (1H, d,J=9.6 Hz, H-1″);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 181.9 (C-4), 163.7 (C-2), 163.3 (C-7), 160.7 (C-5), 156.2 (C-9), 149.7 (C-4′), 145.8 (C-3′), 121.4 (C-1′), 119.0 (C-6′), 116.1 (C-5′), 113.3 (C-2′), 108.9 (C-6), 103.4 (C-10), 102.8 (C-3), 93.5 (C-8), 81.6 (C-5″), 79.0 (C-3″), 73.0 (C-1″), 70.6 (C-2″), 70.2 (C-4″), 61.5 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(吳洪新等,2009)報(bào)道基本一致,故鑒定為異葒草素。

3.2 抗炎活性測(cè)試結(jié)果

CCK-8細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果顯示,化合物1-4、6-15在25 μmol·L-1時(shí),以及化合物5在12.5 μmol·L-1時(shí)無(wú)明顯毒性,故選擇相應(yīng)濃度下進(jìn)行NO抑制活性實(shí)驗(yàn)。由表2可知,化合物1-3(脂肪酸及其衍生物)、化合物8(二萜類(lèi))、化合物11-15(酚類(lèi))顯示出一定的NO釋放抑制活性,表明這些成分具有一定的抗炎活性,可能是蛇含委陵菜抗炎活性物質(zhì)。

4 討論與結(jié)論

蛇含委陵菜是貴州苗族、侗族等少數(shù)民族習(xí)用藥材,主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、肺炎等疾病的治療。目前,蛇含委陵菜的化學(xué)成分及其抗炎活性研究較少。本研究從蛇含委陵菜60%乙醇提取物中分離得到15個(gè)化合物,均為首次從委陵菜屬植物中分離得到,包括脂肪酸衍生物(1-3)、二苯醚類(lèi)化合物(4)、蒽醌類(lèi)化合物(5、6)、萜類(lèi)化合物(7、8)、苯丙素類(lèi)化合物(11)、酚苷類(lèi)化合物(12、13)、黃酮苷類(lèi)化合物(14、15)及其他(9、10)。

表 2 化合物1-15的NO釋放抑制率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)Table 2 NO production inhibition rates of

脂多糖可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活,從而促進(jìn)炎癥因子的釋放和NO的合成,而NO又與AMPK/ NF-κB、TLR/ NF-κB等通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)(安莉和孫丕忠,2020)。因此,本研究采用LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)體外炎癥模型,通過(guò)測(cè)定NO釋放抑制率來(lái)評(píng)價(jià)化合物的抗炎活性?？寡捉Y(jié)果表明,化合物1-3(脂肪酸及其衍生物)、化合物8(二萜類(lèi))、化合物11-15(酚性成分)具有一定的抗炎活性,其中新穿心蓮內(nèi)酯(8)在 25 μmol·L-1濃度下抑制率為72.5%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,十八碳烷酸及其衍生物大多具有較好的抗炎活性(張俊卿等,2021),化合物1-3可能通過(guò)參與NF-κB激活的調(diào)節(jié)、影響膜磷脂組成和脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域功能的改變來(lái)產(chǎn)生抗炎作用,因此反相調(diào)節(jié)NO釋放(Allijn et al., 2019)。新穿心蓮內(nèi)酯(8)對(duì)NO釋放具有顯著的抑制作用, 其可能通過(guò)清除NO自由基,阻斷信號(hào)傳遞而產(chǎn)生抗炎作用(劉峻和王崢濤,2005),因此提示該化合物具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用且有作為抗炎先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的潛在價(jià)值。葒草素(14)和異葒草素(15)能夠有效減少 LPS 誘導(dǎo)的炎性因子釋放(NO、TNF-α 以及 IL-1β),抑制MAPK 家族激酶及 NF-κB等上游信號(hào)通路相關(guān)蛋白活化,降低促炎因子的表達(dá),從而抑制炎癥反應(yīng)(羅成等,2016;萬(wàn)思琦等,2018)。由此可見(jiàn),各類(lèi)物質(zhì)的抗炎作用機(jī)制不盡相同,可能通過(guò)多成分協(xié)同發(fā)揮抗炎作用。

本研究進(jìn)一步豐富了蛇含委陵菜的植物化學(xué)信息及化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)型,明確了脂肪酸衍生物、二萜及酚性成分是其潛在的抗炎物質(zhì),為深入探索蛇含委陵菜的化學(xué)成分及抗炎機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為該藥用植物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。