電針通過(guò)mTOR1自噬途徑調(diào)節(jié)改善胰島素抵抗認(rèn)知障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能

張 萌,楊鴻靜,吳 松,王靜芝

(湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 420061)

認(rèn)知功能障礙的范圍可以從嚴(yán)重?fù)p傷(癡呆)到不太嚴(yán)重的損傷(輕度認(rèn)知障礙MCI),或更微妙的功能障礙形式[1]。其標(biāo)志性神經(jīng)病理基礎(chǔ)是β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊和細(xì)胞內(nèi)tau神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)[2]。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物腦胰島素與海馬功能密切相關(guān)[3],且胰島素抵抗與Aβ斑塊的產(chǎn)生增加和tau蛋白的過(guò)度磷酸化有關(guān)[4-5]。由胰島素抵抗引起的認(rèn)知功能障礙人數(shù)在癡呆全球總?cè)藬?shù)中占比達(dá)到了8%至20%[6]。近年來(lái),電針改善胰島素抵抗大鼠的大腦記憶功能療效顯著[7-8]。目前針灸干預(yù)認(rèn)知障礙的靶點(diǎn)大致分為調(diào)節(jié)異常蛋白的水平(降低β淀粉樣蛋白沉積、抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化)、調(diào)節(jié)中樞膽堿能系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)元(調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、改善神經(jīng)元突觸可塑性及上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá))、調(diào)節(jié)能量代謝(調(diào)節(jié)糖代謝、改善線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu))和抑制炎性反應(yīng)與上調(diào)自噬活性水平等[9]。mTOR1作為自噬信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。本研究選用胰島素抵抗認(rèn)知障礙大鼠模型,從mTOR1途徑探討電針干預(yù)對(duì)于認(rèn)知障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購(gòu)入45只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠,8周齡,體質(zhì)量160～200 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[許可證號(hào):SCXK(鄂)2020-0018]。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(溫度18～25 ℃,濕度45%～55%),12 h/12 h晝夜循環(huán)光照,空氣流通,大鼠自由攝食、飲水,飼養(yǎng)籠具及飲水瓶定期消毒。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵照科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組,45只大鼠按1～45編號(hào),從隨機(jī)數(shù)字表中任一行任一列開始,讀取3位數(shù),并依次向后讀取對(duì)應(yīng)45只大鼠,隨后按大小排序隨機(jī)數(shù),前1～10位為正常組進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng),11～45位給予高脂飼料喂養(yǎng)8周,當(dāng)模型大鼠IRI與正常大鼠相比明顯升高時(shí)(P<0.01)[11],胰島素抵抗模型造模成功,采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠喂養(yǎng)前以及喂養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),以喂養(yǎng)前大鼠的平均逃避潛伏期作為參考值,當(dāng)大鼠平均逃避潛伏期前后差值>參考值20%為造模成功,隨后剔除不合格認(rèn)知功能損害模型,其余30只胰島素抵抗認(rèn)知障礙大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、假電針組(10只)和電針組(10只)。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 高脂飼料(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司);小鼠單抗β-actin(42 KD)(武漢博士德生物工程有限公司,BM 0627);鼠多抗β-amyloid1-42(4.4 KD)(Bioss,Bs-0107 m);兔多抗p-Tau(79 KD)和兔多抗Tau(79 KD)、兔多抗wipi2(49 KD)(Affinity,Af 3148、Af 6141、Af 2734);兔單抗S100b(11 KD)、兔單抗mTOR(289 KD)和兔單抗atg13(70 KD)(Abcam,Ab 52642 、Ab 32028及Ab 201467);兔多抗Beclin1(52 KD)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,11306-1-ap);HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司,BA1051、BA1054);磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天,S 1873、P0013 B及P 0010);PMSF(阿拉丁,P 105539);TEMED(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,80125336); HCl(信陽(yáng)市化學(xué)試劑廠,GB 622-89);無(wú)水乙醇,二甲苯、鹽酸、包埋石蠟及中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán),10009218、10023418、10011018、69019361及10004160);蘇木素(Sigma,H9627)。

1.2.2 儀器 酶標(biāo)儀(Thermo,mμLISKANMK 3);離心機(jī)( 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司,H 1650);pH計(jì) (德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司,LP 115);微量移液器(Eppendorf);電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠,DYY-7C、DYCZ-24DN及DYCZ-40);水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司,TS-1);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,CPA);BandScan分析軟件;中研太和牌針灸針(0.30 mm×25 mm,長(zhǎng)春愛康醫(yī)療器械有限公司);華佗牌電針治療儀(HANS-100 A型,蘇州醫(yī)療用品有限公司);血糖儀(590血糖儀,江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);脫水機(jī)(武漢俊杰JT-12J);病理切片機(jī)(德國(guó)Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式);切片刀(日本羽毛R35);組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰JK-6);載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司);抗原修復(fù)用電陶爐(SKG);顯微鏡(奧林巴斯BX53型)。

1.3 胰島素抵抗大鼠模型的建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)選取10只進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng),并將此組命為正常組,其余35只給予高脂飼料(5.4 kcal/g,含38.5%碳水化合物,15%蛋白質(zhì),46.5%脂肪)[12]喂養(yǎng)8周,8周后大鼠尾靜脈采血,血糖儀檢測(cè)FPG,Elisa法檢測(cè)FINS,計(jì)算IRI=[FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)]/22.5,當(dāng)模型大鼠IRI與正常大鼠相比明顯升高時(shí)(P<0.01),胰島素抵抗模型造模成功,采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠喂養(yǎng)前以及喂養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),以喂養(yǎng)前的大鼠的平均逃避潛伏期作為參考值,當(dāng)大鼠平均逃避潛伏期前后差值>參考值20%為造模成功,隨后剔除不合格認(rèn)知功能損害模型,其余30只胰島素抵抗認(rèn)知障礙大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、假電針組(10只)和電針組(10只)。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 電針組 以標(biāo)本配穴電針?lè)椒ㄟx取“百會(huì)”“足三里(后)”“中脘”“關(guān)元”“豐隆”5穴針刺,選用0.30 mm×25 mm不銹鋼毫針,選穴參考2版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》教材[13]?！白闳?后)”和 “豐隆穴”直刺3～5 mm,“關(guān)元穴”向劍突方向、“中脘穴”向恥骨聯(lián)合斜刺3～5 mm,采用電針治療儀(HANS-100 A型)通電10 min,2 Hz疏波,強(qiáng)度為1 mA,同側(cè)“足三里穴”“豐隆穴”連接同一輸出的電極,“關(guān)元穴”“中脘穴”連接另一輸出的電極,“百會(huì)穴”向后方平刺2～5 mm,不接電針,每周治療3次,總療程為8周。

1.4.2 假電針組 選穴同電針組,針刺連接電針后不進(jìn)行通電,模型組與正常組不做其他處理。

1.5 取材

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后,依組別脫頸處死,冰上剝?nèi)∠虑鹉X,部分下丘腦組織按操作進(jìn)行研磨,用于Western blot實(shí)驗(yàn);部分下丘腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 ELISA法檢測(cè)大鼠FINS、計(jì)算IRI 8周喂養(yǎng)造模結(jié)束后,對(duì)4組大鼠進(jìn)行禁食12 h,12 h后尾端靜脈采血,離心取上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度(OD)值,測(cè)量后按照標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并擬合標(biāo)準(zhǔn)方程,最后代入測(cè)定孔OD值,計(jì)算各孔FINS的含量。

隨后血糖儀測(cè)量FPG,根據(jù)公式計(jì)算IRI。

1.6.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 干預(yù)結(jié)束后1天檢測(cè)大鼠認(rèn)知功能。定位航行實(shí)驗(yàn):大鼠放入水池自由游泳1 min進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練,在其適應(yīng)水迷宮整體環(huán)境后,開始實(shí)驗(yàn),平臺(tái)置于第4象限,低于水面1 cm,在4個(gè)象限入水點(diǎn)處依次將大鼠面向池壁投入水中,同一只老鼠放入4個(gè)象限的間隔時(shí)間為5 min, 記錄其規(guī)定時(shí)間內(nèi)(60 s)尋找到平臺(tái)的時(shí)間,此時(shí)間記錄為該大鼠的逃避潛伏期,若超過(guò)60 s未找到平臺(tái),引導(dǎo)其登陸平臺(tái),逃避潛伏期計(jì)為60 s,連續(xù)5 d。

空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日撤除迷宮內(nèi)平臺(tái),大鼠從平臺(tái)象限外3個(gè)象限入水點(diǎn)分別隨機(jī)面向池壁入水,記錄其在60 s內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)及時(shí)間。

1.6.3 Western blot檢測(cè)大鼠下丘腦組織Aβ1-42、p-Tau、S100b、mTOR、WIPI2、Atg13及Beclin1蛋白表達(dá)水平 大鼠處死后取下丘腦組織加入蛋白裂解液,勻漿,離心5 min,-20 ℃保存上清液,用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒按步驟測(cè)蛋白濃度,將提取的蛋白上清液沸水浴5 min使蛋白充分變性。隨后跑電泳加轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜封閉2 h,加入一抗Aβ1-42、一抗β-actin、一抗p-Tau、一抗S100b、一抗mTOR、一抗WIPI2、一抗Atg13及一抗Beclin1(分別1∶400、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000及1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜5次,5 min/次,加入二抗(1∶10 000稀釋),室溫?fù)u床孵育2 h,洗膜同上述,X線膠片成像掃描后,用BandScan分析膠片灰度值。

1.6.4 免疫組化檢測(cè)大鼠下丘腦神經(jīng)元 大鼠脫頸處死后,取出下丘腦組織用多聚甲醛(4%)固定,隨后自動(dòng)脫水機(jī)中脫水,再進(jìn)行浸蠟及組織包埋,切片,厚度4 μm,隨后經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù),滴加一抗(Aβ1-421∶100,p-tau 1∶100)、二抗,鏡下觀察并完成鏡檢拍照。使用Image-Plus6.0軟件對(duì)免疫組化照片進(jìn)行光密度分析,每張切片選取5張400倍組化照片做光密度分析,求均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有5只大鼠未通過(guò)認(rèn)知功能損害模型篩查,予以剔除。

2.1 治療結(jié)束后各組大鼠FINS、FPG及IRI比較

相較于正常組,其他3組大鼠的FINS、FPG及IRI顯著提高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組、假電針組比較,電針組大鼠FIN、FPG及IRI出現(xiàn)了不同程度的降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠治療結(jié)束后FPG、FINS及IRI比較

2.2 各組大鼠治療后記憶能力、行為學(xué)的比較

與正常組比較,模型組大鼠第1天就出現(xiàn)了平均逃避潛伏期延長(zhǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),目標(biāo)象限探索時(shí)間縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),穿越平臺(tái)次數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,假電針組平均逃避潛伏期從第4天出現(xiàn)了減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);電針組大鼠平均逃避潛伏期從第2天開始顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),目標(biāo)象限探索時(shí)間增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),穿越平臺(tái)次數(shù)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與假電針組比較,電針組大鼠平均逃避潛伏期從第4天開始顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),目標(biāo)象限探索時(shí)間增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),穿越平臺(tái)次數(shù)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1、表2～3。

圖1 各組大鼠治療結(jié)束后逃避潛伏期比較

表2 各組大鼠治療結(jié)束后逃避潛伏期比較

表3 各組大鼠治療結(jié)束后目標(biāo)象限探索時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.3 各組大鼠下丘腦Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表達(dá)變化

結(jié)果顯示,模型組的Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組、假電針組比較,電針組的Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了不同程度的降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠治療結(jié)束后Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠治療結(jié)束后Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠免疫組織化學(xué)結(jié)構(gòu)與Aβ1-42、p-Tau平均光密度的變化

如圖3所示,棕黃色或棕褐色細(xì)胞膜是各組大鼠下丘腦 Aβ1-42、p-Tau 的陽(yáng)性表達(dá)(箭頭所示),治療結(jié)束后,相較于正常組,模型組大鼠Aβ1-42、p-Tau的陽(yáng)性表達(dá)明顯增多,平均光密度明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01);相較于模型組,假電針組與電針組Aβ1-42、p-Tau的陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)不同程度減少,平均光密度明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);相較于假電針組,電針組Aβ1-42、p-Tau 的陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)不同程度減少,平均光密度明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3、表5。

圖3 免疫組織化學(xué)與Aβ1-42、p-Tau平均光密度(400×)

表5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Aβ1-42、p-Tau平均光密度

2.5 各組大鼠mTOR1、Beclin1、WIPI2與Atg13蛋白表達(dá)變化

治療結(jié)束后,相較于正常組,模型組的mTOR1蛋白表達(dá)水平顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Beclin1、WIPI2與Atg13蛋白表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);相較于模型組,電針組的mTOR1的蛋白表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Beclin1、WIPI2及Atg13蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了不同程度的增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);相較于假電針組,電針組的mTOR1的蛋白表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Beclin1、WIPI2與Atg13蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了不同程度的增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4、表6。

圖4 各組大鼠治療結(jié)束后mTORC1、Beclin1、WIPI2與Atg13蛋白表達(dá)

表6 各組大鼠治療結(jié)束后mTORC1、Beclin1、WIPI2與Atg13蛋白表達(dá)比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)隨著2型糖尿病患者患病時(shí)間的加長(zhǎng),認(rèn)知障礙共同發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加一倍[14-15]。中醫(yī)學(xué)中并未出現(xiàn)對(duì)“認(rèn)知障礙”這一病名的記載,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)CI屬于中醫(yī)“呆病”范疇,包括“喜忘”健忘”“善忘”等神志病范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》首載“善忘”“喜忘”。胰島素抵抗,古可謂之“消渴”,消渴癥者,五臟皆虛,遂生痰濁[16]。百會(huì)位于巔頂,具有醒腦開竅功效,腦部疾病當(dāng)取百會(huì),以補(bǔ)腦醒神改善認(rèn)知功能,研究也表明針刺百會(huì)穴可有效發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用[17];足三里為胃之下合穴,為強(qiáng)壯后天胃氣之要穴,針刺足三里可以改善大鼠認(rèn)知障礙[18],中脘可調(diào)節(jié)胃部氣血,關(guān)元固護(hù)一身之元?dú)?豐隆化痰祛濕以更進(jìn)一步改善胰島素抵抗,又以足三里配豐隆,可有效改善胰島素抵抗[19]。基于以上,結(jié)合“標(biāo)本配穴”法,選取局部(頭頸部)腧穴百會(huì)與遠(yuǎn)端辨證取穴相結(jié)合。以足三里、關(guān)元固護(hù)脾腎先后天之本,配以豐隆化痰祛濕,胃局部穴位中脘以利導(dǎo)邪氣排除[20],補(bǔ)腎健脾胃,以達(dá)標(biāo)本兼治效果。

認(rèn)知障礙的主要病理改變?yōu)榈矸蹣拥鞍壮恋砼c神經(jīng)原纖維纏結(jié),其分別由淀粉樣前體蛋白(APP)的淀粉樣β蛋白(Aβ)斑塊與成對(duì)螺旋細(xì)絲(PHF)的磷酸化tau蛋白形成[21-23]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),胰島素抵抗認(rèn)知障礙大鼠的認(rèn)知損傷主要是注意力、視覺(jué)結(jié)構(gòu)、學(xué)習(xí)功能和言語(yǔ)記憶等方面[24]。高脂飲食動(dòng)物模型誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型大鼠的胰島素降解酶(IDE)的下調(diào)導(dǎo)致了Aβ的清除減少,并在這其中觀察到了Tau的磷酸化[25]。S100b蛋白是鈣粒蛋白的主要成員,分布在胞漿與胞核內(nèi),主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌,S100b同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外活性,細(xì)胞外 S100b主要通過(guò)參與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)一直參與阿爾茨海默病的病理生理神經(jīng)炎癥[26]。當(dāng)S100b蛋白濃度上升到微摩爾水平時(shí),蛋白表現(xiàn)出神經(jīng)毒性誘導(dǎo)促炎因子釋放加重AD患者炎癥,同時(shí)過(guò)度表達(dá)的S100b蛋白還可通過(guò)鈣依賴途徑使神經(jīng)元凋亡,促使神經(jīng)系統(tǒng)退行性變[27]。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程,被稱為細(xì)胞“清道夫”,其與神經(jīng)退行性疾病的生理病理過(guò)程中密不可分[28]。研究表明,自噬可以清除Aβ積累,減輕Aβ毒性,也可以介導(dǎo)tau蛋白聚合物的降解[29-30]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬過(guò)程中,ULK1(unc-5-like kinase 1)復(fù)合物是細(xì)胞自噬起始的第1個(gè)特異性復(fù)合物,其由ULK1、Atg13,FIP200(focal adhesion kinase family inte-racting protein of 200 kDa)和Atg101組成;隨后,ULK1復(fù)合物下游的主要效應(yīng)分子復(fù)合物之一VPS34(va-cuolar protein sorting 34)復(fù)合物1催化生成PI3P(phosphatidylinositol 3-phosphate)在自噬前體的延伸中發(fā)揮作用,VPS34復(fù)合物1由VPS34(Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶)、Beclin1、VPS15和 ATG14L (類 ATG14)等核心組成;在自噬前體延伸過(guò)程中,PI3P直接招募WIPI2蛋白,促進(jìn)LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)家族蛋白的脂質(zhì)化修飾,影響自噬[31-32]。mTORC1信號(hào)通路參與自噬調(diào)節(jié),在激活自噬中具有門控作用,激活的mTORC1直接磷酸化ULK1,從而抑制細(xì)胞自噬的起始[31]。研究表明,mTORC1可以磷酸化Atg13的Ser258 點(diǎn)位,抑制ULK1 的激酶活性從而影響自噬[33]。又ULK1可以直接磷酸化 Ser14處的 Beclin1,增強(qiáng)VPS34活性從而進(jìn)一步啟動(dòng)自噬[34]。同時(shí)在基底細(xì)胞條件下[35-36],mTORC1的活性影響著WIPI2的表達(dá),在自噬誘導(dǎo)過(guò)程中,當(dāng)mTORC1失活時(shí),WIPI2以穩(wěn)定的去磷酸化形式存在,對(duì)細(xì)胞中mTORC1的生理或藥理抑制可以促進(jìn)WIPI2的穩(wěn)定、自噬體的形成和自噬降解[37]。所以,mTORC1、Atg13、Beclin1與WIPI2的蛋白含量可以在一定程度上反映哺乳動(dòng)物的自噬強(qiáng)度。本研究結(jié)果顯示,相對(duì)于正常組,模型組大鼠的mTORC1蛋白含量增加,Beclin1、Atg13及WIPI2蛋白含量降低,電針組mTORC1蛋白相對(duì)表達(dá)相較于模型組顯著減少、Beclin1、Atg13及WIPI2蛋白相對(duì)表達(dá)增加,提示電針可以有效的影響大鼠細(xì)胞自噬,可能與下調(diào)mTORC1信號(hào)通路有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食造模,通過(guò)電針干預(yù)觀察結(jié)果,結(jié)果顯示,相較于模型組與假電針組,電針干預(yù)可以有效降低大鼠海馬區(qū)的Aβ1-42、p-Tau及S100b蛋白相對(duì)表達(dá)量,下丘腦區(qū)Aβ1-42與p-Tau陽(yáng)性表達(dá)降低,這與水迷宮實(shí)驗(yàn)中電針組大鼠逃避潛伏期顯著縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)增加的結(jié)果相一致。與此同時(shí)電針組mTORC1蛋白相對(duì)表達(dá)相較于模型組顯著減少,Beclin1、Atg13及WIPI2蛋白相對(duì)表達(dá)增加,說(shuō)明在胰島素抵抗認(rèn)知障礙過(guò)程中,電針可以有效提高自噬活性,電針對(duì)于胰島素抵抗認(rèn)知障礙大鼠的防治效應(yīng)有可能通過(guò)mTOR1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。電針改善胰島素抵抗認(rèn)知障礙的作用機(jī)制是多靶點(diǎn)、多通道的,今后需要發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)更多的靶點(diǎn)、更加精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案,以期更準(zhǔn)確全面地探究電針改善胰島素抵抗認(rèn)知障礙大鼠的作用機(jī)制。