牛尾菜HPLC指紋圖譜及抗氧化活性譜效關(guān)系研究

譚小青, 胡筱希, 唐紅珍, 梁臣艷, 覃喜軍, 劉振杰*

( 1. 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室, 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院, 南寧 530022; 2. 廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心, 廣西中醫(yī)藥大學(xué), 南寧 530299 )

牛尾菜(Smilaxriparia)為百合科(Liliaceae Juss.)植物牛尾菜的根莖(唐進(jìn)等,1978),俗稱龍須菜,是常用民間草藥(趙琦,2017);在中國大部分地區(qū)都有分布,是常用壯藥,是廣西特色中成藥中華跌打丸主要成分之一(國家藥典委員會,2015),有通絡(luò)止痛、活血化瘀之功效,用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、腰肌勞損等(Sun et al.,2012)。牛尾菜中具有黃酮類、苷類、酚類以及其他化學(xué)物質(zhì),具有鎮(zhèn)痛、祛痰、抗氧化等藥理作用(陳人萍等,2014;Sun et al.,2012)。牛尾菜作為《中國藥典》收載的中成藥中華跌打丸的“倒掛”藥材,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未被《中國藥典》2020年版收載。雖然《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載了牛尾菜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),但是其標(biāo)準(zhǔn)仍然局限于外觀鑒別和理化鑒定,并未對其進(jìn)行特征指紋圖譜表征和活性成分的含量測定,因此,有必要利用其中的藥效確切活性成分建立質(zhì)量控制方法,進(jìn)行其關(guān)聯(lián)藥效活性的物質(zhì)篩選是研究的首要問題。

中藥通過多種成分的協(xié)同作用來發(fā)揮療效,而利用中藥譜效關(guān)系研究能夠篩選活性成分。譜效關(guān)系結(jié)合指紋圖譜的基礎(chǔ)及藥效學(xué)研究的內(nèi)容,通過指紋圖譜和藥效之間的關(guān)系,篩選出具有中藥藥效的活性成分(李戎等,2002)。該方法簡單且高效,體現(xiàn)了藥材提取物中主要成分與藥理作用之間的關(guān)系大小,為中藥主要藥效物質(zhì)的研究提供依據(jù)。目前研究發(fā)現(xiàn),抗氧化是預(yù)防衰老的重要步驟,因為自由基或氧化劑會將細(xì)胞和組織分解,影響代謝功能,從而引起多種疾病。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),牛尾菜中的多酚類等成分具有抗氧化活性(陳雯等,2012;Li et al.,2006)。本研究以牛尾菜的廣西、廣東和遼寧等不同產(chǎn)區(qū)為主要研究區(qū)域,依托廣西中藥藥材資源的道地產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢,采用HPLC指紋圖譜和清除ABTS自由基的作用的抗氧化測定方法,通過對不同批次的牛尾菜的指紋圖譜進(jìn)行相似度評價、色譜峰面積聚類分析、抗氧化活性測定、偏最小二乘回歸分析法,擬探討以下問題:(1)不同產(chǎn)地的牛尾菜的化學(xué)表征有何異同;(2)牛尾菜藥材的道地產(chǎn)區(qū)在哪里;(3)牛尾菜抗氧化活性的藥效物質(zhì)是什么。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Waters 2489高效液相色譜儀(美國Waters公司);Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

過硫酸鉀、甲醇為分析純,乙腈為色譜純;ABTS(2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽,2021年購自美國麥克林生化科技股份有限公司);齊墩果酸(成都普菲德生物科技有限公司,批號:18051406)、熊果酸(成都普菲德生物科技有限公司,批號:18081601)。

牛尾菜藥材(編號:S1～S13)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)唐紅珍教授鑒定為百合科菝葜屬(SmilaxL.)植物牛尾菜的根莖(譚小青等,2021a)。藥材樣品來源信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備 取牛尾菜藥材粗粉1 g,放入具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇溶液20 mL,超聲30 min,放冷,補足減少的質(zhì)量,使用0.22 μm 有機濾膜濾過,即得。稱取適量齊墩果酸、熊果酸,加80%甲醇制成單一對照品儲備液,分別精密吸取齊墩果酸儲備液0～5 mL與熊果酸儲備液0～5 mL,加入80%甲醇稀釋,將其定容至5 mL容量瓶,使用0.22 μm 有機濾膜濾過,即為混合對照品溶液( 齊墩果酸0.038 g·L-1,熊果酸 0. 047 g·L-1)。

表 1 牛尾菜樣品來源信息Table 1 Information of Smilax riparia

1.2.2 HPLC色譜條件 WatersCORTECS?C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm) ,流速為0.5 mL·min-1,柱溫20 ℃,流動相選擇0.5%磷酸水(A)-乙腈(B)水溶液,梯度洗脫 ( 0～5 min,95% A;5～40 min,95%～5% A;40～45 min,5%～5%A) ,檢測波長205 nm,進(jìn)樣量 2 μL。

1.2.3 方法學(xué)考察 精密度試驗:取“1.2.1”項下的供試品適量,按“1.2.2”的色譜條件,進(jìn)樣測定6次,計算相對保留時間、相對峰面積的RSD值,實驗表明,各色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于2.3%,表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗:取牛尾菜S4的樣品適量,共6份,按“1.2.1”制備樣品溶液進(jìn)樣測定,計算相對保留時間、相對峰面積的RSD值,實驗表明,各色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于2.73%,表明方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗:取牛尾菜藥材的供試品溶液(S4),分別放置0、2、4、8、12、24 h后,按“1.2.2” 的色譜條件進(jìn)樣分析,計算相對保留時間、相對峰面積的RSD值,實驗表明,各色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于1.31%,表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.4 指紋圖譜測定 將制備好的樣品溶液和對照品混合溶液,按“1.2.2”HPLC色譜條件測定,記錄結(jié)果,將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”,采用平均數(shù)法,設(shè)置時間窗寬為0.1,經(jīng)過多點矯正后,進(jìn)行全峰匹配,生成對照圖譜,確定13批牛尾菜樣品指紋圖譜的主要共有峰,并進(jìn)行相似度評價。

1.2.5 牛尾菜指紋圖譜聚類分析 將13批牛尾菜樣品共有峰的峰面積導(dǎo)入 SPSS 22.0軟件,使用 Ward方法和平均歐方距離進(jìn)行聚類。

1.2.6 抗氧化作用考察 精密稱取牛尾菜粉末0.2 g于錐形瓶內(nèi),加入80%甲醇溶液100 mL,超聲30 min,放冷,補足減少重量,經(jīng)0.22 um有機濾膜濾過,蒸干,用50%乙醇溶解,將其配成質(zhì)量濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg·mL-1的樣品溶液。稱取 ABTS 38.41 mg,加水溶解后,轉(zhuǎn)移并定容至 10 mL 量瓶中,將其配制成濃度為 7 mmol·L-1的溶液,加入濃度為2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液,混合均勻后,放置暗處12～24 h,即得 ABTS+自由基溶液。在96 孔板中,分別加入2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg·mL-1的樣品溶液20 μL,分別加入ABTS+工作液180 μL,以無水乙醇為空白對照,在室溫下放置約6 min,在734 nm 波長下測定吸光度,重復(fù)3 次(譚小青等,2021b)。ABTS清除率按公式計算= [1-(Ai-Aj)/A0]×100%,A0空白溶液,即無水乙醇加ABTS的A值;Ai為樣品溶液和ABTS反應(yīng)后的A值;Aj為空白對照的A值。應(yīng)用清除ABTS自由基的抗氧化測定方法對13個不同批次來源的牛尾菜樣品進(jìn)行了測定,并計算了各樣品的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立

利用HPLC構(gòu)建了13個不同產(chǎn)地來源的牛尾菜藥材的14個主要共有峰的指紋圖譜,牛尾菜樣品HPLC疊加圖譜見圖1,樣品對照圖譜見圖2,另外,通過與對照品比對,指認(rèn)了其中2個色譜峰,其中9號為齊墩果酸,10號為熊果酸,混合對照品的HPLC圖見圖3。牛尾菜 HPLC 指紋圖譜14個共有峰的峰面積結(jié)果見表2。由表2可知, 1號峰和2號峰的峰面積最大, 7號峰的峰面積較大,3、5、14號峰的峰面積較小,其他色譜峰的峰面積大小居中。因此,對指紋圖譜的相似度評價影響較大的是1、2、7號峰,而6、9、10、11、12、13號峰對指紋圖譜的相似度計算結(jié)果的影響相對較小。

圖 1 13批牛尾菜樣品HPLC疊加圖譜Fig. 1 HPLC superimposed fingerprint of 13 batches of Smilax riparia

在牛尾菜經(jīng) HPLC 檢測得到的色譜圖中,13批藥材的相似度在0.965～1.000之間,表明各批次牛尾菜藥材質(zhì)量基本穩(wěn)定,結(jié)果見表3。由表3可知,不同批次S1、S2、S3、 S6、S7、S10和S12的牛尾菜樣品的相似度在0.963～1.000之間;而其他批次S4、S5、S8、S9、S11和S13的牛尾菜樣品的相似度在0.943～0.960之間。指紋圖譜相似度之間的差別雖然能夠一定程度上反映出不同產(chǎn)量來源樣品之間化學(xué)表征的接近程度,但還是不能清晰直觀地反映出牛尾菜樣品之間的差異,因此,還需要通過對色譜峰的峰面積進(jìn)行聚類分析來驗證。

圖 2 牛尾菜藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜Fig. 2 HPLC control fingerprint of Smilax riparia

9. 齊墩果酸; 10. 熊果酸。9. Oleanolic acid; 10. Ursolic acid.圖 3 混合對照品的HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatogram of substance control

2.2 牛尾菜指紋圖譜聚類分析結(jié)果

13批牛尾菜樣品14個共有峰的峰面積的聚類結(jié)果見圖 4,橫坐標(biāo)的數(shù)字代表距離,縱坐標(biāo)分別代表13批的牛尾菜樣品。由圖4可知,13批牛尾菜樣品可分為2類,第 I 類包括 S1(遼寧錦州)、S2(廣西百色)、S3(福建三明)、S5(貴州貴陽)、S6(廣西桂林)、S10(廣西南寧)、S12(廣西宜州);第Ⅱ類包括S4(廣東清遠(yuǎn))、S7(廣西賀州)、S8(江西贛州)、S9(廣東韶關(guān))、S11(廣西金秀)、S13(廣西玉林)。其中,第 I 類中S2(廣西百色)、S6(廣西桂林)、S12(廣西宜州)與S5(貴州貴陽)地理位置比較接近,屬于貴州省或貴州與廣西交接的桂東北地區(qū),而S4(廣東清遠(yuǎn))、S9(廣東韶關(guān))、S8(江西贛州)、S7(廣西賀州)、S11(廣西金秀)、S13(廣西玉林)都是屬于廣東省或者與廣東省交界的地區(qū)。因此,通過對指紋圖譜共有峰的峰面積的聚類分析可以將地理位置較為接近的牛尾菜藥材批次分開來。此外,通過將相似度計算的結(jié)果與聚類分析的結(jié)果進(jìn)行比較,二者具有一定的相似性,但是聚類分析能夠更清晰直觀地反映出牛尾菜樣品之間化學(xué)表征的差異。

圖 4 13批牛尾菜聚類分析樹狀圖Fig. 4 Dendrogram of cluster analysis of 13 batches of Smilax riparia

2.3 抗氧化作用考察結(jié)果

13個牛尾菜樣品的清除ABTS自由基的作用抑制率,以及各樣品IC50值的結(jié)果見表4。由表4可知,濃度為0.125～2.0 g·L-1的牛尾菜樣品均有一定的抗氧化作用,濃度為2.0 g·L-1的牛尾菜樣品的抗氧化作用清除率大于50%,其余濃度的清除率低于50%。根據(jù)各批次樣品IC50曲線推測得到其IC50值均在1.05～1.94之間且相差將近一倍,樣品的IC50值越小說明樣品的抗氧化活性越好。因此,S3(福建三明)的抗氧化活性最好,其次是S2(廣西百色)、S13(廣西玉林)、S12(廣西宜州);而S10(廣西南寧)、S11(廣西金秀)的抗氧化活性相對較弱,S1(遼寧錦州)和S7(廣西賀州)的更弱;其余批次的活性居中。按抗氧化作用強弱的結(jié)果進(jìn)行分類,得到的結(jié)果與指紋圖譜相似度結(jié)果及聚類分析結(jié)果不完全一致,說明指紋圖譜仍然不能區(qū)分藥材的藥效活性強弱。

表 2 牛尾菜 HPLC 指紋圖譜共有峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks in HPLC chromatograms for 13 batches of Smilax riparia

表 3 13個批次牛尾菜的相似度Table 3 Similarity of HPLC fingerprints of 13 batches of Smilax riparia

2.4 譜效關(guān)系分析

以指紋圖譜中共有峰面積為自變量,13批牛尾菜的抗氧化活性抑制率為因變量,進(jìn)行偏最小二乘回歸分析,得到二者的譜效關(guān)系系數(shù)值及其VIP值(劉振杰等,2020)。13批牛尾菜的指紋圖譜峰面積與其抗氧化活性的譜效關(guān)系分析見圖5,其VIP值見圖6。由圖5和圖6可知,指紋圖譜中的1、2、3、5、6、9、14號峰面積與抗氧化效果均呈正相關(guān),4、7、8、10、11、12號峰與抗氧化效果均呈負(fù)相關(guān);9、11、3、4、5號峰的VIP值均大于1,說明這些峰在抗氧化作用中效果比較顯著,進(jìn)一步提示齊墩果酸可能是牛尾菜有抗氧化作用的化學(xué)成分。

2.5 齊墩果酸體外抗氧化驗證試驗

精密稱定活性化合物單體(齊墩果酸)對照品,無水乙醇溶解后,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶,定容;取以上溶液,無水乙醇稀釋,將其配制成為1.0、0.5、0.25、0.125、0.065 mg·mL-1的質(zhì)量濃度的溶液。按“1.2.6”項下方法操作,計算齊墩果酸的清除率。實驗結(jié)果表明,齊墩果酸對ABTS自由基的清除率分別為26%、47%、70%、71%、81%,其IC50值為0.194,說明齊墩果酸有較強的清除ABTS自由基的能力,是牛尾菜抗氧化活性的主要成分之一。

3 討論與結(jié)論

本研究采用HPLC法,首次建立了不同產(chǎn)地的13批牛尾菜的指紋圖譜,確定14個主要共有色譜峰,指認(rèn)了齊墩果酸和熊果酸2個色譜峰,13批藥材具有較高相似度說明牛尾菜藥材質(zhì)量基本穩(wěn)定。另外,由于中藥指紋圖譜具有模糊性和整體性的特點(張慧等,2018),其與含量測定的要求不同,對色譜峰的分離度無高要求,不要求所有色譜峰完全分開,而本文中牛尾菜指紋圖譜的14個主要色譜峰的分離度介于0.79～7.02之間,除個別色譜峰分離度低于1.0外,其余色譜峰分離度基本大于1.0,齊墩果酸和熊果酸的參照峰的分離度也達(dá)到1.0以上,雖然指紋圖譜不需要將所有峰分開,但是后期對目標(biāo)成分進(jìn)行含量測定的時候,仍然需要對目標(biāo)色譜峰的條件方法進(jìn)行優(yōu)化,使分離度達(dá)到1.5及以上。

牛尾菜的聚類分析結(jié)果表明地理位置比較接近的牛尾菜樣品聚為一類,并且地域相近的牛尾菜的化學(xué)指紋圖譜相似度高,這說明地理條件、氣候因素等可能是影響牛尾菜化學(xué)表征差異形成的關(guān)鍵因素,而這也是中藥道地藥材形成的原因之一(徐浩等,2021)。廣西牛尾菜是廣西特色中成藥品種《中華跌打丸》的一味主要藥材(鐘海森等,2018),因此廣西牛尾菜可能具有一定的道地性。本實驗結(jié)果也在一定程度上印證了這一點,福建三明的牛尾菜的抗氧化活性最好,其次是廣西百色、廣西玉林、廣西宜州。

基于清除ABTS自由基的抗氧化測定方法的牛尾菜樣品測定表明,不同產(chǎn)地批次的牛尾菜的抗氧化活性存在較大的差別,說明牛尾菜藥材中可能存在關(guān)鍵的抗氧化活性物質(zhì),牛尾菜中含有大量的鞣質(zhì)類成分(趙琦,2017),這些成分常常作為工業(yè)生產(chǎn)原料使用,而牛尾菜中的皂苷類成分可能是其發(fā)揮藥效的主要成分,有相關(guān)研究結(jié)果報道了皂苷類成分良好的藥理活性(查正霞等,2020),如白頭翁藥材中的白頭翁皂苷B4目前已經(jīng)開發(fā)出國家獸藥新藥并投產(chǎn),人藥劑型也在研發(fā)中,而齊墩果酸作為三萜皂苷類化合物;黃勤英等(2019)研究表明其有抗氧化作用,本文體外抗氧化驗證試驗結(jié)果也說明齊墩果酸具有較強的抗氧化能力,與黃勤英等的研究結(jié)果相吻合。此外,本文通過譜效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)牛尾菜的指紋圖譜中1、2、3、5、6、9、14號峰都與其抗氧化能力呈正相關(guān),表明牛尾菜的抗氧化作用可能是多種成分共同作用的結(jié)果。目前,雖然有較多相關(guān)研究對牛尾菜根莖的化合物進(jìn)行了分離鑒定(龔韋凡等,2017),但是這些研究可能沒有針對性的分離出活性成分和指標(biāo)性成分,因而造成在質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中活性成分鑒定的困難,所以,將指紋圖譜中的其他高活性的化合成分進(jìn)行針對性的分離,并鑒定這些成分,進(jìn)一步探究其藥理活性,將是本課題今后的研究方向。

圖 5 牛尾菜偏最小二乘回歸分析譜效關(guān)系圖Fig. 5 PLSR regression analysis spectral efficiency diagram of Smilax riparia

表 4 抗氧化活性測定結(jié)果Table 4 Antioxidant effects of 14 batches of Smilax riparia