電針“后三里”結(jié)合四君子湯對奧沙利鉑致周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度及NGF的影響

熊 嘯,徐天舒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210008;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院,江蘇 南京 210008)

奧沙利鉑作為第三代鉑類抗腫瘤藥物,具有高效、低毒和廣譜的特點(diǎn),廣泛用于消化道腫瘤[1]。然而,奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變(OIPN)是臨床常見的不良反應(yīng),發(fā)病率高達(dá)85%[2],表現(xiàn)為不同程度的感覺異常、感覺弱化,會降低患者藥物耐受性,誘發(fā)患者焦慮抑郁等情緒,持續(xù)影響患者的生活質(zhì)量[3]。OIPN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要與奧沙利鉑蓄積于背根神經(jīng)節(jié)[4]、線粒體功能損傷導(dǎo)致氧化應(yīng)激[5]、離子通道活性改變、免疫過程和神經(jīng)炎癥[6]等因素有關(guān)。目前研究有神經(jīng)保護(hù)劑、離子通道靶向劑及抗氧化劑等[7]相關(guān)藥物,但均無支持性證據(jù);臨床針對出現(xiàn)疼痛的OIPN患者以止痛、抗抑郁的對癥治療為主,缺乏特異性,療效不甚理想。中醫(yī)不論是針灸、中藥均對OIPN具有較好的治療效果[8-10],常單獨(dú)作用或聯(lián)合西藥進(jìn)行治療。針灸治療包括電針、溫針灸及艾灸等,中藥常用治療藥物包括健脾益氣、補(bǔ)腎健脾等[11]藥物。然而,既往研究僅限于驗(yàn)證中醫(yī)治療的有效性,或者不同針灸治療手段、不同補(bǔ)益藥物的治療效果有所區(qū)別;關(guān)于針灸、中藥的療效對比以及針?biāo)幗Y(jié)合是否具有更好的治療作用目前尚不明確。因此,本研究建立OIPN大鼠模型,通過觀察電針“后三里”、中藥四君子湯灌胃及針?biāo)幗Y(jié)合3種治療方法對OIPN大鼠機(jī)械性縮足閾值、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度及其NGF蛋白表達(dá)和背根神經(jīng)節(jié)的影響,探討這3種療法的效應(yīng)差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康SPF級雄性SD大鼠25只,體質(zhì)量220～240 g,購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號:SCXK(蘇)2021-0001]。飼養(yǎng)于南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心,分籠喂養(yǎng),室溫(22±2)℃,濕度40%～60%,明暗12 h交替,墊料每日更換,自由飲食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、電針組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組,每組5只。實(shí)驗(yàn)過程中所有操作嚴(yán)格遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物及其制備

四君子湯(藥物組成:黨參、白術(shù)和茯苓各9 g,甘草6 g),由江蘇省鼓樓醫(yī)院中藥房提供,水煎后濃縮,含生藥量3 g/mL,4 ℃冰箱保存。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑 奧沙利鉑(13081211,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);異氟烷(9020000522,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);BCA 蛋白含量檢測試劑盒(FMS-W-002,福麥斯生物科技有限公司);RIPA裂解液(FMS-WB035,福麥斯生物科技有限公司);PVDF膜(IPVH00010);SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(P0012A,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);鼠抗神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)抗體(EP1320Y,英國Abcam);GAPDH一抗(5174T,CST);羊抗兔二抗(FMS-Rb01,福麥斯生物科技有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(WBKLS0500)。

1.3.2 儀器 針灸毫針(GB2024-94,蘇州醫(yī)療用品有限公司);Von-Frey纖維絲(DanMic Global, 美國LLC公司);小動物專用吸入麻醉機(jī)(VMR,美國MATRX公司);PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞AD Instruments公司);電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad);正置熒光顯微鏡、石蠟切片機(jī)(德國Leica)。

1.4 造模方法

除空白組外,其余組大鼠參照文獻(xiàn)[12]腹腔注射奧沙利鉑溶液制備OIPN大鼠模型。將 OXA(規(guī)格為:50 mg/瓶)在 5%葡萄糖溶液中充分溶解,終濃度為1 mg/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。大鼠予以2 mg/kg的劑量腹腔注射,注射時間點(diǎn)為第1、3、5、8、11與15天共6次注射,建立OIPN模型;造模成功的評價方法:大鼠Von Frey纖維絲機(jī)械性刺激痛覺超敏反應(yīng)陽性,單足縮足≥3次,則造模成功?？瞻捉M大鼠腹腔注射等量5%葡萄糖溶液。

1.5 干預(yù)方法

造模成功后開始進(jìn)行治療。

1.5.1 電針組 參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[13]的取穴定位,后三里位于大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處,雙側(cè)各有一穴位。大鼠固定方式固定,動物吸入式麻醉機(jī)以0.35 mL/min異氟烷麻醉大鼠,取雙側(cè)“后三里”常規(guī)消毒后將針灸針刺入,直刺3～5 mm,連接電針儀正負(fù)極,疏密波2 Hz/15 Hz ,強(qiáng)度2 mA刺激20 min。

1.5.2 中藥組 將制備好的四君子湯水煎劑溫?zé)?參照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[14]人鼠等效劑量換算,予1 mL/kg灌胃。

1.5.3 針?biāo)幗Y(jié)合組 先行電針“后三里”治療,30 min后再中藥灌胃,方法同上。

1.5.4 空白組和模型組 給予相同時間的固定,但不予其他處理。各組干預(yù)均1次/d,連續(xù)14 d。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 機(jī)械性縮足閾值 用不同標(biāo)號Von Frey纖維絲(折力梯度分別為4.0、6.0、8.0、10.0與15.0 g),折合成縮足閾值(分別為4.56、4.74、4.93、5.07與5.18),測定大鼠縮足閾值。將大鼠放置于金屬網(wǎng)篩上,蓋以透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)15 min,待其梳理探索活動基本消失、處于靜止時,用Von Frey纖維絲垂直刺激大鼠一側(cè)后肢足底中央,力度以纖維絲輕度彎曲為準(zhǔn),持續(xù)3～5 s,出現(xiàn)明顯抬腿、舔舐足底記為陽性,測定從4.0 g開始,當(dāng)該力度的刺激無法引起陽性反應(yīng)時,給予相鄰大一級力度的刺激;若出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激。每一標(biāo)號測量5次,5次中有3次或3次以上的陽性反應(yīng)視為有機(jī)械痛敏,每次間隔30 s。最大力度15.0 g,大于此值記為15.0 g。于干預(yù)第1、5、9與14天測定。

1.6.2 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度 最后1次干預(yù)后次日予0.35 mL/min異氟烷麻醉大鼠,沿股骨干后緣剪開皮膚、剝離筋膜肌肉,暴露大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng),用玻璃分針游離坐骨神經(jīng),在游離的坐骨神經(jīng)上放置第一刺激電極,踝部放置第二刺激電極,記錄電極位于骨間肌中,給予刺激[15];用LabChart 數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)記錄動作電位,隨后改變坐骨神經(jīng)上第一刺激電極位置,記錄兩次刺激電極間距離、動作電位的潛伏期,坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度=兩次刺激電極間距離/兩次動作電位潛伏期之差。

1.6.3 組織取材 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定結(jié)束后立即取材,分離右側(cè)坐骨神經(jīng)剪取2～4 cm,0.9%氯化鈉溶液沖洗,經(jīng)液氮浸泡后凍存于-80 ℃冰箱。過量異氟烷麻醉處死大鼠,取大鼠L1～6脊椎段,取出L4～6背根神經(jīng)節(jié),置于中性多聚甲醛中固定48 h后進(jìn)行脫水、石蠟包埋,5 μm切片。

1.6.4 HE染色觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)學(xué)改變 切片脫蠟、水化后蘇木素染色5 min,分化液分化,返藍(lán)液返藍(lán),伊紅染色1 min,漂洗后梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,在光學(xué)顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)的形態(tài)改變。

1.6.5 Western blot法檢測坐骨神經(jīng)NGF蛋白表達(dá) 取凍存的大鼠坐骨神經(jīng)40 mg,加入裂解液破碎勻漿、離心,取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,加入適量上樣緩沖液,沸水浴10 min。選擇12% PAGE膠電泳,并蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF)上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入稀釋的一抗(NGF 1∶1 000, GAPDH 1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加入稀釋的二抗,室溫孵育1 h,洗滌后滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照,讀取相關(guān)條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計算大鼠坐骨神經(jīng)NGF蛋白的相對表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。不同時間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組之間的機(jī)械痛閾值的比較采用重復(fù)測量多因素方差分析,其余統(tǒng)計數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

正常組大鼠精神良好、反應(yīng)靈敏和進(jìn)食正常,體質(zhì)量正常增長;模型組大鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)稀疏、活動和進(jìn)食逐漸減少,體質(zhì)量增長緩慢甚至體質(zhì)量減輕;各干預(yù)組大鼠精神可、反應(yīng)稍慢、毛發(fā)正常、飲食活動可和體質(zhì)量緩慢增長。

2.2 各組大鼠機(jī)械性縮足閾值比較

干預(yù)第1天,模型組、中藥組、電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠Von Frey纖維絲機(jī)械性縮足閾值均低于空白組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),模型組、中藥組、電針組及針?biāo)幗Y(jié)合組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;干預(yù)第5天、9天,中藥組、電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組縮足閾值具有升高趨勢;第14天,與空白組比較,模型組縮足閾值降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與模型組比較,電針組、針?biāo)幗Y(jié)合組機(jī)械性縮足閾值明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),中藥組機(jī)械縮足閾值低于針?biāo)幗Y(jié)合組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)第1、5、9與14 d機(jī)械性縮足閾值的比較

2.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較

干預(yù)結(jié)束后,與空白組比較,模型組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,中藥組、電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯提高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)組中針?biāo)幗Y(jié)合組提高更明顯,但3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)NGF表達(dá)比較

與空白組比較,模型組坐骨神經(jīng)中NGF表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,電針組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組坐骨神經(jīng)NGF水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各干預(yù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01。

2.5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)比較

空白組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核正常大小、位于細(xì)胞中央,無明顯空泡。模型組大鼠神經(jīng)元胞體縮小,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較大空泡,細(xì)胞核縮小、核仁固縮,多見偏心核、多核仁。與模型組比較,電針組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組神經(jīng)元細(xì)胞核形狀規(guī)則,少見偏心核、多核仁。見圖2。

注:A.空白組,B.模型組,C.電針組,D.中藥組,E.針?biāo)幗Y(jié)合組;箭頭所示為偏心核、多核仁。

3 討論

奧沙利鉑致周圍神經(jīng)病變(OIPN)是目前腫瘤化療中常見的不良反應(yīng),影響患者后續(xù)治療。根據(jù)其感覺異常、肢體麻木的臨床癥狀,可歸屬于中醫(yī)理論中“痹證”“血痹”范疇[16]。近年來多項(xiàng)研究顯示,無論針灸或者中藥均可有效緩解OIPN的神經(jīng)損傷,在治療奧沙利鉑致周圍神經(jīng)病變方面取得一定進(jìn)展[17-20],中藥可以通過多途徑減輕背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷、保護(hù)周圍神經(jīng)[21];針灸對OIPN具有顯著止痛效果[22-23],同時可以修復(fù)神經(jīng)損傷。足三里為足陽明胃經(jīng)下合穴,具有通經(jīng)活絡(luò)、補(bǔ)中益氣的作用,“治痿獨(dú)取陽明”,有多氣多血的特點(diǎn),是后天濡養(yǎng)肌肉的常用穴位,治療肢體痿痹具有良好的效用。Meta分析顯示足三里是治療CIPN選用頻率最高的穴位[24],電針“足三里”可以激活多種免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生[25],通過抑制瞬時電位受體(TRPs)中TRPV1[26]的表達(dá)、降低促炎細(xì)胞因子的水平[27]來抑制化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病理性疼痛。四君子湯為補(bǔ)脾益氣經(jīng)典方,具有抗腫瘤、提高免疫力和改善腫瘤惡病質(zhì)的作用[28-29],在防治OIPN方面同樣具有一定效果[30],可改善OIPN患者末梢神經(jīng)功能和血液循環(huán),提高機(jī)體免疫功能,預(yù)防化療藥物引起的神經(jīng)損傷[31]。因此,本研究采取電針“后三里”(即足三里)、中藥四君子湯和電針結(jié)合四君子湯3種不同的干預(yù)方法,觀察對OIPN大鼠周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)作用及其可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示,在干預(yù)第5、9天,電針組、中藥組及針?biāo)幗Y(jié)合組機(jī)械痛閾值與模型組差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),至第14天,電針組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組機(jī)械痛閾值均大于模型組,其中電針組、針?biāo)幗Y(jié)合組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。電針組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組均可提升OIPN大鼠的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、上調(diào)坐骨神經(jīng)NGF蛋白表達(dá),坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測可以客觀反映神經(jīng)傳導(dǎo)功能,定量評價神經(jīng)損傷程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,電針“后三里”、四君子湯灌胃及針?biāo)幗Y(jié)合均可顯著提升坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度并上調(diào)其NGF的表達(dá),同時電針、針?biāo)幗Y(jié)合還可以在第14天有效緩解OIPN大鼠的機(jī)械痛敏,電針、針?biāo)幗Y(jié)合具有較好的緩解疼痛作用,而中藥組緩解OIPN痛覺過敏的效果較差。針?biāo)幗Y(jié)合組治療效果高于電針組、中藥組,但目前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),這種情況考慮OIPN發(fā)病早期主要病因?yàn)椤八幎尽?病機(jī)以“瘀阻”為主,經(jīng)脈瘀阻,肢體疼痛,屬于“痹證”, 標(biāo)實(shí)而正氣尚未虛衰。而隨著奧沙利鉑模型周期的增加,第14天左右,OIPN大鼠出現(xiàn)活動減少、不欲飲食、反應(yīng)遲鈍和體重減輕等癥狀,此時病機(jī)以“本虛”為主,脾氣虧虛,氣血生化乏源,不能充養(yǎng)經(jīng)脈、肌肉,屬“痿證”。足三里、四君子湯均以健脾補(bǔ)氣為主,因此前期治療效果較弱,而后期脾氣虧虛,電針、中藥和針?biāo)幗Y(jié)合出現(xiàn)較好的干預(yù)作用,針?biāo)幗Y(jié)合組治療效果高于電針、中藥組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),可能與后期干預(yù)時間不夠有關(guān),干預(yù)效果尚未出現(xiàn)顯著性差異。后續(xù)可以通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OIPN大鼠不同時間的中醫(yī)證型區(qū)別,以及增加后期干預(yù)時間后針?biāo)幗Y(jié)合與單純電針或中藥的差異。

NGF在神經(jīng)損傷、修復(fù)和生長中起著重要作用,本研究結(jié)果顯示電針和中藥干預(yù)均可改善OIPN大鼠坐骨神經(jīng)NGF蛋白表達(dá)的下調(diào)。多項(xiàng)研究[32-34]證明奧沙利鉑化療后患者的血清NGF水平明顯下降,且下降程度和臨床神經(jīng)毒性的嚴(yán)重程度高度相關(guān)。在細(xì)胞模型中,給予高劑量的外源性NGF可以有效改善奧沙利鉑誘導(dǎo)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡[35]。背根神經(jīng)節(jié)作為奧沙利鉑的主要損傷靶點(diǎn),鉑蓄積于背根神經(jīng)節(jié)引起氧化應(yīng)激和凋亡通路激活,導(dǎo)致慢性神經(jīng)毒性。這種損傷在組織學(xué)形態(tài)上主要表現(xiàn)為神經(jīng)元直徑減小、大神經(jīng)元相對比例減少,細(xì)胞核邊界模糊、核仁形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)偏心核、多核仁[36],并推測這種神經(jīng)元萎縮的改變可能是神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[37]。本研究結(jié)果同樣證明,奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變會導(dǎo)致大鼠坐骨神經(jīng)NGF表達(dá)下調(diào),背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元萎縮、細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則。通過電針和四君子湯干預(yù)可以上調(diào)NGF表達(dá),改善背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元病理性改變、修復(fù)神經(jīng)元損傷,從而提升坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度,減輕外周神經(jīng)病變程度。

綜上,電針“后三里”、中藥四君子湯和針?biāo)幗Y(jié)合均可以有效改善OIPN大鼠周圍神經(jīng)病變程度,可能是通過上調(diào)坐骨神經(jīng)NGF蛋白的表達(dá)、修復(fù)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷,進(jìn)而提升坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度,起到保護(hù)周圍神經(jīng)的作用。電針、針?biāo)幗Y(jié)合具有顯著的緩解疼痛作用而中藥不具有,針?biāo)幗Y(jié)合治療未見明顯優(yōu)勢。