葉綠素與膜分離乳蛋白相互作用及復(fù)合物性質(zhì)研究

蘇小紅,劉成力,楊敏,季偉,魏玉梅

1(蘭州工業(yè)研究院,甘肅 蘭州,730050) 2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)3(西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)部,甘肅 蘭州,730000)

葉綠素(chlorophyll, C)是一類脂溶性光合作用色素,廣泛分布在光合作用植物和一些細(xì)菌、藻類植物中。高等植物中的葉綠素主要是葉綠素a和葉綠素b,比例約為3∶1;各葉綠素單體含有卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)[1]。葉綠素來源廣泛,具有鮮艷的綠色,不僅是天然可食用色素,還具有許多生物活性,如抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌等[2-3]。然而,葉綠素極不穩(wěn)定,易受環(huán)境影響發(fā)生降解,如氧氣、酶、光、熱、酸堿性環(huán)境等,導(dǎo)致其變色且活性降低,嚴(yán)重制約了葉綠素在食品工業(yè)中的應(yīng)用[4-5]。因此,提升穩(wěn)定性、進(jìn)行色度保護(hù),是改善葉綠素生物利用度、擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的前提。

近年來,眾多學(xué)者采用大分子負(fù)載以提升葉綠素的穩(wěn)定性,改善其生物利用度。洪軍等[2]以阿拉伯膠、β-環(huán)糊精、蔗糖為壁材制備的微膠囊,顯著提升了韭菜葉綠素的顏色穩(wěn)定性。采用復(fù)合凝沉法,以明膠和果膠為復(fù)合壁材制備的微膠囊,對葉綠素包埋率可達(dá)(80.21±1.18)%,在21 d自然光照射下微膠囊組的葉綠素保留量比未進(jìn)行微膠囊處理組約高40%;在pH 2.5和4.5酸處理?xiàng)l件下,微膠囊組葉綠素的保留量大于85%[1]。大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)對葉綠素具有較高的親和性,其結(jié)合常數(shù)為6.397 2×104L/mol;SPI-C復(fù)合物粒徑較SPI小,且粒度分布均勻,穩(wěn)定性高[6]。SPI和殼聚糖形成的微膠囊對葉綠素的包封率高達(dá)96.21%;在弱酸性溶液中(pH 4.5、6.5),微膠囊中葉綠素的保留率高達(dá)97.7%～100%[7]。在100 MPa靜壓作用下,SPI和葉綠素的結(jié)合常數(shù)高達(dá)1.38×106L/mol,二者形成穩(wěn)定的復(fù)合物;80 ℃熱處理下,復(fù)合物中葉綠素色度基本不變[8]。另外,麥芽糊精和阿拉伯膠包埋顯著提升了葉綠素的貯藏穩(wěn)定性[4]。有研究指出,將1%和3%的葉綠素分散在酪蛋白酸鈉溶液中,其溶解性和貯藏穩(wěn)定性顯著提升[9]。由此可見,采用適宜的大分子負(fù)載可有效提升葉綠素的穩(wěn)定性。

膜分離技術(shù)是基于膜孔徑篩分作用及電荷效應(yīng),實(shí)現(xiàn)不同粒徑分子高效分離的技術(shù),其在乳品加工業(yè)中占據(jù)著重要地位[10]。牛乳中的主要蛋白質(zhì)有2大類,一類是乳清蛋白(whey protein, WP),一類是酪蛋白膠束(micellar casein, MC);其中,乳清蛋白顆粒尺寸介于4～8 nm,而以膠束形式存在的酪蛋白平均粒徑為200 nm[11]。采用適宜的膜分離技術(shù)可實(shí)現(xiàn)酪蛋白膠束與乳清蛋白的有效分離[10]。乳清蛋白不僅功能特性優(yōu)異,而且對活性小分子具有較好的親和力,可作為活性因子的運(yùn)載基質(zhì)。MOHAMMADIAN等[12]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)乳清蛋白負(fù)載后,姜黃素的DPPH自由基清除活性顯著提高。乳清蛋白對(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)的結(jié)合常數(shù)為2.62×104L/mol;EGCG經(jīng)乳清蛋白負(fù)載后降解率顯著降低,抗氧化性顯著提升[13]。酪蛋白膠束是乳中酪蛋白單體的天然存在形態(tài),呈近球形納米結(jié)構(gòu),表面親水內(nèi)部疏水,對活性因子具有較強(qiáng)的親和力。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),酪蛋白膠束對大黃素、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯均具有較高的結(jié)合常數(shù),且經(jīng)酪蛋白膠束負(fù)載后有利于活性分子的緩釋[14-15]。另外,酪蛋白膠束負(fù)載后,原花青素的熱穩(wěn)定性和H2O2氧化穩(wěn)定性顯著提升[16]。綜上所述,乳蛋白對活性因子的親和力較高,具有負(fù)載活性因子的優(yōu)勢。然而,乳蛋白對葉綠素的結(jié)合作用及其復(fù)合物性質(zhì)研究報(bào)道較少。

本文以膜分離技術(shù)制備的乳清蛋白和酪蛋白膠束,以及脫脂乳(skim milk, SM)為基質(zhì),以葉綠素為配體,制備酪蛋白膠束-葉綠素(MC-C)、乳清蛋白-葉綠素(WP-C)、脫脂乳-葉綠素(SM-C)復(fù)合物,利用熒光光譜法解析不同類型乳蛋白與葉綠素的結(jié)合常數(shù);采用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、掃描電鏡表征復(fù)合物結(jié)構(gòu);進(jìn)而分析復(fù)合物的溶解性、熱穩(wěn)定性,利用色度變化評價(jià)貯藏30 d后樣品顏色穩(wěn)定性,并分析模擬胃腸消化過程中復(fù)合物對葉綠素的釋放特性。研究結(jié)果可為葉綠素的穩(wěn)定性提升提供理論基礎(chǔ),也可為擴(kuò)大乳蛋白的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉綠素銅鈉、胃蛋白酶(15 000 U/g)、胰蛋白酶(2 500 U/mg)、豬膽鹽,上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑均為分析純。

新鮮牛乳,蘭州天天鮮乳制品有限責(zé)任公司,離心脫脂(4 000×g,30 min),過100 kDa有機(jī)膜,濃縮液冷凍干燥制得酪蛋白膠束,濾出液過3 kDa有機(jī)膜,濃縮液冷凍干燥制得乳清蛋白,4 ℃冷藏備用;經(jīng)測定,酪蛋白膠束和乳清蛋白中蛋白質(zhì)含量均大于70%[17]。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-5301PC熒光分光光度計(jì)、S-3400N掃描電子顯微鏡,日本日立儀器有限責(zé)任公司;Nicolet iS50型 FTIR儀,美國賽默飛世爾科學(xué)公司;STA 449 F5型 TG-DSC熱分析儀,德國耐馳儀器制造有限公司;NAI-GZJ實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī),上海那艾精密儀器有限公司;UV-1780雙光束紫外可見分光光度計(jì),島津儀器有限公司;CS-200色差儀,杭州彩譜科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳蛋白與葉綠素復(fù)合物制備

稱取一定量乳清蛋白或酪蛋白膠束,溶于去離子水中,室溫下攪拌4 h,放入4 ℃冰箱中水化過夜,之后定容至250 mL,蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度為2 g/L。準(zhǔn)確移取適量脫脂乳,其蛋白質(zhì)含量按照3%計(jì),用去離子水稀釋至蛋白質(zhì)含量為2 g/L。配制2 mmol/L葉綠素銅鈉水溶液。將不同體積葉綠素溶液加入10 mL乳清蛋白、酪蛋白膠束以及脫脂乳溶液中,補(bǔ)充適量水,使總添加量一致,葉綠素終濃度分別為0、10、20、30、40、50 μmol/L。使用渦流混合器將混合液混合30 s,然后分別在298、310、318 K下加熱20 min,于室溫下冷卻,即為乳蛋白與葉綠素復(fù)合物,用于作用機(jī)理研究。采用上述方法,配制質(zhì)量濃度為30 g/L的乳蛋白水溶液,脫脂乳直接使用;向500 mL 3種乳蛋白溶液中分別加入30 mL濃度為2 mmol/L的葉綠素銅鈉水溶液,于298 K下按照上述方法制備復(fù)合物并噴霧干燥,收集粉末用于結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究。

1.3.2 熒光光譜分析

用熒光分光光度計(jì)測定樣品熒光光譜,在290～500 nm內(nèi)記錄發(fā)射光譜,激發(fā)波長為280 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫為5 nm。利用Stern-Volmer方程計(jì)算乳蛋白與葉綠素的熒光猝滅類型,熒光猝滅類型的計(jì)算如公式(1)所示[14]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中:F0和F,分別為加入葉綠素前后蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度;KSV,Stern-Volmer的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù);Kq,雙分子猝滅過程的速率常數(shù);[Q],葉綠素濃度;τ0,沒有葉綠素時(shí)熒光分子的平均壽命(10-8s)。

用雙對數(shù)方程計(jì)算乳蛋白與葉綠素的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,其計(jì)算如公式(2)所示:

lg(F0-F)/F=lgKa+nlg[Q]

(2)

式中:Ka是結(jié)合常數(shù),n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.3.3 FTIR分析

將少量復(fù)合物粉末放于ATR元件上,采集紅外圖譜,掃描范圍4 000～400 cm-1,儀器分辨率為2 cm-1。

1.3.4 掃描電鏡分析

取適量復(fù)合物粉末置于銅臺上的導(dǎo)電膠條表面,小心涂抹使其分散為薄層,噴金后采用掃描電子顯微鏡觀察,電壓12.0 kV。

1.3.5 溶解性測定

參考曾秋兵等[17]的方法,略有修改。稱取適量樣品,加入適量去離子水,于恒溫磁力攪拌器在45 ℃下攪拌,用1 mol /L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)所需pH直至穩(wěn)定,繼續(xù)攪拌2 h后定容至終質(zhì)量濃度為10 mg/mL,室溫放置2 h。將10 mL溶液移入15 mL恒重的離心管中,4 000 r/min離心10 min,去掉上清液,放入烘箱中于65 ℃烘至恒重,稱重記為m0,10 mL溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量記為m1,溶解性的計(jì)算如公式(3)所示:

溶解度/%=[(m1-m0)/m1]×100

(3)

1.3.6 熱穩(wěn)定性分析

參照QIN等[14]的方法,使用TG-DSC熱分析儀測定復(fù)合物粉末的熱穩(wěn)定性。

1.3.7 色度分析

參照本團(tuán)隊(duì)[18]方法,在室溫下將色差儀進(jìn)行校準(zhǔn),然后取適量新制備的樣品鋪平,測定樣品的顏色數(shù)據(jù)。將樣品置于自封袋中,冰箱冷藏30 d后測定色度。樣品色差ΔE的計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

1.3.8 胃腸模擬消化性分析

將100 mg復(fù)合物粉末分散在2 mL pH 1.2的蒸餾水中,裝于透析袋中(分子質(zhì)量2 kDa);加入2.0 mL混合模擬胃液(含2 g/L NaCl、7 mL HCl和3.2 g/L胃蛋白酶,pH 1.2)。將透析袋置于含有150 mL釋放液燒杯中,釋放液由無酶模擬胃液組成。然后,置于水浴恒溫振蕩器在37 ℃恒溫下100 r/min振蕩2 h。調(diào)節(jié)混合液pH至7.5,加入模擬腸液4.0 mL(SIF,由6.8 g/L KH2PO4和10 g/L胰蛋白酶組成,pH 7.5)。將透析袋置于含有150 mL釋放液的燒杯中,釋放液由無酶SIF組成,在相同條件下振蕩22 h。在每個(gè)指定時(shí)間點(diǎn)收集3 mL透析介質(zhì),用3 mL新鮮介質(zhì)替換。采用紫外可見分光光度計(jì)在405 nm下測定吸光度,并根據(jù)相同釋放介質(zhì)中的葉綠素銅鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其釋放量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2021處理并用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,用Origin Pro 9.0作圖,用SPSS 22進(jìn)行差異顯著性分析,數(shù)據(jù)間差異顯著分析采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素與乳蛋白相互作用分析

2.1.1 熒光光譜分析

如圖1所示,酪蛋白膠束在338 nm處出現(xiàn)最大熒光值,乳清蛋白在332 nm處出現(xiàn)最大熒光值,而脫脂乳在345 nm處出現(xiàn)最大熒光值。CHEN等[13]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)最大發(fā)射波長λmax<330 nm,色氨酸殘基被包埋于疏水環(huán)境內(nèi)部;當(dāng)λmax>330 nm時(shí),色氨酸殘基位于親水環(huán)境,暴露于蛋白鏈表面?？梢?酪蛋白膠束、乳清蛋白以及脫脂乳中蛋白鏈上的色氨酸殘基均暴露在親水環(huán)境中。葉綠素對酪蛋白膠束、乳清蛋白和脫脂乳均有熒光猝滅效應(yīng);隨著葉綠素濃度的增大,乳蛋白最大熒光值降低,說明葉綠素與乳蛋白結(jié)合,形成了復(fù)合物。另一方面,隨著葉綠素添加量的增加,λmax出現(xiàn)藍(lán)移,即向低波長移動(dòng),表明葉綠素與乳蛋白間具有相互作用,二者結(jié)合使乳蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,色氨酸殘基由親水環(huán)境向疏水環(huán)境轉(zhuǎn)化。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),結(jié)合槲皮素可促使乳清蛋白最大發(fā)射波長藍(lán)移,與本研究結(jié)果一致[19]。

a-MC-C;b-WP-C;c-SM-C

2.1.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分析

利用Stern-Volmer方程對MC-C、WP-C、SM-C的熒光光譜進(jìn)行計(jì)算,獲得的猝滅速率常數(shù)見表1。葉綠素對酪蛋白膠束、乳清蛋白及脫脂乳中混合乳蛋白的熒光猝滅速率常數(shù)Kq均高于猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞常數(shù)[2.0×1010L/(mol·s)],說明葉綠素對乳蛋白的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅過程,形成穩(wěn)定的靜態(tài)復(fù)合物[14]。根據(jù)雙對數(shù)方程計(jì)算不同溫度下葉綠素和酪蛋白膠束、乳清蛋白,以及脫脂乳的結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,見表1。葉綠素與乳蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka均大于106L/mol,表明乳蛋白對葉綠素具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。葉綠素與乳清蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka隨溫度的升高而增大,說明結(jié)合過程為吸熱過程;其與脫脂乳、酪蛋白膠束的Ka隨溫度的升高而降低,表明二者與葉綠素之間的結(jié)合是放熱過程。何思宇[20]研究發(fā)現(xiàn),葉綠素與酪蛋白酸鈉的結(jié)合過程為放熱過程,與本研究中酪蛋白膠束和葉綠素結(jié)合過程一致。對比結(jié)合常數(shù)發(fā)現(xiàn),同一溫度下脫脂乳與葉綠素的結(jié)合常數(shù)大于酪蛋白膠束,可見,脫脂乳體系更有利于結(jié)合葉綠素。脫脂乳體系中不僅含有酪蛋白膠束,而且有乳清蛋白及其他微量乳蛋白,這些成分的存在也可以結(jié)合一定量的葉綠素。另一方面,脫脂乳體系中成分較多,含有乳糖等小分子,可能影響酪蛋白膠束、乳清蛋白的結(jié)構(gòu),使其更有利于結(jié)合小分子[21]。因此,脫脂乳對葉綠素的結(jié)合常數(shù)大于酪蛋白膠束對葉綠素的結(jié)合常數(shù)。乳蛋白對葉綠素的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n約為1,說明葉綠素在乳蛋白上只有單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表1 葉綠素與乳蛋白結(jié)合過程的相關(guān)參數(shù)

據(jù)報(bào)道,SPI與葉綠素的Ka為6.397 2×104L/mol[6],低于乳清蛋白對葉綠素的Ka;酪蛋白酸鈉與葉綠素的Ka為8.99×105L/mol[20],與酪蛋白膠束對葉綠素的Ka相似。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),乳清蛋白對槲皮素的Ka為3.88×104L/mol[19];酪蛋白膠束對咖啡酸的Ka為3.09×104L/mol,對咖啡酸苯乙酯的Ka為5.69×106L/mol,對大黃素的Ka為5.636×103L/mol[14-15]。由此可見,乳蛋白與活性分子的結(jié)合常數(shù)與乳蛋白類型及活性分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2 復(fù)合物的FTIR分析

圖2 MC-C、WP-C、SM-C復(fù)合物FTIR圖

2.3 復(fù)合物微觀形貌分析

如圖3所示,游離葉綠素為塊狀,表面凹凸不平,形狀不規(guī)則。噴干的乳蛋白及其與葉綠素的復(fù)合物為葡萄干狀,粒徑分布在2～10 μm,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27-28]。其中,結(jié)合葉綠素后,乳清蛋白凹陷程度增大,多數(shù)樣品呈半球形中空結(jié)構(gòu)。然而,葉綠素對酪蛋白膠束的形貌影響不大。蛋白質(zhì)樣品的形貌與蛋白基質(zhì)的性質(zhì)、水分?jǐn)U散程度有關(guān)[29]。由于酪蛋白膠束呈納米級球形,結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定,在結(jié)合葉綠素后和噴干過程中不易發(fā)生變形,因此其形貌變化不大。而乳清蛋白分子結(jié)構(gòu)柔性較大,與葉綠素結(jié)合后,在噴干過程中隨著水分和葉綠素一起向液滴外側(cè)擴(kuò)散,因此出現(xiàn)較大凹陷。脫脂乳中含有4.76%～4.92%乳糖[21],在噴干過程中擴(kuò)散速率較大分子快,因其迅速向液滴外側(cè)擴(kuò)散,致使干燥樣品的凹陷程度低于酪蛋白膠束及乳清蛋白;添加少量葉綠素不會(huì)顯著改變其形貌。由此可見,葉綠素對乳清蛋白形貌的影響程度大于其對酪蛋白膠束和脫脂乳形貌的影響。

圖3 MC-C、WP-C、SM-C復(fù)合物SEM圖

2.4 復(fù)合物溶解性分析

如圖4所示,在pH 2和3時(shí),乳清蛋白和酪蛋白膠束具有較好的溶解性,溶解率超過96%;脫脂乳的溶解性低于乳清蛋白和酪蛋白膠束,在84%～88%之間,這是因?yàn)槊撝橹泻腥樘?也有脂肪殘留,其在酸性條件下溶解性不及乳蛋白高。所有樣品均在pH 4.5時(shí)溶解性最差,該處接近乳蛋白的等電點(diǎn)。在pH 6～8內(nèi),所有樣品溶解性逐漸增加,但脫脂乳和乳清蛋白在pH 9、10時(shí)溶解性逐漸降低,可能為蛋白質(zhì)變性所致。

圖4 MC-C、WP-C、SM-C復(fù)合物溶解性

在pH 4.5～8,與葉綠素結(jié)合后的復(fù)合物溶解性較未結(jié)合乳蛋白均有所改善,這是因?yàn)槿~綠素帶有負(fù)電荷,在該pH范圍內(nèi)與乳蛋白結(jié)合后有利于增加乳蛋白鏈上的負(fù)電荷,從而增加蛋白分子間斥力,使其分散性和溶解性變好[20]。在pH 2～4,葉綠素的結(jié)合均降低了乳蛋白的溶解性,其中在pH 2時(shí)較為明顯,這可能是因?yàn)槿~綠素在酸性條件下負(fù)電荷被中和所致。

2.5 復(fù)合物熱穩(wěn)定性分析

乳蛋白和葉綠素復(fù)合物的DSC、TG、DTG曲線如圖5所示。由圖5-a可以看出,葉綠素在270、475 ℃出現(xiàn)放熱峰,分別為葉綠素的熔化和分解峰[7]。與乳蛋白結(jié)合后,該放熱峰消失,證實(shí)了復(fù)合物的形成。與未結(jié)合葉綠素的乳蛋白相比,復(fù)合物的DSC曲線變化趨勢未發(fā)生顯著改變。

a-DSC曲線;b-TG曲線;c-DTG曲線

復(fù)合物的TG曲線如圖5-b所示,脫脂乳及其與葉綠素的復(fù)合物經(jīng)歷3次失重,其余樣品均經(jīng)歷2次失重。所有樣品的第一次失重是在80 ℃左右,為水分蒸發(fā)。脫脂乳及其與葉綠素的復(fù)合物第二次失重出現(xiàn)在150～215 ℃,為乳糖熔化所致[30];第三失重階段為270～400 ℃,為乳蛋白分解所致[14],乳清蛋白、酪蛋白膠束及其與葉綠素的復(fù)合物在該階段均出現(xiàn)明顯失重。與葉綠素結(jié)合后,乳清蛋白的殘留量增加,酪蛋白膠束的殘留量降低,脫脂乳的殘留量基本不變。酪蛋白膠束與葉綠素結(jié)合過程為放熱過程,其復(fù)合物能量降低,熱分解后殘余量減少;而乳清蛋白與葉綠素的結(jié)合過程為吸熱過程,復(fù)合物能量升高,殘余量增加。由于脫脂乳中含有大量乳糖等其他成分,葉綠素對其殘余量影響不大。

由復(fù)合物的DTG曲線(圖5-c)可知,乳清蛋白的分解溫度約為300 ℃,酪蛋白膠束的分解溫度為314 ℃。脫脂乳出現(xiàn)2個(gè)分解溫度,第1個(gè)為188 ℃,為乳糖的熔點(diǎn);第2個(gè)在300～350 ℃,為乳蛋白的分解溫度。與葉綠素結(jié)合后,復(fù)合物DTG曲線與游離乳蛋白的DTG曲線相似,說明葉綠素對乳蛋白的熱穩(wěn)定性影響不大。

2.6 復(fù)合物的色度分析

色度是食品顏色的表征,其中L*表示亮度,L*=0表示黑色,L*=100表示白色;a*表示綠(-)、紅(+)兩種色彩變化;b*表示藍(lán)(-)、黃(+)2種色彩變化[7]。乳蛋白與葉綠素復(fù)合物的色度如表2所示。葉綠素亮度值較低,綠度值較大,以墨綠色為主。復(fù)合物中,脫脂乳-葉綠素的亮度值最大,這是因?yàn)槊撝橹泻腥樘?。乳清蛋白與葉綠素復(fù)合物的綠度值最大,是因?yàn)槿榍宓鞍壮尸F(xiàn)乳白色。3種復(fù)合物的亮度值和綠度值差異顯著(P<0.05),黃度值差異不顯著(P>0.05)。與葉綠素相比,復(fù)合物的亮度、綠色度和黃色度均增加,這是由于結(jié)合過程中使葉綠素分子分散性變好,在乳蛋白白色度的襯托下更能體現(xiàn)出黃綠色,而游離葉綠素呈聚集狀態(tài),主體呈現(xiàn)一定程度的黑色,與何思宇[20]研究結(jié)果一致。AGARRY等[7]的研究中,SPI/殼聚糖-葉綠素復(fù)合物的L*為41.09,低于本文研究結(jié)果,可能是因?yàn)槿~綠素含量不同。

表2 葉綠素與乳蛋白復(fù)合物的色度

貯藏30 d后,游離葉綠素的色度變化較大,其中亮度值、綠度值降低,黃度值有所增加,說明葉綠素發(fā)生了降解。AGARRY等[7]研究發(fā)現(xiàn),葉綠素降解后主要呈現(xiàn)橄欖棕色,與本文研究結(jié)果一致。經(jīng)乳蛋白負(fù)載后,貯藏期間葉綠素色度變化較小。由此可見,乳蛋白負(fù)載有利于改善葉綠素的顏色穩(wěn)定性,且復(fù)合物呈現(xiàn)黃綠色,色澤較游離葉綠素好。

2.7 復(fù)合物中葉綠素的釋放性分析

如圖6所示,在模擬胃液消化過程中,復(fù)合物和游離葉綠素的釋放率均較低,這是因?yàn)槲敢旱膹?qiáng)酸性環(huán)境不利于葉綠素及乳蛋白溶解,因此葉綠素釋放率較低。在模擬腸液消化10 h過程中,酪蛋白膠束負(fù)載的葉綠素釋放率最高,脫脂乳負(fù)載的葉綠素釋放率最低。酪蛋白膠束-葉綠素復(fù)合物中葉綠素的模擬腸液消化釋放率8 h內(nèi)呈線性增加,增速較為平緩,8 h后迅速增大。游離葉綠素與酪蛋白膠束負(fù)載的葉綠素釋放率變化趨勢類似,但釋放率低于酪蛋白膠束負(fù)載的葉綠素。另外,乳清蛋白負(fù)載的葉綠素與脫脂乳負(fù)載的葉綠素模擬腸液釋放曲線相似,其在6 h內(nèi)緩慢增加,之后迅速釋放。由于酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較高,葉綠素結(jié)合在酪蛋白膠束表面,加上其良好的溶解性,在消化過程中易于釋放,因此釋放率最高。與游離葉綠素相比,酪蛋白膠束負(fù)載促進(jìn)了葉綠素的釋放,這可能是因?yàn)槔业鞍棕?fù)載削弱了葉綠素分子的聚集,增大了其溶解性,從而促進(jìn)了葉綠素的釋放[23]。脫脂乳中含有大量乳糖以及微量脂肪,這些成分在噴干過程中更易于擴(kuò)散到液滴表面,影響了葉綠素的釋放,因此脫脂乳中葉綠素釋放率較低[31]。消化24 h后,游離葉綠素累積釋放率最低,僅為(38.29±3.47)%,這可能是因?yàn)橛坞x葉綠素穩(wěn)定性較差,在光、酶、熱以及堿性條件下易分解,其在模擬腸液消化過程中大量分解所致[32]。

圖6 復(fù)合物中葉綠素的模擬胃腸消化釋放曲線

3 結(jié)論

葉綠素與酪蛋白膠束、乳清蛋白和脫脂乳可發(fā)生相互作用,自發(fā)形成靜態(tài)復(fù)合物。3種類型乳蛋白對葉綠素均具有較高的親和性,其結(jié)合常數(shù)高于106L/mol。然而,葉綠素結(jié)合不改變?nèi)榈鞍椎亩壗Y(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性。乳清蛋白與葉綠素形成微膠囊后,其表面凹陷程度加深,甚至出現(xiàn)中空結(jié)構(gòu);但酪蛋白膠束與脫脂乳形貌未發(fā)生明顯改變。另外,葉綠素結(jié)合改善了乳蛋白在弱酸性和中性條件下的溶解性。乳蛋白負(fù)載后,葉綠素的顏色穩(wěn)定性顯著提升,且其24 h模擬胃腸消化釋放率提升。綜上所述,酪蛋白膠束、乳清蛋白和脫脂乳負(fù)載均可改善葉綠素的穩(wěn)定性。