代謝改造大腸桿菌合成8-異戊烯基山奈酚

趙婉瑩,周景文,侯穎*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300000)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

異戊烯基化類黃酮屬于類黃酮類物質(zhì)[1],其以類黃酮為骨架通過C—C鍵或C—O鍵與親脂性的異戊烯基側(cè)鏈相連構(gòu)成[2],而異戊烯基修飾對提高類黃酮物質(zhì)的生物活性具有重要意義[3]。8-異戊烯基山奈酚是山奈酚8-C異戊烯基化的衍生物,主要存在于豆科植物(苦參)和小檗科植物(淫羊藿)[4-5]。8-pk具有多種生物活性,如抗氧化、保護(hù)心血管[6]和降血糖[7]等。目前8-pk主要通過植物提取、化學(xué)合成和生物合成得到。相比于天然植物提取和化學(xué)合成,生物合成異戊烯基類黃酮具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單、選擇性高和環(huán)境友好等優(yōu)點。因此開發(fā)綠色高效的生物合成8-pk體系符合當(dāng)今中國的“雙碳”政策和可持續(xù)發(fā)展理念。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是黃酮類化合物異戊烯基化修飾過程中的關(guān)鍵酶,其自身具有的膜定位信號肽可將異戊烯基轉(zhuǎn)移酶定位于細(xì)胞中不同的細(xì)胞器或細(xì)胞膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[8]。本研究團(tuán)隊在前期挖掘了淫羊藿來源的EkF8DT,能夠識別山奈酚(kaempferol, Kae)進(jìn)而合成8-pk,這為8-pk的高效生物合成提供了基礎(chǔ)。現(xiàn)有的研究已在釀酒酵母中首次實現(xiàn)了8-pk的從頭合成,通過截短N端信號肽和強化甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA)等方式,可生產(chǎn)25.9 mg/L的8-pk[9]。但其存在發(fā)酵周期長、生產(chǎn)效率低、生產(chǎn)成本高等問題,難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。E.coli作為實驗室和工業(yè)常用的菌株,因其生長迅速、技術(shù)操作簡單和遺傳工具發(fā)展成熟的優(yōu)勢而成為良好的底盤菌株。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶可以從不同的供體來獲得異戊烯基,其中以二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)為主要的供體。DMAPP可由MVA途徑和甲基赤蘚糖醇4-磷酸途徑(methylerythritol 4-phosphate pathway,MEP)合成。E.coli中DMAPP通過MEP途徑產(chǎn)生,但是該途徑代謝強度較弱,導(dǎo)致DMAPP供給不足,限制了產(chǎn)物的高效合成。異戊烯醇利用途徑(isopentenol utilization pathway,IUP)可以分別以3-甲基-3丁烯-1-醇或3-甲基-2丁烯-1-醇作為原料,分2步生成異戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和DMAPP(圖1)。IUP途徑由釀酒酵母來源的膽堿激酶(choline kinase fromSaccharomycescerevisiae,ScCK)、擬南芥來源的異戊烯磷酸激酶(isopentenyl phosphate kinase fromArabidopsisthaliana,AtIPK)和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl-pyrophosphate delta isomerase,IDI)組成,ATP是其唯一輔因子。研究表明通過表達(dá)膽堿激酶(choline kinase,CK)和磷酸異戊烯基激酶(isopentenyl phosphate kinase,IPK)引入了IUP途徑使β-胡蘿卜素產(chǎn)量增加23%[10]。通過對比IUP途徑與MVA途徑發(fā)現(xiàn),IUP能夠快速獲得IPP和DMAPP,從而將IPP和DMAPP水平提高15.7倍[11]。而MVA途徑會消耗大量的能量,因此,通過引入IUP途徑來提高DMAPP的供給,是高效生物合成8-pk的關(guān)鍵。此外,將異戊烯基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行N端的截短是提高其催化性能的常見手段[12]。通過截短前40和80個氨基酸殘基使得8-異戊烯基柚皮素的產(chǎn)量提高了44.2%和119.1%[13]。

G3P:3-磷酸甘油醛;dxs:1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶;ispC:1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶;ispD:4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶;ispE:4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶;ispF:2C-甲基-D-紅細(xì)胞-2,4-環(huán)二磷酸合酶;ispG:1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶;ispH:1-羥基-2-甲基-2(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶;idi:焦磷酸異戊烯異構(gòu)酶;DXP:1-脫氧-D-酮糖-5-磷酸鹽;MEP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸;DPCME:4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤蘚糖醇;DPCMEP:2-磷酸-4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤蘚糖醇;MECDP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)二磷酸;HMBDP:1-羥基-2-甲基丁烯基-4-二磷酸;AtIPK:來自擬南芥的異戊烯基激酶;ScCK:來自釀酒酵母的膽堿激酶;F8DT:異戊烯基轉(zhuǎn)移酶;IPP: 異戊烯基二磷酸;DMAPP:二甲基烯丙基二磷酸;IP:異戊烯基一磷酸;DMAP:一磷酸二甲基烯丙基。

針對上述問題,本文在EkF8DT游離表達(dá)的基礎(chǔ)上,引入IUP途徑,以提高DMAPP的供給;然后通過在線網(wǎng)站預(yù)測EkF8DT的結(jié)構(gòu),選取了8個位點進(jìn)行截短,驗證了其對8-pk合成的影響;最后,通過在N端融合蛋白質(zhì)標(biāo)簽以及對質(zhì)粒載體拷貝數(shù)、發(fā)酵溫度、異丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside,IPTG)濃度、誘導(dǎo)時機以及底物Kae的添加量優(yōu)化,進(jìn)一步提高8-pk的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

EscherichiacoliJM109用于質(zhì)粒構(gòu)建與擴增。EscherichiacoliBL21(DE3)用于蛋白的表達(dá)?；?EkF8DT,登錄號QXN66318.1;Scck,登錄號CP046092.1;Atipk,登錄號NP_173986.2)由上海生工合成。質(zhì)粒表達(dá)載體由實驗室保藏。文中所使用的菌株列于表1。

表1 本實驗所使用的菌株和質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(TB+葡萄糖)(g/L):甘油5、蛋白胨12、酵母提取物24、KH2PO42.31、K2HPO416.37、葡萄糖10。

5 L發(fā)酵罐:種子液按照4%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于含有2.5 L TB培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。初始攪拌速度300 r/min,空氣流速2 vvm,溫度37 ℃。發(fā)酵10 h后,將補料培養(yǎng)基以5 mL/h的流速加入發(fā)酵罐中,共加入500 mL。用氨水調(diào)控pH為7,設(shè)置攪拌槳轉(zhuǎn)速300～600 r/min。補料培養(yǎng)基:500 g/L甘油。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建

所有片段均由高保真DNA聚合酶擴增,使用上海生工即用型無縫克隆試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建。用引物對pACYC-F/pACYC-R構(gòu)建質(zhì)粒pACYCDuet的線性化載體,用引物對IDI-F/IDI-R,并以E.coli基因組為模板,擴增idi基因片段,通過Gibson構(gòu)建質(zhì)粒pACYCDuet-F8DT-idi。其他質(zhì)粒的構(gòu)建方法同上。本試驗所用引物見表2。

表2 本實驗所引用的引物

1.2.2 培養(yǎng)條件

采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)種子液。用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)8-pk。挑取陽性轉(zhuǎn)化子于裝有5 mL LB(添加相應(yīng)抗性)的50 mL搖瓶中,220 r/min、37 ℃培養(yǎng)8～12 h。將種子液按照2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于裝有25 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,220 r/min,37 ℃培養(yǎng),當(dāng)OD600達(dá)到0.8～1時,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,溫度調(diào)至25 ℃,誘導(dǎo)10 h后加入終質(zhì)量濃度為250 mg/L的Kae,繼續(xù)發(fā)酵36 h。

1.2.3 樣品處理及液相分析條件

發(fā)酵結(jié)束后,取500 μL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中并加入同體積的甲醇,劇烈振蕩混勻后,12 000 r/min離心2 min,取上清液后用0.22 μm有機相濾膜過濾后使用島津LC-20AT高效液相色譜儀進(jìn)行產(chǎn)物檢測。采用Thermo Fisher C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進(jìn)行色譜分離;柱溫箱溫度40 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速1.0 mL/min。流動相分別為:A相為超純水(加入0.1%三氟乙酸),B相為乙腈(加入0.1%三氟乙酸);使用以下梯度實現(xiàn)分離:0～10 min(10%～40%B)、10～35 min(40%～80%B)、35～37 min(80%～10%B)、37～40 min(10%B)。在350 nm波長處檢測產(chǎn)物8-pk。

2 結(jié)果與分析

2.1 異戊烯醇利用途徑(IUP途徑)增加DMAPP的供給

將pACYCDuet-EkF8DT轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,30 ℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)10 h后加入250 mg/L的Kae發(fā)酵60 h。然而,HPLC檢測發(fā)酵液顯示無8-pk的產(chǎn)生。推測可能的原因是異戊烯基前體供應(yīng)不足,進(jìn)行前體合成途徑強化的研究。如圖1所示,引入IUP途徑,表達(dá)釀酒酵母來源的Scck和擬南芥來源的Atipk,并且共表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi以促進(jìn)IPP生成DMAPP。最終,在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)構(gòu)建的pACYCDuet-EkF8DT-idi-Scck-Atipk質(zhì)粒,并在發(fā)酵過程中終濃度為25 mmol/L的3-甲基-3-丁烯-1-醇。以攜帶pACYC空質(zhì)粒的E.coliBL21作為對照1,以僅引入Scck和Atipk,不過表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi,添加3-甲基-2-丁烯-1-醇作為對照2,以僅過表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi來強化MEP途徑作為對照3。如圖2所示,通過上述途徑構(gòu)建策略,發(fā)酵36 h時,重組菌中8-pk產(chǎn)量最高可達(dá)到2.14 mg/L,而在對照1、對照2和對照3中均未檢測到8-pk。

圖2 引入IUP途徑菌株EI02生物合成8-pk的過程

上述結(jié)果表明,E.coliBL21本身無8-pk合成能力。實驗組能夠檢測到8-pk的原因可能是3-甲基-3-丁烯-1-醇作為底物時酶的kcat/Km要大于3-甲基-2-丁烯-1-醇[14],更好地增加了異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的前體DMAPP在體內(nèi)的合成量,進(jìn)而產(chǎn)生更多的8-pk。而僅過表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi來強化MEP途徑不能夠為催化反應(yīng)提供較多的DMAPP,因此推測DMAPP供應(yīng)不足是8-pk合成的關(guān)鍵限制因素。

2.2 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的截短表達(dá)

根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站的預(yù)測結(jié)果顯示,EkF8DT是具有至少7個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜內(nèi)源性蛋白(圖3-a)。膜蛋白的大量表達(dá)可能會對細(xì)胞膜產(chǎn)生損害,影響蛋白的可溶性表達(dá)[15],降低其催化活性甚至失活。而截短N端信號肽可以提高酶的催化活性[12]。將EkF8DT的氨基酸序列輸入TargetP 2.0在線工具,對EkF8DT的信號肽進(jìn)行預(yù)測(圖3-b),峰的高度代表了信號肽的可能性。結(jié)果顯示EkF8DT的轉(zhuǎn)運肽在第49位氨基酸。并利用在線網(wǎng)站(https://drug.ai.tencent.com/)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示EkF8DT由10個α-螺旋的主體骨架和一個長側(cè)鏈組成。長側(cè)鏈的存在可能會對酶的結(jié)構(gòu)造成影響。因此構(gòu)建了8個N端氨基酸被截短的菌株,分別為截短40(EI04)、49(EI05)、56(EI06)、60(EI07)、64(EI08)、82(EI09)、96(EI10)和100(EI11)個氨基酸(圖4-a)。如圖4-b所示,菌株EI06、EI07和EI08可分別提高2、3和2.9倍的8-pk產(chǎn)量。菌株EI07的產(chǎn)量提高最明顯(6.46 mg/L)?？赡苁乔?0個氨基酸為定位信號肽,當(dāng)其被截掉時,該酶無法定位到細(xì)胞膜上,同時酶的催化能力提高。菌株EI04、EI05、EI09和EI11在合成8-pk的能力上明顯下降。

a-跨膜結(jié)構(gòu)域;b-信號肽

a-EkF8DT二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及截短位點;b-N端不同位點截短菌株發(fā)酵產(chǎn)量圖

2.3 蛋白質(zhì)標(biāo)簽改造異戊烯基轉(zhuǎn)移酶

添加蛋白溶解度標(biāo)簽可提高外源蛋白的可溶性表達(dá)[16]。SUMO蛋白標(biāo)簽融合到N端時,SAM表達(dá)菌株的可溶性蛋白表達(dá)量顯著提高[17]。LAI等[18]發(fā)現(xiàn)融合GST的蛋白在E.coliBL21(DE3)中的表達(dá)水平顯著提高。NusA標(biāo)簽與乙醛脫氫酶融合,使得酶活性得到了提高[19]。因此我們選擇了GST、NusA和SUMO增強EkF8DT的可溶性表達(dá)。如圖5所示,菌株EI12的8-pk的產(chǎn)量較菌株EI07提高了2倍(12.92 mg/L)。而菌株EI17的產(chǎn)量是EI07的7.5%。結(jié)果證明SUMO標(biāo)簽增強了重組蛋白的表達(dá)和溶解度[20],而NusA和GST標(biāo)簽起到了負(fù)作用,這與之前的研究結(jié)果一致[21]。N端融合蛋白標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣逧kF8DT的催化能力,提高8-pk的產(chǎn)量,同時也證明蛋白質(zhì)標(biāo)簽的使用具有較強的選擇性。

圖5 N端連接不同的蛋白質(zhì)標(biāo)簽對8-pk生物合成的影響

使用抗性基因的前導(dǎo)序列作為助溶標(biāo)簽?zāi)軌蛟鰪娔さ鞍椎谋磉_(dá),如在生產(chǎn)香葉醇的研究中,將Sm抗性基因的前25個前導(dǎo)序列和KANA的前34個前導(dǎo)序列融合到香葉醇合酶的N末端,前者使得香葉醇的產(chǎn)量提高了1.3倍,后者與對照組相比無明顯差異[22]。因此,將Sm和Kana的前導(dǎo)序列融合在EkF8DT的N端,測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株EI15和菌株EI16的8-pk產(chǎn)量為菌株EI07的97%和65%,證明該方法,無法有效提高EkF8DT的可溶性表達(dá),降低了8-pk的合成。

2.4 質(zhì)?？截悢?shù)對宿主細(xì)胞生長以及8-pk合成的影響

研究表明質(zhì)?？截悢?shù)對宿主細(xì)胞生長以及產(chǎn)物合成有明顯影響[23]。通過更換不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體來驗證拷貝數(shù)對8-pk產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖6所示,替換為質(zhì)粒載體pCDFDuet、pETDuet和pRSFDuet后,8-pk產(chǎn)量分別為pACYCDuet為質(zhì)粒載體(EI12)的63%、62%和55%,OD600分別為原菌株(EI12)54%、200%和59%。

a-不同基因拷貝數(shù)質(zhì)粒構(gòu)建圖;b-不同拷貝數(shù)質(zhì)粒菌株發(fā)酵產(chǎn)量圖

上述研究結(jié)果表明,質(zhì)粒載體拷貝數(shù)對基因表達(dá)的影響較大,雖然中拷貝質(zhì)粒載體pETDuet能夠使菌株菌體濃度得到較好提升,但是產(chǎn)量卻大幅度下降,說明產(chǎn)量與細(xì)胞生長不呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系?？赡苁怯捎谥懈呖截愘|(zhì)粒使得EkF8DT被表達(dá)的速度過快,出現(xiàn)錯誤的折疊方式,導(dǎo)致EkF8DT可溶性降低。而低拷貝質(zhì)粒載體pACYCDuet會降低基因復(fù)制速度,從而降低EkF8DT折疊時的錯誤率,提高EkF8DT的可溶性表達(dá)量。同時對于異戊烯基轉(zhuǎn)移酶膜蛋白來說,中高拷貝質(zhì)粒載體使得其表達(dá)量增高,更易錨定于細(xì)胞膜上導(dǎo)致其活性降低,并影響菌株的生長,無法更好地行使其催化功能。

ZHANG等[24]研究發(fā)現(xiàn)Scck受質(zhì)?？截悢?shù)的影響較為顯著,高拷貝的質(zhì)粒pRSFDuet更適合該基因在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用,因此,將IUP途徑上的3個基因idi、Scck和Atipk共同構(gòu)建到質(zhì)粒載體pRSFDuet上,將其和pACYCDuet-SUMOEkF8DT60共同轉(zhuǎn)入E.coliBL21中,得到菌株EI20,結(jié)果顯示,8-pk產(chǎn)量僅3.60 mg/L。

2.5 8-pk合成過程的優(yōu)化

在發(fā)酵過程中,誘導(dǎo)溫度是影響細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)的重要因素,尤其是對膜蛋白來說,在較高溫度誘導(dǎo)表達(dá),微生物生長速度較快,酶的合成速度也隨之較快,容易形成包涵體。反之,降低誘導(dǎo)溫度,有利于酶的正確折疊,但是細(xì)胞生長可能受影響。對菌株EI12進(jìn)行發(fā)酵溫度優(yōu)化,在不同的誘導(dǎo)溫度下(16、20、25、30 ℃)發(fā)酵36 h,檢驗8-pk產(chǎn)量,結(jié)果如圖7-a所示,在誘導(dǎo)溫度為25 ℃時,菌株EI12發(fā)酵生產(chǎn)8-pk的產(chǎn)量最高,為21.5 mg/L,是16、20和30 ℃發(fā)酵條件下8-pk產(chǎn)量的2.82、1.55和1.6倍。說明誘導(dǎo)EkF8DT表達(dá)的最適溫度為25 ℃。

a-誘導(dǎo)溫度;b-IPTG濃度;c-誘導(dǎo)時機;d-底物濃度

T7啟動子的表達(dá)系統(tǒng)利用IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá),但較高濃度的IPTG對細(xì)胞生長有負(fù)面影響[25]。在250 mL搖瓶中培養(yǎng)菌株EI12至OD600=0.6～0.8時,分別加入終濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L的IPTG,以測試不同IPTG濃度對發(fā)酵生產(chǎn)的影響。結(jié)果如圖7-b所示,當(dāng)IPTG終濃度為0.20 mmol/L時,8-pk的積累量是當(dāng)IPTG終濃度為0.05、0.10、0.15、0.25 mmol/L時的5.12、2.7、1.6、1.3倍。導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是低濃度的IPTG會導(dǎo)致誘導(dǎo)不完全,蛋白表達(dá)量不夠高,影響了8-pk的合成。而過高濃度的IPTG會使得轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行的較快,增加了蛋白折疊的錯誤率,催化能力降低,從而影響8-pk的合成。

將種子液按照2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于裝有25 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,分別在OD600為0.3、0.6、0.9、1.2和1.5時加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG,來驗證不同的誘導(dǎo)時機對8-pk合成的影響。結(jié)果如圖7-c所示,在OD600為0.9時加誘導(dǎo)劑8-pk的產(chǎn)量最高,為21.54 mg/L,是OD600為0.3、0.6、1.2、1.5時添加IPTG的3.9、1.4、1.2、1.9倍。

類黃酮使得E.coli的形態(tài)產(chǎn)生變化,損害細(xì)胞膜[26]。為確定最佳底物濃度,在添加IPTG 10 h后分別添加50、100、150、200、250 mg/L的Kae。結(jié)果如圖7-d所示,底物最適質(zhì)量濃度為150 mg/L,8-pk產(chǎn)量進(jìn)一步提高至24.28 mg/L。

2.6 5-L發(fā)酵罐發(fā)酵8-pk水平驗證

使用5 L發(fā)酵罐對生產(chǎn)菌株進(jìn)行驗證,探究其合成8-pk的最大潛力。進(jìn)行流加補料發(fā)酵,接種5 h后開始流加補料,補料速度為5 mL/h,共補料500 mL。在OD600=29時添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)8 h后添加終質(zhì)量濃度為250 mg/L的Kae溶液和終濃度為25 mmol/L的3-甲基-3-丁烯-1-醇溶液。結(jié)果如圖8所示,發(fā)酵108 h后,8-pk的產(chǎn)量達(dá)到44.33 mg/L。

圖8 5 L發(fā)酵罐中EI12菌株生物合成8-pk的過程

3 討論

8-pk是一種具有高附加值的異戊烯基黃酮類化合物,其應(yīng)用價值近年來逐漸被挖掘[27]。隨著國家雙碳戰(zhàn)略的提出,綠色生物合成在8-pk合成中展現(xiàn)出極好的應(yīng)用前景。關(guān)于8-pk合成的相關(guān)文獻(xiàn)報道較少,植物來源的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶至少存在7個跨膜結(jié)構(gòu)域,使其難以進(jìn)行可溶性表達(dá),以及DMAPP供應(yīng)不足,這都是限制8-pk產(chǎn)量提高的障礙。MEP途徑合成DMAPP有許多限制因素,例如G3P和丙酮酸供應(yīng)的不平衡[28]和鐵硫酶IspG和IspH對氧敏感而容易失活等問題[29],且MEP途徑因需要輔因子的參與會與其他途徑競爭資源,這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)使得該途徑提高DMAPP供應(yīng)存在很多阻礙。因此,選擇引入代謝途徑更為簡短且高效的IUP途徑,可解決在E.coli中MEP途徑所生產(chǎn)的DMAPP供應(yīng)不足的問題。針對異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是膜蛋白具有定位信號肽的問題,我們采取了N端氨基酸截短的方式來解決。通過在線網(wǎng)站預(yù)測了信號肽位置和EkF8DT的二級結(jié)構(gòu),并根據(jù)預(yù)測的結(jié)構(gòu)選取了8個代表性的位點進(jìn)行截短。發(fā)現(xiàn)不同位置的截短會對8-pk合成產(chǎn)生不同效果,相比于根據(jù)預(yù)測信號肽的位置進(jìn)行截短,根據(jù)AlphaFold2所預(yù)測的酶的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行截短具有更高的可信度。因此,根據(jù)酶的二級結(jié)構(gòu)選擇位點截短并尋找規(guī)律,來細(xì)化截短的位置是最好的選擇。最后,通過融合表達(dá)蛋白質(zhì)標(biāo)簽、優(yōu)化質(zhì)?？截悢?shù)和優(yōu)化發(fā)酵條件,8-pk在5 L發(fā)酵罐的產(chǎn)量達(dá)到44.33 mg/L,本研究為細(xì)菌中8-pk的高效生物合成提供了一定的參考。鑒于異戊烯基轉(zhuǎn)移酶具有較高的底物特異性,后期研究中通過篩選不同的酶,并結(jié)合本研究的策略可以有效地提高異戊烯基化的類黃酮類化合物的合成。